一種卵母細胞激活的物理方法及其受精潛能的評價指標與流程

技術領域：

本發明涉及胚胎工程領域，特別涉及輔助生殖領域中一種卵母細胞激活的物理方法，以及一種評價精子或人工輔助方法激活卵母細胞時其受精潛能的評價指標。

技術背景

如今，全球約有10％-16％的夫婦面臨著不孕不育的問題。盡管輔助生殖技術的誕生已經幫助了許多不孕不育的患者，但是受精失敗的現象依然普遍存在。在輔助生殖領域中，卵母細胞單精子顯微注射技術(intracytoplasmicsperminjection,icsi)的應用最為廣泛，它借助顯微鏡操作系統，人工地將單一的精子注射到卵母細胞內使其受精，可以使受精率明顯提高到70％。但是任然有相當一部分患者在進行icsi后無法受精，研究發現由于精子自身存在缺陷而導致的卵母細胞激活不足是icsi受精失敗的主要原因。

所謂的卵母細胞激活，就是指在成熟促進因子(m-phasepromotingfactor,mpf)保持穩定的作用下，哺乳動物成熟的卵母細胞會發育并停留在減數第二次分裂中期，既mii期，只有在精子或人工方式的刺激下，卵母細胞才能恢復并完成減數分裂，這個過程被稱為卵母細胞的激活。

精子刺激卵母細胞后，會引起卵母細胞發生一系列形態上和生理上的反應，主要包括細胞內鈣濃度短暫性的升高以及隨后發生的鈣振蕩、第二極體釋放、形成雌、雄雙原核等等。其中，細胞內鈣離子濃度的升高和鈣振蕩的形成，不僅被認為是誘導激活后一系列反應的必要因素，更是接下來胚胎發育的重要環節。并且鈣振蕩的頻率、振幅、持續時間等，都會影響著細胞周期的進程以及早期胚胎發育過程中蛋白質的表達

為了解決icsi受精失敗的問題，現在通常會采用人工激活的方式來幫助精子刺激卵母細胞，從而誘導卵母細胞內ca2+濃度脈沖式的升高或者ca2+振蕩來實現激活。其中，卵母細胞激活率、囊胚率和能否誘導鈣離子振蕩是人們主要關注的問題。目前人工激活卵母細胞的方法主要有：化學激活法、電學激活法、機械激活法，在化學法中最常用的激活試劑包括乙醇、鈣離子載體a23187、離子霉素、鍶離子等等。

這些方法能在一定程度上提高卵母細胞的激活效率，但其中化學法和機械法的操作復雜、重復性差、且激活效率和胚胎發育潛能還有待提高。而傳統的電學激活方法能量過大，容易對細胞產生損傷。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種操作簡便、高效可控的卵母細胞激活方法，可提高卵母細胞的激活效率和胚胎發育潛能，以及提供一種評價精子或人工方式刺激卵母細胞后其受精潛能的評價指標，為輔助生殖中胚胎移植提供理論依據。

為實現以上技術效果，本發明采用以下的技術方案：

本發明是基于納秒級脈寬的脈沖電場能誘導卵母細胞出現鈣離子振蕩的現象，用胞漿內鈣離子濃度變化所形成的鈣振蕩的特征作為卵母細胞受精潛能的評價指標。

上述的卵母細胞激活方法，首先將卵母細胞及卵母細胞培養液htf置于電極杯后施加電脈沖序列進行處理，將處理后的卵母細胞經培養液洗滌2-4次，移入36-37℃、5-10％co2的培養箱中連續培養7-8天。

優選地，先用電場強度為35kv/cm-50kv/cm，脈沖頻率為0.5hz-1.5hz，脈沖寬度為30ns-300ns的脈沖作用3-10秒，緊接著用電場強度為5kv/cm-35kv/cm，脈沖頻率為0.5hz-1.5hz，脈沖寬度為10ns-30ns的脈沖作用3-5秒。

上述的卵母細胞受精潛能的評價指標，其特征在于：用卵母細胞胞漿內鈣離子濃度變化所形成鈣振蕩的特征作為評價卵母細胞受精潛能的指標。

上述的卵母細胞受精潛能的評價指標，其特征在于：將經過前處理激活后的卵母細胞用鈣離子探針染色，置于共聚焦顯微鏡下，檢測胞漿內鈣離子濃度隨時間的變化。

上述的卵母細胞受精潛能度的評價指標，其特征在于：將鈣離子濃度峰值30％處上升到峰值所需要的時間與從峰值下降到峰值30％處所需時間之比作為卵母細胞受精潛能的指標；鈣振蕩衰減因子如下，用于反映有效囊胚率：

其中：n為超過閾值的鈣峰個數，閾值為最大鈣離子濃度的70％，t為共聚焦顯微鏡的掃描時間；定義鈣峰個數大于等于10時，有效囊胚率為100％。

雖然本發明已以較佳實施例披露如上，然而并非用以限定本發明。任何熟悉本領域的技術人員，在不脫離本發明技術方案范圍情況下，都可利用上述揭示的方法和技術內容對本發明技術方案作出許多可能的變動和修飾，或修改為等同變化的等效實施例。因此，凡是未脫離本發明技術方案的內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所做的任何簡單修改、等同變化及修飾，均仍屬于本發明技術方案保護的范圍內。

附圖說明：

圖1為兔卵母細胞激活的操作流程圖

圖2為電脈沖序列刺激后，小鼠卵母細胞內鈣離子振蕩圖

圖3為鈣離子載體a23187刺激小鼠卵母細胞后引起的鈣離子濃度變化圖

圖4為7％乙醇刺激小鼠卵母細胞后引起的鈣離子濃度變化圖

圖5為正常精子刺激小鼠卵母細胞后引起的鈣離子濃度變化圖

具體實施方法

以下通過實施例對本發明進行進一步說明，當然本發明的實施范圍并不僅限于下述的范圍。

實施例一：激活兔卵母細胞

1.實驗動物

6-15月齡，體重為2.5-3.5kg的性成熟期雌性日本大耳兔，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。

2.實驗試劑

孕馬血清(pmsgsigma)

人絨毛膜促性腺激素(hcgsigma)

血漿替代品(sssirvinescientific)

透明質酸酶(sigma)

改良的人類輸卵管液(mhtfirvinescientific)

人類輸卵管液(htfirvinescientific)

3.卵母細胞準備和培養

先用碘酒棉球消毒母兔頸部皮膚，于頸部皮下一次注射pmsg(150iu/只)。48h后，用酒精棉球消毒耳朵邊緣，從耳靜脈注射hcg(75iu/只)進行超促排卵。注射hcg24h后，采用耳靜脈注射10ml空氣處死母兔。

將兔子背部朝下固定在手術臺上，刮掉腹部中線兔毛并消毒后，用手術刀在腹部中線處皮膚切開2-3cm長的術口，打開腹腔后沿著子宮輕輕引出輸卵管及卵巢。在卵巢附近找到輸卵管傘，從傘部插入導卵管并固定，導卵管的另一端接培養皿。用10ml的注射器吸入含5％sss的mhtf培養液作為沖卵液，注射器針頭伸入輸卵管后慢慢推動注射器，將沖卵液注入輸卵管內，并由傘部的導卵管收集到培養皿中。

在顯微鏡下觀察沖卵液中的卵母細胞，并采用80iu/ml透明質酸霉消化卵母細胞周圍的顆粒細胞，將卵母細胞分散后再經含10％sss的htf培養液洗滌5次，最后移入htf培養液中培養(37℃，飽和濕度，5％co2)，以待激活處理。

4.卵母細胞激活

將卵母細胞及適量的htf培養液移入電極杯中，電極杯置于電脈沖序列發生器中。打開發生器的電源，此時脈沖電場會對電極杯內的卵母細胞施加電脈沖刺激。

在本實施例中，先用電場強度為50kv/cm，脈沖頻率為1.5hz，脈沖寬度為300ns的脈沖作用3秒，再用電場強度為30kv/cm，脈沖頻率為1.0hz，脈沖寬度為10ns的脈沖作用3秒。電極杯中兩電極的間距為4mm。

將電場處理過的卵母細胞及htf培養液從電極杯中吸出，轉移至培養皿中，放置于培養箱中培養(37℃，飽和濕度，5％co2)。15-24h后統計卵母細胞激活率，之后連續7-8天記錄胚胎發育狀況

在本實施例中，兔卵母細胞激活率可達到80％，囊胚率可達到37.5％。

實施例二：誘導小鼠卵母細胞內鈣離子振蕩

1.實驗動物

6-8周齡的性成熟期雌性昆明小鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。

2.實驗試劑

孕馬血清(pmsgsigma)

人絨毛膜促性腺激素(hcgsigma)

血漿替代品(sssirvinescientific)

透明質酸酶(sigma)

改良的人類輸卵管液(mhtfirvinescientific)

人類輸卵管液(htfirvinescientific)

fluo-4am/鈣離子熒光探針(dojindolaboratories)

3.卵母細胞準備和培養

對雌性小鼠腹腔注射pmsg(10iu/只小鼠)，48h后腹腔注射hcg(10iu/只)進行超促排卵。注射hcg15-19h后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，在無菌條件下暴露、取出輸卵管。在含5％sss的mhtf培養液中劃破輸卵管壺腹部膨大部位，將卵丘-卵母細胞復合體輕輕擠出。采用80iu/ml透明質酸霉消化卵母細胞周圍的顆粒細胞，將卵母細胞分散后再經含10％sss的htf培養液洗滌5次，移入htf培養液中。再按1：1的比例加入fluo4-am鈣離子探針后，培養15分鐘(37℃，飽和濕度，5％co2)，以待激活處理

4.鈣離子振蕩檢測

將卵母細胞及適量的htf與fluo4-am混合液(1：1)移入電極杯中，電極杯置于電脈沖序列發生器中。打開發生器的電源，此時脈沖電場會對電極杯內的卵母細胞施加電脈沖刺激。

在本實施例中，先用電場強度為40kv/cm，脈沖頻率為1.0hz，脈沖寬度為80ns的脈沖作用10秒，再用電場強度為15kv/cm，脈沖頻率為1.0hz，脈沖寬度為10ns的脈沖作用5秒。電極杯中兩電極的間距為4mm。

將電場處理過的卵母細胞及與fluo4-am混合液從電極杯中吸出，轉移至共聚焦培養皿中，放置于共聚焦顯微鏡(nikona1)下連續掃描2h，檢測鈣離子濃度在細胞內的變化。

實施例三：評價a23187激活小鼠卵母細胞的受精潛能

1.實驗動物

6-8周齡的性成熟期雌性昆明小鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。

2.實驗試劑

孕馬血清(pmsgsigma)

人絨毛膜促性腺激素(hcgsigma)

血漿替代品(sssirvinescientific)

透明質酸酶(sigma)

改良的人類輸卵管液(mhtfirvinescientific)

人類輸卵管液(htfirvinescientific)

fluo-4am/鈣離子熒光探針(dojindolaboratories)

鈣離子載體a23187(a23187sigma)

3.卵母細胞準備

對雌性小鼠腹腔注射pmsg(10iu/只小鼠)，48h后腹腔注射hcg(10iu/只)進行超促排卵。注射hcg15-19h后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，在無菌條件下暴露、取出輸卵管。在含5％sss的mhtf培養液中劃破輸卵管壺腹部膨大部位，將卵丘-卵母細胞復合體輕輕擠出。采用80iu/ml透明質酸霉消化卵母細胞周圍的顆粒細胞，將卵母細胞分散后再經含10％sss的htf培養液洗滌5次，移入htf培養液中。

4.卵母細胞激活

將卵母細胞置于含10μma23187的mhtf液中，37℃避光處理5min，經mhtf洗滌5次后，再置于含10％sss的htf液中繼續培養4h。

5.檢測鈣離子濃度變化

按1：1的比例在含有卵母細胞的10％sss的htf液中加入fluo4-am鈣離子探針，培養15分鐘(37℃，飽和濕度，5％co2)。之后將卵母細胞轉移至共聚焦培養皿中，放置于共聚焦顯微鏡(nikona1)下連續掃描2h，檢測鈣離子濃度在細胞內的變化。

當鈣離子濃度峰值30％處上升到峰值所需要的時間與從峰值下降到峰值30％處所需時間之比作大于0.50時，認為激活效果良好，且上升時間與下降時間之比越接近于1則激活效果越好。

在本實施例中，上升時間與下降時間之比約為0.54，有效囊胚率為0％。因此a23187激活卵母細胞效果良好，但激活后的卵母細胞很大程度上無法發育成囊胚。

實施例四：評價乙醇激活小鼠卵母細胞的受精潛能

1.實驗動物

6-8周齡的性成熟期雌性昆明小鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。

2.實驗試劑

孕馬血清(pmsgsigma)

人絨毛膜促性腺激素(hcgsigma)

血漿替代品(sssirvinescientific)

透明質酸酶(sigma)

改良的人類輸卵管液(mhtfirvinescientific)

人類輸卵管液(htfirvinescientific)

fluo-4am/鈣離子熒光探針(dojindolaboratories)

7％乙醇(用htf培養液將無水乙醇稀釋到7％)

3.卵母細胞準備

對雌性小鼠腹腔注射pmsg(10iu/只小鼠)，48h后腹腔注射hcg(10iu/只)進行超促排卵。注射hcg15-19h后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，在無菌條件下暴露、取出輸卵管。在含5％sss的mhtf培養液中劃破輸卵管壺腹部膨大部位，將卵丘-卵母細胞復合體輕輕擠出。采用80iu/ml透明質酸霉消化卵母細胞周圍的顆粒細胞，將卵母細胞分散后再經含10％sss的htf培養液洗滌5次，移入htf培養液中。

4.卵母細胞激活

將卵母細胞置于含7％乙醇的mhtf液，37℃處理5min，經mhtf洗滌5次后，再置于含10％sss的htf液中繼續培養4h

5.檢測鈣離子濃度變化

按1：1的比例在含有卵母細胞的10％sss的htf液中加入fluo4-am鈣離子探針，培養15分鐘(37℃，飽和濕度，5％co2)。之后將卵母細胞轉移至共聚焦培養皿中，放置于共聚焦顯微鏡(nikona1)下連續掃描2h，檢測鈣離子濃度在細胞內的變化。

當鈣離子濃度峰值30％處上升到峰值所需要的時間與從峰值下降到峰值30％處所需時間之比作大于0.50時，認為激活效果良好，且上升時間與下降時間之比越接近于1則激活效果越好。

在本實施例中，上升時間與下降時間之比約為0.11，有效囊胚率為0％。因此7％乙醇雖然可以激活卵母細胞，但激活效果不好，且卵母細胞激活后無法發育成囊胚。

實施例五：評價正常精子激活小鼠卵母細胞的受精潛能

1.實驗動物

6-8周齡的性成熟期雌性與雄性昆明小鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。

2.實驗試劑

孕馬血清(pmsgsigma)

人絨毛膜促性腺激素(hcgsigma)

血漿替代品(sssirvinescientific)

透明質酸酶(sigma)

改良的人類輸卵管液(mhtfirvinescientific)

人類輸卵管液(htfirvinescientific)

fluo-4am/鈣離子熒光探針(dojindolaboratories)

3.卵母細胞準備

對雌性小鼠腹腔注射pmsg(10iu/只小鼠)，48h后腹腔注射hcg(10iu/只)進行超促排卵。注射hcg15-19h后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，在無菌條件下暴露、取出輸卵管。在含5％sss的mhtf培養液中劃破輸卵管壺腹部膨大部位，將卵丘-卵母細胞復合體輕輕擠出。采用80iu/ml透明質酸霉消化卵母細胞周圍的顆粒細胞，將卵母細胞分散后再經含10％sss的htf培養液洗滌5次，移入htf培養液中。

4.精子準備

采用頸椎脫臼法處死雄性小鼠，在無菌條件下暴露、取出輸精管。在含5％sss的mhtf培養液中劃破輸精管，將精子輕輕擠出。經含10％sss的htf培養液洗滌5次，移入含有卵母細胞的htf培養液中5.檢測鈣離子濃度變化

按1：1的比例在含有卵母細胞和精子的10％sss的htf液中加入fluo4-am鈣離子探針，培養15分鐘(37℃，飽和濕度，5％co2)。之后將卵母細胞轉移至共聚焦培養皿中，放置于共聚焦顯微鏡(nikona1)下連續掃描2h，檢測鈣離子濃度在細胞內的變化。

當鈣離子濃度峰值30％處上升到峰值所需要的時間與從峰值下降到峰值30％處所需時間之比作大于0.50時，認為激活效果良好，且上升時間與下降時間之比越接近于1則激活效果越好。

在本實施例中，上升時間與下降時間之比約為0.92，有效囊胚率為66.7％。因此認為正常精子激活卵母細胞的效果很好，且卵母細胞激活后很大程度上可以發育成囊胚。