一種發酵小分子透明質酸的重組獸疫鏈球菌的制作方法

本發明涉及一種發酵小分子透明質酸的重組獸疫鏈球菌，屬于生物工程技術領域。

背景技術：

透明質酸是一類高分子黏性聚多糖，當前主要以動物組織提取或微生物發酵法生產，它的生物學功能與其分子量大小密切相關，大分子透明質酸已廣泛應用于醫學領域和化妝品行業，小分子透明質酸寡糖具有獨特的生物學功能在保健和醫學領域具有重要的應用前景。

當前制備小分子透明質酸的方法主要集中于物理法和化學法。物理法包括加熱、超聲波和射線輻射等促使透明質酸隨機斷裂，雖過程簡單，但效率較低，產品穩定性較差。化學法主要為水解和氧化降解兩類，易引入化學試劑污染，反應條件復雜，不僅對透明質酸的性質產生影響，對純化造成困難，也會產生大量工業廢水。此外，也有報道采用從頭合成透明質酸寡糖，但該方法存在底物昂貴、步驟繁瑣、合成效率很低等諸多問題，難以實現寡糖的大量制備。

相比于以上方法，酶法催化降解是一種最具前途的方法，近幾年，微生物來源的透明質酸裂解酶實現了異源重組表達并用于體外酶法水解制備小分子透明質酸實驗，然而對其水解機制和產物分析發現，細菌裂解酶催化水解過程中采取連續的外切裂解模式，從還原端向非還原端逐一釋放出不飽和的雙糖單位直至一條鏈被完全降解，這種水解機制導致水解產物的分子量分布范圍廣，難以有效獲得分子量較集中的寡糖產物，特別是透明質酸的結構還發生了變化。此外，對商品化的牛睪丸透明質酸酶(bth)在體外進行透明質酸降解過程分析發現，終產物的分布范圍廣(從4-52個雙糖單位)，并且bth存在轉糖苷活性以至于難以獲得分子量比較單一的終產物，事實上，bth酶活較低、價格昂貴，而其它來源的透明質酸酶的重組表達水平均較低，都不適合于大量發酵生成，導致透明質酸寡糖的制備方法一直存在技術短板。

技術實現要素：

未解決現有技術存在的上述缺陷，本發明以獸疫鏈球菌為宿主，引入水蛭來源的透明質酸酶基因并進行分泌表達，由于宿主本身基因組上含有合成透明質酸的基因簇，并能產生大分子透明質酸，表達異源基因的重組菌在合成透明質酸并運輸至體外的同時不斷切割糖鏈形成小分子透明質酸寡糖，實現微生物發酵直接合成寡糖的效果。

本發明的第一個目的在于提供一種產透明質酸酶的重組獸疫鏈球菌，以peu308為表達載體，在獸疫鏈球菌中導入編碼來源于水蛭的透明質酸酶基因，誘導表達透明質酸酶。

在本發明的一種實施方式中，所述編碼透明質酸酶的基因為hyal，其序列為seqidno.1所示。

在本發明的一種實施方式中，所述表達載體上引入信號肽amyx，bpr，npre，oppa，vpr，wapa，yvgo，ywea，yxal中的任一種。

在本發明的一種實施方式中，以誘導型啟動子pspac啟動編碼透明質酸酶的基因的表達。

在本發明的一種實施方式中，所述獸疫鏈球菌為s.zooepidemicusatcc39920。

本發明的第二個目的是提供所述重組獸疫鏈球菌的構建方法，是以peu308為表達載體，在獸疫鏈球菌中導入編碼來源于水蛭的透明質酸酶基因，并將信號肽融合于透明質酸酶的n端，插入到表達載體的pspac啟動子和鏈球菌rbs序列之后。

在本發明的一種實施方式中，以誘導型啟動子pspac啟動編碼透明質酸酶的基因的表達。

在本發明的一種實施方式中，所述獸疫鏈球菌為s.zooepidemicusatcc39920。

本發明的第三個目的在于提供一種提高重組獸疫鏈球菌透明質酸酶活的方法，所述方法是在重組獸疫鏈球菌的表達載體上引入信號肽amyx，bpr，npre，oppa，vpr，wapa，yvgo，ywea，yxal中的任一種。

本發明的第四個目的是提供一種應用所述重組獸疫鏈球菌發酵生產小分子透明質酸的方法，所述方法是將重組獸疫鏈球菌接種至發酵培養基，在37℃發酵16-20h。

在本發明的一種實施方式中，碳源采用蔗糖，氮源采用酵母粉。

在本發明的一種實施方式中，發酵培養基配方為：蔗糖70g/l，酵母粉20g/l，磷酸氫二鈉6.2g/l，硫酸鎂2g/l，硫酸鉀1.3g/l，硫酸鐵5mg/l，微量元素液2.5ml/l；其中微量元素液含氯化鈣2g/l，硫酸錳24mg/l，氯化鋅46mg/l，硫酸銅19mg/l。種子培養基配方為：蔗糖20g/l，酵母粉10g/l，牛肉膏10g/l，硫酸鎂2g/l，硫酸錳0.1g/l，磷酸二氫鉀2g/l。

本發明還提供所述重組獸疫鏈球菌在食品、生物、化工、醫藥領域制備含小分子透明質酸的產品中的應用。

有益效果：本發明在獸疫鏈球菌中異源表達來源于水蛭的透明質酸酶，降解獸疫鏈球菌自身所產透明質酸，獲得小分子透明質酸，具有較大的應用優勢。首先，本發明選用獸疫鏈球菌作為表達宿主，其自身基因組上具有編碼透明質酸合酶的基因，適合發酵生產透明質酸；其次，利用多種信號肽分泌表達透明質酸酶，并通過比較其酶活，可獲得一株產酶最佳的重組菌，從而降解產生具有生物醫學活性的小分子透明質酸。本發明能夠使搖瓶上透明質酸酶的分泌表達酶活高達21334u/ml，產小分子透明質酸量達到10.6g/l，與對照相比提高了92.7％，分子量為8.34kda，在工業上具有潛在而廣泛的應用價值。

附圖說明

圖1為表達透明質酸酶的重組質粒的構建示意圖；

圖2所示為9株重組獸疫鏈球菌發酵第20h搖瓶上的胞外粗酶活；1.s.zooepidemicushyala；2.s.zooepidemicushyalc；3.s.zooepidemicushyale；4.s.zooepidemicushyalf；5.s.zooepidemicushyalg；6.s.zooepidemicushyalh；7.s.zooepidemicushyall；8.s.zooepidemicushyaln；9.s.zooepidemicushyalo。

具體實施方式

實施例涉及的核苷酸序列信息：

(1)seqidno.1序列信息為來源于水蛭的透明質酸酶編碼基因hyal編碼序列；

(2)seqidno.2序列信息為信號肽amyx的基因序列；

(3)seqidno.3序列信息為信號肽bpr的基因序列；

(4)seqidno.4序列信息為信號肽npre的基因序列；

(5)seqidno.5序列信息為信號肽oppa的基因序列；

(6)seqidno.6序列信息為信號肽vpr的基因序列；

(7)seqidno.7序列信息為信號肽wapa的基因序列；

(8)seqidno.8序列信息為信號肽yvgo的基因序列；

(9)seqidno.9序列信息為信號肽ywea的基因序列；

(10)seqidno.10序列信息為信號肽yxal的基因序列；

酶活測定方法：以透明質酸為底物，濃度為2mg/ml，用50mmpbs緩沖液(ph7.0)溶解底物。酶活測定的反應體系為1ml，加入經適當倍數稀釋的酶液100μl，38℃反應10min后，100℃煮沸1min終止反應。在比色管中加入2mldns試劑和1ml上述反應液，再煮沸10min，通過分光光度計測定在540nm處的吸光值。上述其它條件不變，反應液變為1ml透明質酸溶液，作為測定對照。酶活單位定義為：1ml酶液1h內生成的還原糖量(μg)。

實施例1分泌表達透明質酸酶重組質粒的構建

設計引物hyal-f和hyal-r，采用標準的pcr擴增體系和程序，擴增獲取序列如seqidno.1所示透明質酸酶基因hyal。

設計引物amyx-f/amyx-r，bpr-f/bpr-r，npre-f/npre-r，oppa-f/oppa-r，vpr-f/vpr-r，wapa-f/wapa-r，yvgo-f/yvgo-r，ywea-f/ywea-r，yxal-f/yxal-r，分別以質粒pma0911-amyx，pma0911-bpr，pma0911-npre，pma0911-oppa，pma0911-vpr，pma0911-wapa，pma0911-yvgo，pma0911-ywea，pma0911-yxal為模板，采用標準的pcr體系和程序，擴增得到信號肽amyx，bpr，npre，oppa，vpr，wapa，yvgo，ywea，yxal(seqidno.2-10所示)，其中上述信號肽上游引物均引入鏈球菌rbs序列aaggaggatgt，下游引物均引入與透明質酸酶hyal的n端20bp序列作為重疊區域，并分別與hyal融合形成片段amyx-hyal，bpr-hyal，npre-hyal，oppa-hyal，vpr-hyal，wapa-hyal，yvgo-hyal，ywea-hyal，yxal-hyal。

引物信息如下：5’-3’方向

hyal-f：atgaaagagatcgcggtgac

hyal-r：attagatctttactttttgcacgcttcaa

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yxal-r：gtcaccgcgatctctttcatcgcataagcagctgtcggct

將上述片段與載體peu308進行hindiii和bglii雙酶切，體系50μl：45μl片段或質粒，5μl10×greenbuffer，2.5μlhindiii酶，2.5μlclai酶。37℃酶切30min后將片段柱純化。酶切后的質粒經1％的瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收目標條帶。回收產物進行連接，體系10μl：1μl雙切的載體，4μl雙切的目的片段，5μlsolutioni連接酶，16℃連接過夜，轉化jm109感受態細胞，挑取單菌落pcr驗證，陽性重組子進行測序，比對正確，分別得到重組質粒peua，peuc，peue，peuf，peug，peuh，peul，peun，peuo。

上述構建的9個重組質粒分別電轉宿主s.zooepidemicus，方法是在200μl感受態細胞中加入500-1000ng質粒，冰浴10min，將混合體系轉移至2mm電激杯中電激，電壓設為2.5kv，用1ml冰冷的thyb將混合體系轉移至10mlthyb中，冰浴30-60min，在37℃靜置培養1h，14℃，6000r/min離心10min，菌體用1mlthyb重懸并涂布于含0.1g/l壯觀霉素的抗性平板，篩選獲得9個重組獸疫鏈球菌：s.zooepidemicushyala，hyalc，s.zooepidemicushyale，s.zooepidemicushyalf，s.zooepidemicushyalg，s.zooepidemicushyalh，s.zooepidemicushyall，s.zooepidemicushyaln，s.zooepidemicushyalo。

實施例29株重組獸疫鏈球菌的搖瓶培養及酶活測定

分別挑取上述構建的9個重組獸疫鏈球菌菌株及對照菌(轉化peu308空質粒)，單克隆接種于5ml種子培養基，置于200rpm37℃培養過夜，然后按10％的接種量轉接于250ml三角搖瓶，培養基為發酵培養基，裝液量為25ml，置于200rpm37℃培養20h，并加入0.1mmiptg進行誘導。

各取9株菌搖瓶中第20h發酵液樣品在5000r/min，4℃離心5min，保留上清，測定上清中的粗酶活。從附圖2看出，在誘導型啟動子pspac介導作用下，9株重組菌s.zooepidemicushyala，hyalc，s.zooepidemicushyale，s.zooepidemicushyalf，s.zooepidemicushyalg，s.zooepidemicushyalh，s.zooepidemicushyall，s.zooepidemicushyaln，s.zooepidemicushyalo第20h所產透明質酸酶的胞外粗酶活分別為17283u/ml，15485u/ml，10554u/ml，9872u/ml，14397u/ml，3475u/ml，1223u/ml，21334u/ml和684u/ml，而對照菌發酵液上清中幾乎未檢測到酶活。從該結果可看出，信號肽ywea對透明質酸酶的分泌效果最佳，證明通過篩選可獲得透明質酸酶分泌表達良好的信號肽。

實施例3重組獸疫鏈球菌的透明質酸產量和分子量測定

分別取融合信號肽后的重組菌和對照菌發酵至第20h的發酵液樣品，在5000r/min，4℃離心5min，保留上清，并加入3倍體積100％乙醇進行沉淀，混勻后放置30min，再5000r/min離心10min，加入等體積的蒸餾水，于4℃重新溶解沉淀，該純化步驟重復三次。透明質酸的含量采用bitter-muir咔唑比色法測定，在比色管中加入1ml硼砂硫酸試劑和200μl經一定倍數稀釋后的透明質酸樣品，混勻并在沸水中煮15min，冷卻至室溫，再加入50μl咔唑試劑，混勻并再在沸水中煮15min，冷卻后測定530nm處的吸光值，根據標準曲線計算產量。測得s.zooepidemicushyaln、s.zooepidemicushyala、s.zooepidemicushyalc、s.zooepidemicushyalg搖瓶發酵透明質酸的產量分別為10.6g/l、9.1g/l、7.9g/l、7.2g/l，而對照菌的產量為5.5g/l，另外，通過hpsec-malls法測定s.zooepidemicushyaln、s.zooepidemicushyala、s.zooepidemicushyalc、s.zooepidemicushyalg發酵第20h時透明質酸的分子量mw分別為8.34kda、11.53kda、23.79kda和36.67kda，而對照菌所產透明質酸分子量為1.01mda，證明獸疫鏈球菌本身可產大分子透明質酸，經異源表達透明質酸酶后，可在發酵過程中通過糖苷鍵切割降解大分子透明質酸，大大降低其分子量，形成具有生物醫學作用的小分子活性透明質酸。

雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。

sequencelisting

<110>江南大學

<120>一種發酵小分子透明質酸的重組獸疫鏈球菌

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