一種遺傳毒性物質檢測載體及檢測方法與流程

本發明涉及對環境中的遺傳毒性物質檢測的技術領域，具體為利用攜帶報告基因的重組大腸桿菌檢測環境中的遺傳毒性物質。

背景技術：

遺傳毒性物質的檢測方法分為長期測試和短期測試。長期測試方法由于費時，費力，對實驗動物長期維護費用高昂，已逐漸被快速、成本低廉的短期篩選方法所取代。短期測試是以細胞遺傳學指標來篩選化學誘變因子，通常利用植物、哺乳動物、微生物等生物細胞監測殘留物的遺傳毒性。目前發展有彗星試驗、姐妹染色單體交換試驗，SOS顯色試驗、程序外DNA合成試驗、細菌回復突變、原噬菌體誘導試驗等。這些檢測方法通常具有操作繁雜、檢測時間長、需要嚴格的無菌操作等不利于推廣的因素。并且由于專利保護等原因，個別檢測方法并不利于國內推廣，限制了其廣泛使用。

遺傳毒性試驗是指用于檢測通過不同機制直接或間接誘導遺傳學損傷的受試物的體外和體內試驗，這些試驗能檢出DNA損傷。這種DNA損傷是惡性腫瘤發展過程的環節之一。近年來建立了一些短期快速的體外遺傳毒性試驗方法來檢測DNA的損傷。傳統的用于遺傳毒性物質的檢測方法有氣相色譜-質譜,液相色譜-質譜或者高壓液相色譜-質譜聯用技術。這些技術能夠準確地、定量地檢測幾百種上述化學物質,準確度可達到痕量水平。然而,這些方法均需要大型精密儀器進行檢測,且這些方法存在檢測周期長、操作繁瑣、費用高和要求分析人員必須具有較高的分析能力等問題,無法滿足現場檢測的需求。因此，發展一種簡便、快速和經濟的檢測手段才能滿足現場檢測的需求。目前已建立的遺傳毒性短期檢測法已超過200種。其中研究和應用較多的遺傳毒性試驗方法有：彗星試驗(Coment assay)，又稱單細胞凝膠電泳試驗(Single cell gel electrophoresis，SCGE)、姐妹染色單體交換試驗(Sister chromatid exchange，SCE)、程序外DNA合成(又稱DNA修復合成，Unscheduled DNA synthesis，UDS)、鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗(The reverse mutationtest of salmonella typhi munine，又稱Ames試驗)、SOS顯色試驗(SOS chromotest)、原噬菌體誘導試驗方法(Prophage induction assay)等。上述方法中，Ames試驗是遺傳毒性分析中最常規的方法。McCann用Ames試驗檢測300種化學物的結果表明，大多數致癌劑是誘變劑，相關性在80％以上。Ames試驗的優點是方法靈敏，檢出率高；加之方法比較簡便、易行，不需特殊器材，容易推廣。其缺點是：(1)微生物的DNA修復系統比哺乳動物簡單，基因不如哺乳動物多，不能完全代表哺乳動物的實際情況；(2)不能檢測含組氨酸、甘氨酸或乳糖的樣品；(3)工作量大，檢出時間長，菌株不易保存。盡管如此，由于存在上述的優勢，故目前在致突變試驗中占重要位置，成為首選的試驗方法。加拿大、美國、日本等許多國家都在誘變試驗系統中將Ames試驗列在首選位置，與細胞遺傳學體外試驗或體內試驗組合，可作為第一階段初篩的手段。

SOS顯色試驗，是基于遺傳毒性物質誘導生物的SOS修復啟動，表達umuC基因而設計的(G.Reifferscheid,J.Heil,Y.Oda and R.K.Zahn,et al.A microplate version of the SOS/umu-test for rapid detection of genotoxins and genotoxic potentials of environmental samples.Mutation Research,253(1991)215-222)。1982年，Quillardet等首次利用SOS反應原理來檢測遺傳毒物，他們構建的是含sifA-LacA融合基因的質粒Quillardet,P.,Huisman,O.,D’Ari,R.et al.SOS chromotest,a direct assay of induction of an SOS function in Escherichia coli K-12to measure genotoxicity.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 79,5971-5975,1982)。1985年，研究者根據對83種不同化合物的測試結果，認為絕大多數Ames試驗呈陽性反應的物質，SOS試驗也呈陽性反應。1985年，Oda等用umuC和LacA融合，umu試驗正式被提出來(Oda,Y.Induction of SOS responses in Escherichia coli by 5-fluorouracil.Mutation research 183,103-108,1987)。1986年，IARC第83號出版物將該法列為致癌物短篩系統的系列方法之一(Long-term and short-term assays for carcinogens:a critical appraisal.Reports of an ad-hoc working group.Lyons,2-6December 1985.IARC scientific publications,1-564,1986.)。1991年，Reifferscheid等對umu試驗做了進一步改進，使用96孔的微培養板代替試管，并結合計算機技術，使該方法能自動化、高通量的篩選遺傳毒物。在德國，umu試驗是第一個標準化的用于檢測廢水遺傳毒性的試驗(DIN 38415-3)(Reifferscheid,G.,Heil,J.,Oda,Y.et al.A microplate version of the SOS/umu-test for rapid detection of genotoxins and genotoxic potentials of environmental samples.Mutation research 253,215-222,1991.)。現有的基于SOS/umu的遺傳毒性檢測檢測系統，檢測時間過長，步驟繁瑣。即使在檢測菌已經活化好的基礎上，整個檢測過程仍然需要6小時左右，且需要菌體裂解以釋放beta-半乳糖苷酶，通過酶活測定beta-半乳糖苷酶酶活。

遺傳毒性污染物在我國環境中分布較廣，種類及數量較大，在環境污染物中有一定代表性，對人體危害較大，建立快速，有效，便利并利于推廣的檢測方法十分重要。

技術實現要素：

本發明是針對現有技術的不足，提供一種操作便利、靈敏度高、生物安全性好、無需外加試劑裂解細胞、不受色素干擾、耗時短、成本低，易于實現高通量篩查的環境遺傳毒性物質快速檢測方法。

微生物DNA受到損傷(如紫外照射、遺傳毒性物質刺激)時，會引起一系列修復基因的大量表達。而這些基因的大量表達依賴于recA蛋白在損傷作用下激活，水解阻遏蛋白LexA，促使阻遏蛋白下游的修復基因大量表達。這些修復反應被稱之為SOS反應。SOS反應廣泛存在于原核生物和真核生物中，是生物在不利環境中自我保護的本能。其中LexA與修復基因上游的結合區域稱為SOS box，該段編碼基因位于修復基因的啟動子-35到-10區域內。本研究就是利用SOS box響應區域，調控下游報告蛋白表達，實現對環境中遺傳毒性物質的定性、定量檢測。

大腸桿菌的λ噬菌體是目前研究最清楚、應用最廣泛的噬菌體之一。噬菌體中導致細胞裂解的基因包括S、R和Rz三個基因，其中R基因編碼的是一種可溶于水的轉糖基酶(transglycosylase)，可以引起肽鍵的水解，分解細胞壁的肽聚糖。Rz基因的產物可能是一種肽鏈內切酶(endopepidase)，它可以切割肽聚糖和寡糖之間和/或者肽聚糖與細胞壁外膜之間的連接。R和Rz基因產物的功能都是降解細胞壁，而S基因產物的作用是改變細胞質膜的通透性，在細胞質膜上形成多孔的結構，以使R和Rz基因的產物穿過細胞質膜，并作用于細胞壁，使細胞壁破碎，釋放胞內物質。

本發明利用重組大腸桿菌作為遺傳毒性物質檢測菌。該菌株是將特定的遺傳毒性物質響應的啟動子序列與噬菌體裂解基蛋白SRRz基因序列連接，與質粒載體連接后導入大腸桿菌，形成攜帶噬菌體裂解蛋白SRRz的大腸桿菌，即為本發明中所用的重組大腸桿菌。當重組菌遇到遺傳毒性物質，導致DNA損傷，則啟動裂解基因SRRz的表達，最終導致大腸桿菌破裂。通過檢測菌體裂解效率，在一定范圍內即可定量檢測污染物含量。

本發明的目的是提供一種遺傳毒性物質檢測載體，該載體是自5’到3’端順次連接有遺傳毒性響應啟動子，噬菌體裂解基因和大腸桿菌終止子的大腸桿菌表達載體。

所述的遺傳毒性物質響應元件，可為SOS響應的任意元件，優選為序列表中SEQ ID No.1核苷酸序列。

所述的噬菌體裂解基因，可為任意一種噬菌體裂解基因，優選為lambda噬菌體的裂解基因SRRz，具有序列表中SEQ ID No.2的核苷酸序列。

所述的大腸桿菌終止子可為任意一種大腸桿菌終止子，優選為T7終止子。

用于構建所述載體的出發載體可為任意一種大腸桿菌載體，優選pBluescript,pUC18,pUC19,pET系列載體。以pUC18為出發載體，構建的大腸桿菌裂解載體為pUST。

本發明的第二個目的是提供一種遺傳毒性物質的檢測方法。

本發明所提供的遺傳毒性物質檢測方法，是將上述遺傳毒性物質響應載體導入大腸桿菌中，得到重組菌，再將重組菌與遺傳毒性物質孵育，大腸桿菌細胞裂解。所述大腸桿菌重組菌攜帶有遺傳毒性響應載體，重組菌在接觸遺傳毒性化學物質時，會引發自身細胞裂解，通過裂解效率對遺傳毒性物質定量的檢測方法。

所述大腸桿菌優選E.coli BL21，E.coli DH5a，E.coli XL1-blue或E.coli HB101。

上述的遺傳毒性物質檢測方法，包括以下步驟：

(1)制備大腸桿菌檢測液；

(2)將待測樣品與大腸桿菌檢測液混合，同時添加同體積純溶劑的大腸桿菌檢測液作對照；兩組樣品均繼續培養0.3-1h；

(3)將與待測樣品混合的大腸桿菌檢測液與對照組的大腸桿菌檢測液分別測得OD₆₀₀；

(4)計算裂解效率，根據裂解效率標準曲線計算待測樣品中遺傳毒性物質濃度。

所述大腸桿菌檢測液的制備：

a)將重組大腸桿菌儲藏物用LB固體培養基進行培養，使其復蘇活化；

b)將得到的活化大腸桿菌單菌落接入到LB液體培養基中進行震蕩培養至對數生長期后期；

c)將得到的飽和菌液以1:100體積比接種到新鮮的LB培養基中，培養至菌液OD₆₀₀為0.15-0.25，得到大腸桿菌檢測液。

所述的遺傳毒性物質包括甲磺酸甲酯(MMS)、4-硝基喹啉1-氧化物(4-NQO)、絲裂霉素C(MMC)、2-氨基蒽(2-AA)和苯并芘(BaP)。

所述裂解效率標準曲線如下：

4-NQO，Y＝-1.78+10.95X,R²＝0.99(1<X<5)

MMS，Y＝-16.98+0.57X,R²＝0.98(40<X<100)

MMC，Y＝-19.04+4.11X,R²＝0.98(5<X<20)

2-AA，Y＝-8.32+86.24X,R²＝0.99(0.2<X<0.8)

BaP，Y＝4.03+89.10X,R²＝0.98(0.1<X<0.8)

其中，X表示遺傳毒性化合物濃度(mg/L)，Y表示裂解率(％)，R²表示擬合曲線相關系數。

含有所述大腸桿菌遺傳毒性物質響應載體的重組大腸桿菌也屬于本發明的保護范圍。

與現有技術相比，本發明的有益效果如下：

1、操作對象為大腸桿菌，無致病風險，操作簡便易行。

2、測試周期短，3h內可檢測完成(2h檢測菌液準備，0.5小時菌液與待測樣品接觸培養，0.5h測定菌液OD₆₀₀值)，大大縮短了以往遺傳毒性物質檢測所需時間。

3、檢測過程無需添加額外試劑(如酶底物等)，成本低廉。

4、檢測靈敏度高，對4-NQO、MMS、MMC、2-AA和BaP的敏感濃度范圍分別為在1-5、40-100、5-20、0.2-0.8、0.1-0.8mg/L條件下敏感。

5、檢測的水樣遺傳毒性物質含量，可以換算成4-NQO的當量濃度，使結果更加直觀、統一。

6、該方法可為突發水質污染和水廠水質常規檢測提供技術支持。

附圖說明

圖1為載體構建示意圖。

圖2為野生型大腸桿菌(E.coli BL21/pUC18)和重組菌(E.coli BL21/pUST)與不同遺傳毒性物質接觸培養0.5h的裂解效率圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步具體詳細描述，但本發明的實施方式不限于此，對于未特別注明的工藝參數，可參照常規技術進行。

實施例1

遺傳毒性響應載體的構建

以pUC18為出發載體，構建遺傳毒性響應載體pUST。具體構建方法如下：

a)合成遺傳響應啟動子P_umu(SEQ ID No.1)和T7終止子序列，分別在啟動子和T7終止子上游添加EcoRI和XbaI位點，下游添加SpeI和PstI酶切位點。

b)以lambda噬菌體基因組DNA為模板，擴增SRRz基因。在SRRz基因的上下游也分別添加EcoRI和XbaI、SpeI和PstI酶切位點。

c)采用生物積木(Biobricks)方法，采用酶切、連接方法將各元件按照啟動子-裂解基因-終止子順序連接，插入到pUC18載體中，得到遺傳毒性響應載體pUST。

d)將載體pUST轉入到E.coli BL21感受態細胞，獲得遺傳毒性物質檢測用的重組大腸桿菌E.coli BL21/pUST。

實施例2

裂解效率計算

大腸桿菌檢測液接觸待測樣品后0.5h，分別測定各測試菌液在600nm處的光吸收值(OD₆₀₀)。

裂解率(％)＝(A-B)/A*100％

其中，A—添加甲醇的菌液OD₆₀₀

B—添加測試樣的菌液OD₆₀₀。

實施例3

遺傳毒性物質檢測

1.重組大腸桿菌的復蘇活化

(1)將野生型大腸桿菌(E.coli BL21/pUC18)和重組菌(E.coli BL21/pUST)分別從-80°冰箱中劃線于LB平板培養基中，在37℃條件下恢復培養14h。

(2)挑取單菌落，分別接種至LB培養基中，在37℃、250rpm條件下培養12-16h。

2.大腸桿菌檢測液制備

將復蘇活化的菌液以1:100體積比接種至新鮮LB培養基，以190μl體積量加入到96孔培養板中，在35-37℃，800rpm條件下培養至OD₆₀₀到0.15-0.25。

3.與受試樣品接觸

取甲醇和不同濃度的4-NQO、MMS、MMC、2-AA和BaP各10μl分別加入到96孔板內，在35-37℃，800rpm條件下繼續培養0.5h，設置3個平行組。

4.實驗結果表明(圖2)，在測試濃度范圍內，原始菌株E.coli BL21/pUC18菌體生長正常，未觀測到菌體裂解。而含遺傳毒性響應載體的重組菌E.coli BL21/pUST，存在不同程度的裂解。

根據檢測圖2，相應遺傳毒性物質的檢測標準曲線分別為：

4-NQO，Y＝-1.78+10.95X,R²＝0.99(1<X<5)

MMS，Y＝-16.98+0.57X,R²＝0.98(40<X<100)

MMC，Y＝-19.04+4.11X,R²＝0.98(5<X<20)

2-AA，Y＝-8.32+86.24X,R²＝0.99(0.2<X<0.8)

BaP，Y＝4.03+89.10X,R²＝0.98(0.1<X<0.8)

其中，X表示遺傳毒性化合物濃度(mg/L)，Y表示裂解率(％)，R²表示擬合曲線相關系數。

實施例4

水樣中遺傳毒性物質檢測

本實施例遺傳毒性物質的快速檢測方法，以4-NQO為標準毒性物質。根據文獻報道，健康成人日攝入的飲用水中4-NQO濃度不應超過80ng/L(以2L/日飲用水量計)(Martijn,B.J.；Van Rompay,A.R.et al.,Development of a 4-NQO toxic equivalency factor(TEF)approach to enable a preliminary risk assessment of unknown genotoxic compounds detected by the Ames II test in UV/H2O2water treatment samples.Chemosphere 2016,144,338-345.)。

本實施例包括以下步驟：

(1)按照實施例3的方法制備大腸桿菌檢測液。

(2)取待測水樣，以40mL/min的速度用活化的樹脂吸附，然后乙酸乙酯洗脫。洗脫液采用離心凍干方法去除乙酸乙酯，再以一定體積的蒸餾水溶解樣品至所需體積。將待測水樣與大腸桿菌檢測液混合，同時添加同體積純溶劑的大腸桿菌檢測液做對照；兩組樣品均繼續培養1h。所述待測水樣分別取日常城市用水(實驗室水龍頭放出)、城市水廠水源、某化工廠廢水A和某化工廠廢水B。

(3)將與待測水樣混合的大腸桿菌檢測液與對照組的大腸桿菌檢測液分別測得OD₆₀₀。

(4)計算裂解效率，根據裂解效率標準曲線計算待測樣品中遺傳毒性物質4-NQO當量濃度。所得結果如表1所示。

表1結果表明，日常城市用水和城市水廠水源的遺傳毒性物質4-NQO的當量濃度低于25ng/L，而化工廠廢水A水樣4-NQO當量濃度約為460-470ng/L，化工廠廢水B水樣4-NQO當量濃度約為290-300ng/L。

上述檢測結果表明，本發明的遺傳毒性響應的重組大腸桿菌，可以在響應濃度范圍內對待測物的具有遺傳毒性的化合物進行檢測。該方法耗時短、檢測簡便易行、易于推廣。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南理工大學

<120> 一種遺傳毒性物質檢測載體及檢測方法

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 82

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1

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gaattctacg tctagagctt attgacatgc tggcaagaac agactactgt atataaaaac 60

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<210> 2

<211> 1549

<212> DNA

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<220>

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