一種細菌微流控集成檢測的方法與流程
本發明涉及一種細菌微流控集成檢測的方法，用于細菌檢測的領域。
背景技術：
細菌性疾病是一類嚴重威脅人類健康的疾病，僅細菌性食源性致病菌每年約導致美國360萬人患病，3.6萬人住院，861人死亡。中國每年細菌性食源性疾病發病人數約9411.7萬人次，其中2475.3萬患者就診，335.7萬患者因病住院，8530例患者死亡。
致病菌的檢測是細菌性疾病預防控制和相關研究的基石，主要檢測對象為臨床樣本和非臨床樣本(環境、食品和媒介生物體等樣本)。分離培養技術是早期出現的致病菌檢測技術，以分離和鑒定兩個基本步驟為基礎，增加增菌步驟，有利于恢復受損菌體和低載量目標菌，同時可抑制競爭性雜菌生長，從而提高檢測敏感性。
分離培養技術作為標準方法已被廣泛應用于各層級實驗室，但其增菌、分離及鑒定的前處理步驟大多需要人工操作，程序較復雜，即使目前有自動化的接種儀器和飛行質譜鑒定設備以及上述兩種設備的聯用系統等可代替部分人力，但總體上因分離培養技術自身程序的復雜性和昂貴的自動化設備普及性受限，分離培養技術仍需占用大量人力，耗時較長。
為了克服上述不足，在增菌方面，本申請人首次創新性研制了毛細管色譜式增菌法，利用半固體凝膠的分子吸附原理將選擇性增菌劑固定于毛細管中作為固定相，以此預制毛細管為“色譜柱”，以樣本增菌液混合液為進樣源，利用帶鞭毛目標菌自身的動力，在毛細管中由進樣端向遠端高效地將目標菌從混合菌群中色譜式增菌，且同時可實現預增菌與增菌兩步合并進行，可節約大量的人力和時間，已獲相關授權專利5項。
在分離鑒定方面，致病菌分離培養技術的部分步驟可以被分子生物學檢測技術替代，以便于節約人力、加快檢測速度。增菌步驟無法由兩種技術替代，因兩種技術的靈敏性仍有一定局限性(檢出限較高)，分子生物學檢測技術對不同菌屬(種)的檢出限為101-103cfu/ml。
分子生物學檢測技術的核心部分是聚合酶鏈式反應(pcr)技術，主要包括普通pcr、實時熒光定量pcr和以及其他基于pcr的技術。目前已有dupont公司的
綜上所述，對于致病菌檢測，毛細管色譜式增菌法一定程度簡化了增菌的過程，但仍需配以后續繁雜的分離鑒定步驟。pcr技術在節約人力和降低檢測成本方面表現出一定優勢，但是仍需要輔以增菌過程，需幾步人工輔助。目前細菌的檢測仍然過程較為復雜，時間和人力成本占用較多。
技術實現要素：
為了徹底替代細菌檢測過程中的人工操作，節約時間和人力成本，本發明旨在提供一種細菌微流控集成檢測的方法，能夠實現細菌樣本的自動化檢測。
本發明的技術方案如下所述：
一種細菌微流控集成檢測的方法，包括以下步驟：增菌過程管道化、dna提取過程管道化和pcr反應過程管道化；
所述增菌過程管道化包括以下步驟：配制增菌基質，然后將增菌基質填裝入細管中；
所述dna提取過程管道化包括以下步驟：將dna提取液填裝入細管中，然后用密封膜密封細管兩端；
所述pcr反應過程管道化包括以下步驟：將pcr反應試劑填裝入細管中；
將增菌過程管道化中的細管一端插入樣本增菌液中進行增菌；增菌結束后，采用傳動裝置驅動取菌針環，將增菌過程管道化的細管中的菌液轉移至dna提取過程管道化的細管中；所述菌液在dna提取過程管道化中的細管中進行dna提取；提取結束后，采用注射泵將dna提取過程管道化的細管中的提取液轉移至pcr反應過程管道化的細管中進行pcr反應；pcr反應結束后，熒光實時檢測或通過電泳檢測目標產物。
為了更好地應用該方法，在該方法中使用自動細菌微流控集成檢測裝置，該裝置包括：微型管道集成系統、微流控系統和控制系統；
其中，所述微型管道集成系統包括取菌針環、增菌細管、dna提取管和pcr反應管；沿增菌細管長度方向上且在增菌細管的上部設置第一連接管，在增菌細管的下部、與第一連接管相對的位置處設置第二連接管，所述第二連接管通過dna提取管與pcr反應管相連接；所述取菌針環位于第一連接管內且位于增菌細管上方；
所述微流控系統包括傳動裝置和注射泵；
所述控制系統用于控制傳動裝置以驅動取菌針環穿過增菌細管取菌液后達到dna提取管，所述控制系統還用于控制注射泵以將dna提取管中的設定量的液體轉移到pcr反應管中。
優選的，所述第一連接管的頂端采用密封膜密封。
優選的，第一連接管與增菌細管的接觸部位采用密封膜密封(或隔開)，使第一連接管與增菌細管成為兩個獨立的封閉空間。
優選的，所述增菌細管與第二連接管的接觸部位采用密封膜密封(或隔開)，使增菌細管與第二連接管成為兩個相對獨立的封閉空間；當然，為了使得結構更加簡單，該密封膜結構可省略。
優選的，第二連接管與dna提取管的連接處采用密封膜密封，使第二連接管與dna提取管成為兩個獨立的封閉空間。
優選的，所述取菌針環是由柄基、接種環和針狀部件依次相連構成的。
進一步優選的，所述針狀部件為針。
進一步優選的，所述取菌針環的柄基頂端與傳動裝置相連。
優選的，所述增菌細管，包括細管以及用于裝填細管中的含有選擇性增菌劑和營養物質的半固體凝膠；或者，所述增菌細管，包括細管以及用于裝填細管中的吸附有選擇性性增菌劑的大分子吸附材料、營養液。
優選的，所述第一連接管、增菌細管和第二連接管的集成為一體形成，或者，各個部分是可拆卸的。
進一步優選的，當各個部分是可拆卸時，第一連接管和第二連接管通過四通接頭與增菌細管相連接，其中接頭將增菌細管分成兩段細管。
優選的，所述第二連接管上設有氣壓平衡孔，以微孔濾膜封孔。
優選的，所述dna提取管，包括細管、用于裝填細管中的dna提取液和用于密封細管兩端的密封膜；或者，所述dna提取管，是由兩根細管連接而成，其中一根細管裝填溶菌酶，另一根細管中裝填dna提取液。
優選的，所述pcr反應管，包括細管、用于裝填細管中的pcr反應試劑；或者，進一步包括裝填細管中的熒光檢測相關試劑。
優選的，所述pcr反應管末端內部設有微孔濾芯。
優選的，所述pcr反應管通過二通閥與注射泵相連。
優選的，所述dna提取管與pcr反應管之間設有三通閥。
與現有技術相比，本發明的技術方案具有如下有益效果：
本發明可以代替原有細菌檢測過程中仍需要人工增菌的繁雜的操作過程，將增菌過程、dna提取過程和pcr反應過程進行集成一體化，可節約時間和人力成本，此外自動化操作可降低人工操作中的失誤幾率，進一步提高檢測的準確性。結合pcr反應的快速檢測能力，能夠為臨床診斷或細菌傳染源的快速鎖定提供快速的技術支持，有利于及早地循證診療，提高治療的有效性；或者及早地發現傳染源，避免疫情的進一步擴大，降低更多的高危人群的感染風險。
附圖說明
圖1和圖2是本發明自動細菌微流控集成檢測的裝置的結構示意圖。
圖3是接通狀態下的三通閥的剖視側視圖。
圖4是未接通狀態下的三通閥的剖視側視圖。
圖5是三通閥的俯視圖。
圖6是接通狀態下的二通閥的剖視側視圖。
圖7是未接通狀態下的二通閥的剖視側視圖。
圖8是二通閥的俯視圖。
其中，1、取菌針環，1-1、柄基，1-2、接種環，1-3、針，2、增菌細管，3、dna提取管，4、pcr反應管，5、第一連接管，6、接頭，7、第二連接管，8、凍干溶菌酶，9、精密傳動裝置，10、精密注射泵，11、三通閥，11-1、第一定子，11-2、第一轉子，11-3、第一轉軸，11-4、第二孔道，11-5、第二孔道，11-6、板扣，12、二通閥，12-1、第二定子，12-2、第二轉子，12-3、第二轉軸，12-4、第三孔道，12-5、凹槽。
具體實施方式
應該指出，以下詳細說明都是示例性的，旨在對本發明提供進一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬技術領域的普通技術人員通常理解的相同含義。
需要注意的是，這里所使用的術語僅是為了描述具體實施方式，而非意圖限制根據本發明的示例性實施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數形式也意圖包括復數形式，此外，還應當理解的是，當在本說明書中使用術語“包含”和/或“包括”時，其指明存在特征、步驟和/或它們的組合。
正如背景技術中所介紹的，現有技術中細菌的檢測過程仍然較為復雜，時間和人力成本占用較多，為了解決如上的技術問題，本發明提出了一種細菌微流控集成檢測的方法，該方法包括以下步驟：增菌過程管道化、dna提取過程管道化和pcr反應過程管道化；
所述增菌過程管道化包括以下步驟：配制增菌基質，然后將增菌基質填裝入細管中；
所述dna提取過程管道化包括以下步驟：將dna提取液填裝入細管中，然后用密封膜密封細管兩端；
所述pcr反應過程管道化包括以下步驟：將pcr反應試劑填裝入細管中；
將增菌過程管道化中的細管一端插入樣本增菌液中進行增菌；增菌結束后，采用傳動裝置驅動取菌針環，將增菌過程管道化的細管中的菌液轉移至dna提取過程管道化的細管中；所述菌液在dna提取過程管道化中的細管中進行dna提取；提取結束后，采用注射泵將dna提取過程管道化的細管中的提取液轉移至pcr反應過程管道化的細管中進行pcr反應；pcr反應結束后，熒光實時檢測或通過電泳檢測目標產物。
在本發明優選的技術方案中，所述增菌基質為含有選擇性增菌劑和營養物質的半固體凝膠，或者是，所述增菌基質為大孔吸附材料和含有選擇性增菌劑的培養基。
在本發明優選的技術方案中，所述dna提取過程管道化包括以下步驟：將溶菌酶和dna提取液填裝入細管中，然后用密封膜密封細管兩端。
在本發明優選的技術方案中，所述pcr反應過程管道化包括以下步驟：將pcr反應試劑和熒光檢測試劑填裝入細管中。具體的技術方案是：將pcr反應試劑或pcr反應試劑和熒光檢測試劑溶解后，冷凍干燥包被于細管內的表面上。
在本發明優選的技術方案中，還包括使用增菌培養控溫系統實現原位增菌培養。
在本發明優選的技術方案中，還包括使用dna提取控溫系統實現原位dna提取。
在本發明優選的技術方案中，還包括使用pcr反應控溫系統實現原位pcr反應。
本發明還提供上述方法使用的細菌微流控集成檢測裝置，如圖1和圖2所示，該裝置包括：微型管道集成系統、微流控系統和控制系統。
其中，所述微型管道集成系統包括取菌針環1、增菌細管2、dna提取管3、pcr反應管4、第一連接管5和第二連接管7；沿增菌細管2長度方向上且在增菌細管2的上部設置第一連接管5，在增菌細管2的下部、與第一連接管5相對的位置處設置第二連接管7，所述第二連接管7通過dna提取管3與pcr反應管4相連接；所述取菌針環1位于第一連接管5內且位于增菌細管2上方。第一連接管5的中心線和第二連接管7的中心線所屬一條直線，保證取菌針環1能夠順利從第一連接管5中通過第二連接管7進入dna提取管，否則，無法實現這一過程。
其中，所述微流控系統包括精密傳動裝置9和精密注射泵10。
在本發明的優選的技術方案中，所述精密傳動裝置9可選擇為直線式驅動馬達，該設備為現有技術。
其中，所述控制系統用于控制精密傳動裝置9以驅動取菌針環1穿過增菌細管2取菌液，所述控制系統還用于控制所述精密注射泵10以將dna提取管3中的設定量的液體轉移到pcr反應管4中，所述精密注射泵10與pcr反應管的末端相連接，以將dna提取管中的液體吸入到pcr反應管中。本發明采用的精密注射泵為現有技術中常規的實驗儀器，特點是：電機驅動螺桿(導向螺桿)慢慢旋轉，將注射器的活塞推入，并且將注射液推出；當電機反向旋轉可以回吸液體。
在本發明中，為了防止雜菌污染，部件的頂端或末端，各個部件的連接處需要進行密封。如下所述：
在本發明優選的技術方案中，所述第一連接管5的頂端采用密封膜密封，防止外界的雜菌進入第一連接管5中污染取菌針環1。
在本發明優選的技術方案中，所述第一連接管5與增菌細管2的接觸部位采用密封膜密封(或隔開)，使第一連接管5與增菌細管5成為兩個獨立的封閉空間，以防止增菌細管2中的待檢測菌污染取菌針環1。或者，直接在取菌針環1下部處采用密封膜密封，從而使第一連接管5中的取菌針環1與增菌細管2隔開。
在本發明優選的技術方案中，所述增菌細管2與第二連接管7的接觸部位采用密封膜密封(或隔開)，使增菌細管2與第二連接管7成為兩個相對獨立的封閉空間；當然，為了使得結構更加簡單，該密封膜結構也可省略。
在本發明優選的技術方案中，第二連接管7與dna提取管3的連接處采用密封膜密封，使第二連接管7與dna提取管3成為兩個獨立的封閉空間。
在本發明中，所述取菌針環1是由柄基1-1、接種環1-2和針狀部件依次相連構成的，該針狀部件可為帶有針狀結構的部件，但是并沒有特別的限定，只要是能穿破第一連接管5與增菌細管2的連接處達到dna提取管3即可，針狀部件優選為針1-3。所述取菌針環1的柄基1-1頂端與精密傳動裝置9相連，其柄基1-1可露出第一連接管5外與精密傳動裝置9相連，或者，柄基1-1完全在第一連接管5內與精密傳動裝置9相連；兩種連接方式均可。根據使用需要不同，可以有多種取量(1～10μl)的取菌針環。該取菌針環1能夠通過四通接頭6穿過增菌細管2到達dna提取管3。為了防止雜菌污染將取菌針環1設置于第一連接管5中。所述第一連接管5的頂端(是指精密傳動裝置9的那一端)采用密封膜密封，與外界隔離。
在本發明中，所述增菌細管2，包括細管以及用于裝填細管中的含有選擇性增菌劑和營養物質的半固體凝膠；或者，所述增菌細管2，包括細管以及用于裝填細管中的大孔吸附材料和含有選擇性增菌劑的培養基。
在本發明中，所述增菌細管2與第一連接管5和第二連接管7兩者的中心線所在直線的角度α為0＜α≤90°，優選45°≤α≤90°，如圖1和2所示的角度。角度的選擇主要是考慮外置的溫度控制系統的結構形狀。
在本發明中，所述第一連接管5、增菌細管2和第二連接管7的集成為一體形成，或者，各個部分是可拆卸的。當各個部分是可拆卸時，第一連接管5和第二連接管7通過接頭6(該接頭為四通接頭)與增菌細管2相連接，其中接頭6將增菌細管2分成兩段細管。
在本發明優選的技術方案中，增菌細管2與dna提取管3的第二連接管7上設有氣壓平衡孔，以微孔濾膜封孔，便于精密注射泵10吸液時壓力平衡。
在本發明中，所述dna提取管3，包括細管、用于裝填細管中的dna提取液和用于密封細管兩端的密封膜；或者，所述dna提取管3，是由兩根細管連接而成，其中一根細管裝填溶菌酶，另一根細管中裝填dna提取液，dna提取管3的兩端以及兩根細管的連接處均采用密封膜密封，如圖2所示。
在本發明中，所述pcr反應管4，包括細管、用于裝填細管中的pcr反應試劑；或者，進一步包括裝填細管中的熒光檢測相關試劑。
在本發明中，所述的細管的內徑均為1～8mm。在本發明優選的技術方案中，所述細管的內徑為3～5mm。
在本發明優選的技術方案中，所述dna提取管3與pcr反應管4之間設有三通閥11，三通閥11將兩管連通，在不使用該裝置時，三通閥11兩端的管道是不相連通的，只用使用時通過該三通閥11來連通。該三通閥11可采用電磁閥，通過控制系統來控制其關與閉，實現全自動檢測的目的。三通閥顧名思義一共有三個口，其中兩個口與dna提取管3與pcr反應管相連接，剩余一個口與外界空氣連通，目的是平衡精密注射泵10在吸液后的氣壓。該三通閥11可采用現有技術中常規的三通電磁閥改進而來，本領域的技術人員可常規改進，只需將現有技術中的常規的三通電磁閥改進成為超小型三通電磁閥即可，三通電磁閥由控制系統控制開與閉；或者由現有技術中高效液相色譜中使用的六通閥進樣器改進而來，所述三通閥11是通過中間的第一轉軸11-3將圓柱狀的第一定子11-1和圓柱狀的第一轉子11-2連接，第一轉子11-2可通過第一轉軸11-3轉動；第一定子11-1和第一轉子11-2均設有沿長度方向的第一孔道11-4，第一轉子11-2還設有連通外界大氣的第二孔道11-5。當第一定子11-1和第一轉子11-2的兩第一孔道11-4在同一位置時，則連通，狀態結構如圖3所示，兩孔道錯開時則關閉，狀態結構如圖4所示。第一轉子12-2的柱體上設置凸起的板扣11-6用來旋轉第一轉子11-2，以發生相對移動，如圖5所示。
在本發明優選的技術方案中，所述pcr反應管4末端內部設有微孔濾芯，以緩沖外界氣體與內部試劑的接觸。pcr反應管4的末端通過二通閥12與精密注射泵10的吸液針相連接，不吸液時處于關閉狀態，吸液時開通。其中所述二通閥12可采用現有技術中常規的二通電磁閥改進而來，本領域的技術人員可常規改進，只需將現有技術中的常規的二通電磁閥改進成為超小型二通電磁閥即可，二通電磁閥由控制系統控制開與閉；或者由現有技術中高效液相色譜中使用的六通閥進樣器改進而來，所述二通閥12是通過中間的第二轉軸12-3將圓柱狀的第二定子12-1和圓柱狀的第二轉子12-2連接，第二轉子12-2可通過第二轉軸12-3轉動；第二定子12-1和第二轉子12-2均設有沿長度方向的第三孔道12-4，當第二定子12-1和第二轉子12-2的兩第三孔道12-4在同一位置時，則連通，狀態結構如圖6所示，兩孔道錯開時則關閉，狀態結構如圖7所示。第二轉子12-2的柱體上設置凹槽12-5用來旋轉第二轉子12-2，以發生相對移動，如圖8所示。二通閥12外徑與pcr反應管等徑，在未與精密注射泵10相連接時，pcr反應管4的末端口進行無菌膜密封。
進一步的，在本發明優選的技術方案中，所述自動細菌微流控集成檢測的裝置還包括精密溫度控制系統。所述精密溫度控制系統可為微型管道集成系統中的各個管道提供相應的溫度，本領域的技術人員通過現有技術常規設置和實現，在此不再贅述。
進一步的，在本發明優選的技術方案中，所述自動細菌微流控集成檢測的裝置還包括熒光檢測器，所述熒光檢測器對pcr反應管中的反應液進行熒光實時監測。
本發明中的自動細菌微流控集成檢測的裝置的使用方法是：
使用時，使微型管道集成系統相應的管道區域可匹配相應的溫度，將增菌細管2的一端插入到樣本增菌液中，設定一定增菌時間，增菌時間達到預設時間后，精密傳動裝置9驅動取菌針環1穿過增菌細管2取一定量菌液后(取菌針環1容易穿透各個密封膜)，到達dna提取管3，dna提取管3可在設定溫度和時間條件下提取一定時間后，精密注射泵10將dna提取管3中的液體轉移一定量到pcr反應管4中反應，反應后熒光實時監測或通過電泳檢測目標產物。
為了使得本領域技術人員能夠更加清楚地了解本發明的技術方案，以下將結合具體的應用實施例詳細說明本發明的以上技術方案。
實施例1細菌微流控集成檢測沙門氏菌
1、增菌過程管道化：選取內徑3mm、長度10cm玻璃細管，填裝改良半固體四硫磺酸鈉煌綠培養基，所述改良半固體四硫磺酸鈉煌綠培養基是通過以下方法制備得到：取蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、氯化鈉3.0g、碳酸鈣45.0g、瓊脂粉2.7g和蒸餾水1000ml加熱溶解后取900ml，加入100ml50％(質量分數，下同)硫代硫酸鈉溶液、20.0ml20％碘溶液(含25％碘化鉀)、2.0ml0.5％煌綠水溶液、50.0ml10％牛膽鹽溶液，混勻滅菌)。
2、dna提取過程管道化：選取內徑5mm的聚丙烯管，填裝200μldna提取液(dna提取液配方：10mmol/ltri-hclph7.6，5mmol/ledta，0.5％sds)，兩端用聚乙烯膜密封。
3、pcr反應過程管道化：選取與dna提取液兼容的50μl反應體系的引物、dna聚合酶、脫氧核苷酸單體溶解后，冷凍干燥包被于3mm內徑透明聚丙烯細管內的表面上。
4、增菌過程、dna提取過程和pcr反應過程的管道集成一體化：將5μl微型取菌針環1通過四通接頭6和第一連接管5與增菌細管2連接，取菌針環1孔的起始位置位于增菌細管2上部，環的上側能與四通接頭6的開孔尺寸匹配，下側使用聚乙烯密封膜密封，取菌針環1的柄基1-1部用聚乙烯膜與第一連接管5頂部密封。將增菌細管2通過第二連接管7與dna提取管3連接，增菌細管2與dna提取管3的第二連接管7上留一個氣壓平衡孔，以微孔濾膜封孔，便于精密注射泵10吸液時壓力平衡。將dna提取管3通過三通閥11與pcr反應管4通連接過，pcr反應管4末端用微孔濾芯和一個凹槽式控制二通閥12，閥門外徑與pcr反應管4等徑，末端口進行無菌膜密封。
5、管道集成中自動移液：直線式驅動馬達(誤差≤0.5mm)驅動取菌針環1穿過增菌細管2取5μl菌液后，到dna達提取管3。由精密注射泵10(移液誤差≤1μl)移取將dna提取管3中50μl的液體轉移pcr反應管4中反應。
6、增菌過程、dna提取過程和pcr反應的原位執行：集成管道的增菌細管2一頭插入到緩沖蛋白胨水增菌液中，使用培養控溫系統供溫36℃，24h對增菌管道實現原位增菌培養。使用dna提取控溫系統實現原位dna提取，95℃裂解30min后，降溫至4℃。使用pcr反應控溫系統實現原位pcr反應，反應后電泳檢測目標產物。
實施例2細菌微流控集成檢測金黃色葡萄球菌
1、增菌過程管道化：選取內徑3mm、長度10cm玻璃細管，依次填裝大孔吸附樹脂和7.5％氯化鈉肉湯(取蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化鈉75g和蒸餾水1000ml加熱溶解后滅菌)。
2、dna提取過程管道化：5mg溶菌酶于冷凍干燥包被于2.5mm外徑的彈頭式轉運架(即是子彈頭式的一個塑料支架，溶菌酶包被于其表面)表面，然后裝入3mm內徑聚丙烯管，兩端用聚乙烯膜密封，選取內徑5mm的聚丙烯管，填裝200μldna提取液(dna配方：10mmol/ltri-hclph7.6，5mmol/ledta，0.5％sds)，兩端用聚乙烯膜密封，并將兩個細管進行焊接。
3、pcr反應過程管道化：選取與dna提取液兼容的50μl反應體系的引物、dna聚合酶、脫氧核苷酸單體和熒光檢測試劑溶解后，冷凍干燥包被于3mm內徑透明聚丙烯細管內的表面上。
4、增菌過程、dna提取過程和pcr反應的管道集成一體化：將5μl微型取菌針環1通過四通接頭6和第一連接管5與增菌細管2連接，取菌針環1孔的起始位置位于增菌細管2上部，環的上側能與四通接頭6的開孔尺寸匹配，下側使用聚乙烯密封膜密封，取菌針環1的柄基1-1部用聚乙烯膜與第一連接管5頂部密封。將增菌細管2通過第二連接管7與dna提取管3連接，增菌細管2與dna提取管3的第二連接管7上留一個氣壓平衡孔，以微孔濾膜封孔，便于精密注射泵10吸液時壓力平衡。將dna提取管3通過三通閥與pcr反應管4通連接過，pcr管末端用微孔濾芯和一個凹槽式控制二通閥12，閥門外徑與pcr反應管4等徑，末端口進行無菌膜密封。
5、管道集成中自動移液：直線式驅動馬達(誤差≤0.5mm)驅動取菌針環1穿過增菌細管2取5μl菌液后，到dna達提取管3(同時攜帶溶菌酶轉運架進入dna提取液)。由精密注射泵10(移液誤差≤1μl)移取將dna提取管3中50μl的液體轉移pcr反應管4中反應。
6、增菌過程、dna提取過程和pcr反應的原位執行：集成管道的增菌管一頭插入到7.5％氯化鈉肉湯增菌液中，使用培養控溫系統供溫36℃，18h對增菌管道實現原位增菌培養。使用dna提取控溫系統實現原位dna提取，37℃提取30min后，95℃滅活10min，降溫至4℃。使用pcr反應控溫系統實現原位pcr反應。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
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