一類可用于次氯酸檢測的熒光探針及其制備方法和應用與流程

本發明屬于分析化學技術領域，具體涉及到一類可用于次氯酸檢測的熒光探針及其制備方法和應用。

背景技術：

次氯酸(hocl)是一種具有較強氧化性的活性氧,在生物體內由氯離子和過氧化氫在髓過氧化物酶(mpo)的作用下生成。次氯酸是嗜中性粒細胞生產的最強的氧化殺菌物質，可以參與多種類型有害菌的清除過程。但是過量的次氯酸則會對機體產生危害，能夠引起氧化應激,導致許多疾病如動脈粥樣硬化和心血管疾病等。因此，監測生命系統尤其是活體中次氯酸濃度的變化以及分布具有十分重要的意義。

用于選擇性檢測次氯酸的方法有很多，其中熒光探針因其具有選擇性和靈敏度高、響應時間快以及檢測所需的儀器相對簡單等優勢已經引起了人們越來越多的關注。其中與次氯酸在響應前后具有明顯顏色變化的熒光探針在活體檢測過程中能夠更直觀的反應次氯酸濃度的變化及分布，因而具有更大的應用空間。然而當前還沒有在活體層次與次氯酸響應后可以觀察到明顯顏色變化的次氯酸熒光探針被報道出來，因此開發這類探針具有十分重要的意義。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一類新的可用于次氯酸檢測的熒光探針，以及提供該類熒光探針的制備方法和其在溶液以及活體成像中的應用。

本發明涉及一類可用于次氯酸檢測的熒光探針，該類熒光探針具有式ι所示的結構：

其中：(1)z為o或s；

(2)r1、r4、r5、r6、r7和r10可以各自獨立地選自氫原子、鹵素或烷基；

(3)r2、r3、r8和r9可以各自獨立地選自氫原子、未取代的烷基、苯基取代的烷基、烷氧基或羥烷氧基，所述的苯基包括未取代的或被1個或者多個鹵素、烷氧基、飽和氨基、烷基取代；或-nr2r3和-nr8r9基團可以相互獨立的表示飽和或者不飽和的雜環，其中所述的雜環可以包含一個或者多個選自n、o、s的另外的雜原子，所述的雜環為未取代的或被鹵素和烷基的基團取代；

(5)r11可以選自氫原子、烷基(未被完全取代)、氨基或者被烷基取代的氨基；

(6)本發明中所述的鹵素選自氟、氯、溴和碘原子。所述的烷基是指飽和的烷烴，包括直鏈或具有支鏈的，例如：甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、異丙基和叔丁基。

本發明涉及具有式ι結構化合物的制備方法，如下：

上述路線的具體步驟如下：

(1)中間體b的制備

將化合物a和堿溶解后，滴加還原劑，得到中間體b，不需分離，可直接進入下一步反應。所述的堿選自各種有機堿和無機堿，優選碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸銫。所述的還原劑選自連二亞硫酸鈉、維生素c、硫酸亞鐵銨，優選連二亞硫酸鈉。溶劑優選二氯甲烷和水的混合體系，反應溫度20-80℃，優選40℃。

(2)化合物i的制備

a、當r11選取氫原子時

將堿、4-二甲氨基吡啶(dmap)和維爾斯邁爾-哈克甲酰化試劑(vilsmeyer-haackreagent)溶于溶劑中，滴加化合物b，反應得到化合物i。所述的堿選自各種有機堿和無機堿，優選碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸銫。溶劑優選二氯甲烷，反應溫度-10-20℃，優選0℃。

b、當r11選取烷基(未被完全取代)時

將堿、dmap和烷基或者未被完全取代的烷基對應的酰氯溶于溶劑中，滴加化合物b，反應得到化合物i。所述的堿選自各種有機堿和無機堿，優選碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸銫。溶劑優選二氯甲烷，反應溫度-10-20℃，優選0℃。

c、當r11選取氨基或者取代的氨基衍生物時

向含有化合物b的反應體系中加入三光氣，制備中間體c，中間體c可以不經純化，直接用于下步反應。

將堿、dmap和氨水或者取代的氨基衍生物溶于溶劑中，滴加化合物c，反應得到化合物i。所述的堿選自各種有機堿和無機堿，優選碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸銫。溶劑優選二氯甲烷，反應溫度-10-20℃，優選0℃。本發明涉及具有式ι結構化合物與次氯酸具有如下所示的響應機理

具有式ι結構的化合物本身沒有熒光，與次氯酸響應后會先生成中間體b，然后再進一步被次氯酸氧化生成具有強熒光發射的化合物a。

本發明涉及具有式ι結構的熒光探針在溶液以及動物活體層次的應用。

檢測溶液的制備與檢測步驟如下：

(1)將式ι化合物溶解于有機溶劑(如甲醇、乙醇、n,n-二甲基甲酰胺)中，然后稀釋到緩沖溶劑中用于溶液中次氯酸的檢測；

(2)將式ι化合物溶解于有機溶劑(如甲醇、乙醇、n,n-二甲基甲酰胺)中，然后注射到動物的活體模型中用于動物層次次氯酸的檢測。

本發明的效果表現在：

(1)本發明首次提出次氯酸誘導的脫甲酰化反應，并應用到次氯酸的檢測中。

(2)式ι化合物對次氯酸具有優異的選擇性，對其它常見的活性氧/活性氮不響應。

(3)式ι化合物對次氯酸響應后可以通過肉眼識別，不需要復雜的儀器。

(4)式ι化合物可以在活體層次對次氯酸進行識別，并能觀察到明顯的顏色變化。

附圖說明

圖1為本發明熒光探針分子與次氯酸的響應機理示意圖。

圖2為本發明涉及的實施例1所述的熒光探針fdocl-1的¹hnmr譜圖。

圖3為本發明涉及的實施例1所述的熒光探針fdocl-1的¹³cnmr譜圖。

圖4為本發明涉及的實施例1所述的熒光探針fdocl-1與次氯酸響應前后的熒光譜圖。fdocl-1的濃度為10μm，次氯酸的的濃度為25μm激發波長為620nm。

圖5為本發明涉及的實施例1所述的熒光探針fdocl-1的選擇性熒光譜圖。fdocl-1的濃度為10μm，ros/rns和次氯酸采用圖中所示的不同濃度。比較的ros/rns從a到h分別為：h2o2,o2^-,t-buooh,^·oh,no^·,onoo^-,roo^·,t-buoo^·。比較的為686nm處的熒光強度，激發波長為620nm。

圖6為本發明涉及的熒光探針fdocl-1在小鼠活體中的成像圖。

圖7為本發明涉及的實施例2所述的熒光探針fdocl-2與次氯酸響應的時間依賴圖。fdocl-2的濃度為10μm，次氯酸的的濃度為25μm激發波長為620nm。

圖8為本發明涉及的實施例3所述的熒光探針fdocl-3與次氯酸響應后的熒光譜圖。fdocl-3的濃度為10μm，次氯酸的的濃度為25μm激發波長為620nm。

圖9為本發明涉及的實施例4所述的熒光探針fdocl-4的熒光譜圖。可以觀測到激發波長為620nm時，體系中在686nm處的熒光強度隨著時間的推移沒有發生顯著的增強，表明r11為該類化合物時不能與次氯酸響應。圖中a到e分別代表10μmfdocl-4(a)；10μmfdocl-4+100μmnaocl然后分別響應30分鐘(b),60分鐘(c),120分鐘(d)；以及10μmfdocl-1+10μmnaocl響應30秒(e)。

具體實施方式

實施例1

具有式ι結構的化合物fdocl-1(r11為氫)的制備以及與次氯酸的響應性能研究：

(1)vilsmeyer-haackreagent的制備

將二甲基甲酰胺(4.6g,62.52mmol)溶解在20ml二氯甲烷中，室溫下滴加用10ml二氯甲烷稀釋的氯化亞砜(7.44g,62.52mmol)，滴畢后在60℃攪拌反應15分鐘，反應完畢后直接蒸干溶劑，得到的維爾斯邁爾-哈克甲酰化試劑直接用于下步反應。

(2)fdocl-1的制備

在三頸燒瓶中加入亞甲基藍(5.0g，15.63mmol)用30ml二氯甲烷和40ml水溶解。向體系中加入碳酸鈉(6.63g，62.52mmol)將體系置于40℃下攪拌，氮氣保護后向體系中滴加用20ml水溶解的連二亞硫酸鈉(8.16g,46.89mmol)。加畢后反應20min，此時體系發生明顯的分層，下層為黃色溶液。將體系靜置，分層后用注射器吸出下層清夜，滴入混有維爾斯邁爾-哈克甲酰化試劑(實施例1中制備)、4-二甲氨基吡啶(1.91g，15.63mmol)、碳酸鈉(4.97g，46.89mmol)以及30ml二氯甲烷的混合體系中，滴加過程中體系在冰水浴下攪拌反應，滴畢后轉移至室溫下攪拌反應，tlc指示反應，通常4h左右體系不在有變化，反應完畢。

過濾，除去體系中的不溶物，將濾液傾入冰水中，用乙酸乙酯(200ml×4)萃取。合并有機相，用300ml×3飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。在旋轉蒸發器上蒸除溶劑，剩余物用硅膠柱層析純化，得到2.2g白色固體產物fdocl-1，收率45％(以亞甲基藍為參比計算)。¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.52(s,1h),7.42(d,j＝8.4hz,1h),7.29(d,j＝8.8hz,1h),6.75(d,j＝2.8hz,1h),6.76-6.66(m,3h),2.90(s,12h).

¹³cnmr(100mhz,dmso)δ160.97,149.11,148.84,130.23,129.47,126.64,125.66,124.53,122.70,111.21,110.54,110.11,109.64,40.19.

(3)次氯酸熒光探針化合物的性能實驗

a、fdocl-1對次氯酸的檢測

如圖4所示，10μm的fdocl-1緩沖溶液(10mmpbs，ph＝7.2,1％乙醇)體系是沒有熒光的。但在加入25μm次氯酸后fdocl-1有強烈的熒光響應，在686nm處的熒光強度增加了超過2800倍。

b、fdocl-1的選擇性

如圖5所示，即使體系中的次氯酸濃度只有1μm也能引起fdocl-1強烈的熒光響應，而其它不同濃度的ros/rns例如h2o2,o2^-,t-buooh,·oh,no·,onoo-,roo·,t-buoo·則均不能造成fdocl-1熒光強度的變化，表明fdocl-1具備優良的選擇性。

c、fdocl-1在小鼠活體中的應用

如圖6所示，使用角叉菜膠在小鼠的右側腳踝處構建炎癥反應模型，兩側同時注射100μl，1mm的fdocl-1后，可以觀測到炎癥部位直接變為藍色，而正常的腳踝處沒有顏色變化。表明探針在識別前后發生明顯的顏色變化可以在活體中應用。

實施例2

具有式ι結構的化合物fdocl-2(r11為取代的氨基)的制備以及與次氯酸的響應性能研究

(1)化合物的制備

在三頸燒瓶中加入亞甲基藍(2.0g，6.25mmol)用15ml二氯甲烷和40ml水溶解。向體系中加入碳酸鈉(2.65g，25.00mmol)將體系置于40℃下攪拌，氮氣保護后向體系中滴加用20ml水溶解的連二亞硫酸鈉(3.26g,18.75mmol)。加畢后反應20min，此時體系發生明顯的分層，下層為黃色溶液。將體系靜置，然后向體系中滴加10ml二氯甲烷溶解的三光氣(0.93g，3.13mmol)滴畢后轉移至室溫下攪拌反應1h。將體系靜置，分層后用注射器吸出下層清夜，滴入混有2ml二甲胺、4-二甲氨基吡啶(0.76g，6.25mmol)、碳酸鈉(1.99g，18.75mmol)以及20ml二氯甲烷的混合體系中，滴加過程中體系在冰水浴下攪拌反應，滴畢后轉移至室溫下攪拌反應，tlc指示反應直到反應完畢。

過濾，除去體系中的不溶物，將濾液傾入冰水中，用乙酸乙酯(100ml×4)萃取。合并有機相，用200ml×3飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。在旋轉蒸發器上蒸除溶劑，剩余物用硅膠柱層析純化，得到0.67g白色固體產物fdocl-2，收率30％(以亞甲基藍為參比計算)。¹hnmr(400mhz,dmso)δ7.42(d,j＝8.8hz,2h),6.68(d,j＝2.8hz,2h),6.63(dd,j＝8.8,2.8hz,2h),2.86(s,12h),2.64(s,6h).

(2)化合物與次氯酸的響應行為測試

如圖7所示，向濃度為10μm的fdocl-2水溶液中加入25μm的naocl時可以觀測到體系中在686nm處的熒光強度隨著時間的推移發生顯著的增強。

實施例3

具有式ι結構的化合物fdocl-3(r11為烷基)的制備以及與次氯酸的響應性能研究

(1)目標化合物的制備

在三頸燒瓶中加入亞甲基藍(2.0g，6.25mmol)用15ml二氯甲烷和40ml水溶解。向體系中加入碳酸鈉(2.65g，25.00mmol)將體系置于40℃下攪拌，氮氣保護后向體系中滴加用20ml水溶解的連二亞硫酸鈉(3.26g,18.75mmol)。加畢后反應20min，此時體系發生明顯的分層，下層為黃色溶液。將體系靜置，分層后用注射器吸出下層清夜，加入4-二甲氨基吡啶(0.76g，6.25mmol)、碳酸鈉(1.99g，18.75mmol)以及20ml二氯甲烷的混合體系中，冰水浴下攪拌下向體系滴加用10ml二氯甲烷溶解的乙酰氯(1.47g，18.75mmol)，滴畢后轉移至室溫下攪拌反應，tlc指示反應直到反應完畢。

過濾，除去體系中的不溶物，將濾液傾入冰水中，用乙酸乙酯(100ml×4)萃取。合并有機相，用200ml×3飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。在旋轉蒸發器上蒸除溶劑，剩余物用硅膠柱層析純化，得到0.72g白色固體產物fdocl-3，收率35％(以亞甲基藍為參比計算)。¹hnmr(400mhz,cd3cn)δ7.29(d,j＝8.8hz,2h),6.77(d,j＝2.4hz,2h),6.68(dd,j＝9.2,2.8hz,2h),2.92(s,12h),2.05(s,3h).

(2)化合物與次氯酸的響應性能測試

如圖8所示，向濃度為10μm的fdocl-3水溶液中加入25μm的naocl時可以觀測到體系中的熒光強度發生顯著的增強。

實施例4

具有式ι結構的化合物fdocl-4(r11為烷氧基)的制備以及與次氯酸的響應性能研究，對比例。

(1)化合物的制備

在三頸燒瓶中加入亞甲基藍(2.0g，6.25mmol)用15ml二氯甲烷和40ml水溶解。向體系中加入碳酸鈉(2.65g，25.00mmol)將體系置于40℃下攪拌，氮氣保護后向體系中滴加用20ml水溶解的連二亞硫酸鈉(3.26g,18.75mmol)。加畢后反應20min，此時體系發生明顯的分層，下層為黃色溶液。將體系靜置，然后向體系中滴加10ml二氯甲烷溶解的三光氣(0.93g，3.13mmol)滴畢后轉移至室溫下攪拌反應1h。將體系靜置，分層后用注射器吸出下層清夜，滴入混有4-二甲氨基吡啶(0.76g，6.25mmol)、碳酸鈉(1.99g，18.75mmol)以及20ml甲醇的混合體系中，滴加過程中體系在冰水浴下攪拌反應，滴畢后轉移至室溫下攪拌反應，tlc指示反應直到反應完畢。

過濾，除去體系中的不溶物，將濾液傾入冰水中，用乙酸乙酯(100ml×4)萃取。合并有機相，用200ml×3飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。在旋轉蒸發器上蒸除溶劑，剩余物用硅膠柱層析純化，得到0.86g白色固體產物fdocl-4，收率40％(以亞甲基藍為參比計算)。¹hnmr(400mhz,dmso)δ7.30(d,j＝8.4hz,2h),6.68–6.65(m,4h),3.65(s,3h),2.89(s,12h).

(2)化合物與次氯酸的響應行為測試

如圖9所示，向濃度為10μm的fdocl-4水溶液中加入100μm的naocl時可以觀測到體系中在686nm處的熒光強度隨著時間的推移沒有發生顯著的增強，表明r11為該類化合物時不能與次氯酸響應。