本發明涉及一種增強嬰幼兒免疫力的人工微生態制劑的制備方法，具體涉及分離、篩選待產母體陰道分泌物中具有益生作用的微生物，制備成為微生態制劑用于恢復剖腹產新生兒共生微生物，屬于微生物生物技術與生物醫藥領域。
背景技術：
現代醫學技術的發展為人類創造了剖腹產手術, 這種新的分娩方式挽救了無數產婦和嬰兒的生命, 為保障人類的健康和人口再生長做出了巨大貢獻。在陰道分娩無法達成, 或經陰道分娩可能對產婦或新生兒造成威脅時, 才需要剖腹產。然而近年來，我國剖腹產的孕婦數量逐年增多，如今我國的剖宮產率已經高達40%-50%，某些地區甚至更高。
分娩方式的選擇直接影響新生兒共生菌群的組成。在順產的嬰兒中，觀察到微生物組成往往與母體產道和腸道相似，而在剖腹產的嬰兒中，微生物組成往往更接近于母親的皮膚以及醫院環境包括醫護人員和其它新生兒。陰道分娩兒的菌群定植主要受母親陰道和會陰區域菌群的影響，剖腹產兒則主要受醫院環境的影響。以腸道菌群為例，前者最初的腸道菌群主要是母親陰道和外陰周圍的細菌，多為乳酸桿菌、普雷沃氏菌、雙歧桿菌等；而后者主要以鏈球菌、葡萄球菌、厭氧球菌、類桿菌、丙酸桿菌為主。其中金黃色葡萄球菌是導致新生兒敗血癥的主要原因，雙歧桿菌數量則很低甚至沒有，而雙岐桿菌對機體健康及免疫功能有重要作用。
正常陰道分娩過程中嬰兒經過產道時會被產道擠壓，在分娩過程中及出生后不久，母親身體里的細菌就會通過胎兒呼吸道及消化道最早進入胎兒體內定植，這個細菌定植對嬰兒一生的健康非常重要，它為一個基本無菌的新生兒腸道內建立起新的微生物生態系統。這些定植的細菌主要是在分娩過程，產道環境微生物起作用的結果。而新生兒的這一微生物生態系統的構成成分直接影響嬰兒的免疫功能。剖腹產新生兒因出生時沒有經產道擠壓、不能及時建立共生菌群。最終造成剖腹產兒的微生物生態系統的構成與順產兒有很大的不同。
大量的研究發現，剖腹產新生兒中觀察到的微生物組成改變與遠期多種疾病發生風險升高有著密切的關系，包括過敏、濕疹、哮喘、肥胖、1型糖尿病、慢性相關炎癥性疾病等。英國研究人員警告說，剖腹產的孩子比順產的孩子更易患哮喘，剖腹產孩子患哮喘的概率比正常順產的孩子高80%。剖腹產剝奪了孩子最先感覺統合鍛煉的權利，使得剖腹產兒容易患感統失調。而且剖腹產令“濕肺癥”增多。總的來說，與自然分娩相比，剖腹產新生兒的免疫力及抗感染能力比自然分娩的孩子要差。
技術實現要素：
本發明的目的在于針對現有技術不足提供一種增強嬰幼兒免疫力的人工微生態制劑的制備方法。
本發明所述方法包括下列步驟：
1、陰道分泌物的收集：在進行剖腹產手術之前1小時，將一塊大小適宜的無菌紗布放置于待產母親的陰道中10min；
2、陰道菌群的保存：將浸有陰道分泌物的紗布浸沒于無菌的PBS溶液中，用無菌鑷子不斷擠壓紗布，使紗布中的陰道分泌物分布于PBS中，離心，取沉淀，在沉淀中加入20%甘油，旋渦振蕩器混勻，-8O ℃下保存；
3、陰道菌群的分離及鑒定:
（1）培養基的制備：配制BSM、MRS、改良的GAM固體培養基和BHI+5%脫脂乳的固體和液體培養基；所述BSM培養基用于培養雙岐桿菌，MRS培養基用于培養乳酸菌，改良的GAM培養基用于培養擬桿菌，BHI+5%脫脂乳的固體和液體培養基用于培養總菌；
（2）培養方式：將陰道分泌物從-8O ℃的冰柜中取出，取陰道分泌物加入到無菌的PBS溶液中，按101～108比例稀釋；分別取100μL102、104、106涂板，厭氧和需氧條件下培養48h；
（3）挑菌接種：于無菌超凈工作臺中根據平板中菌落的形態、大小、顏色、邊緣整齊與否、隆起與否和降解乳糖與否，挑出單菌落接種于相應的液體培養基中；
（4）革蘭染色：取10μL菌液，涂板于載玻片上，置于電子顯微鏡下觀察菌的形態結構；
（5）測序：根據革蘭染色的結果選出不同的細菌用于測序，確定陰道分泌物中各種微生物的種屬關系；
4、具有益生作用微生物的篩選：根據測序結果篩選出具有益生作用的微生物混合并進行培養。
5、陰道菌群凍干粉的制備：往菌液中加入等量的20%的滅菌脫脂乳，均勻混合，冷凍干燥后，制成凍干粉。
6、陰道益生菌群凍干粉的應用：在新生兒產下前，用無菌的生理鹽水溶解凍干粉，配成溶液，待剖腹產新生兒產下1-3分鐘后，用無菌紗布蘸取溶液依次擦拭新生兒的嘴部、面部、肛門等身體的其他部位。
7、新生兒共生微生物的鑒定：為驗證這種分離篩選陰道益生菌群移植的方法是否可以恢復新生兒共生微生物。在新生兒出生的1、3、7、14、21及30天這六個時間點分別在受試母嬰的肛門、口腔及皮膚等部位共采集了樣本，采用16S rRNA測序的方法鑒定其群落組成。
本發明的有益效果：該方法直接從待產孕婦陰道分泌物中分離陰道有益菌，將可能的致病菌排除，用于建立和恢復剖腹產嬰幼兒身體各部位菌群結構重建，具有簡單方便、安全有效、可操作、可商品化等優點，有助于更好地增強和提高剖腹產新生兒的抗感染能力和免疫功能。
具體實施方式
本發明所述方法包括下列步驟：
1、陰道分泌物的收集：在進行剖腹產手術之前1小時，將一塊大小適宜的無菌紗布放置于待產母親的陰道中10min；
2、陰道菌群的保存：將浸有陰道分泌物的紗布浸沒于無菌的PBS溶液中，用無菌鑷子不斷擠壓紗布，使紗布中的陰道分泌物分布于PBS中，離心，取沉淀，在沉淀中加入20%甘油，旋渦振蕩器混勻，-8O ℃下保存；
3、陰道菌群的分離及鑒定:
（1）培養基的制備：配制BSM、MRS、改良的GAM固體培養基和BHI+5%脫脂乳的固體和液體培養基；所述BSM培養基用于培養雙岐桿菌，MRS培養基用于培養乳酸菌，改良的GAM培養基用于培養擬桿菌，BHI+5%脫脂乳的固體和液體培養基用于培養總菌；
（2）培養方式：將陰道分泌物從-8O ℃的冰柜中取出，取陰道分泌物加入到無菌的PBS溶液中，按101～108比例稀釋；分別取100μL102、104、106涂板，厭氧和需氧條件下培養48h；
（3）挑菌接種：于無菌超凈工作臺中根據平板中菌落的形態、大小、顏色、邊緣整齊與否、隆起與否和降解乳糖與否，挑出單菌落接種于相應的液體培養基中；
（4）革蘭染色：取10μL菌液，涂板于載玻片上，置于電子顯微鏡下觀察菌的形態結構；
（5）測序：根據革蘭染色的結果選出不同的細菌用于測序，確定陰道分泌物中各種微生物的種屬關系；
4、具有益生作用微生物的篩選：根據測序結果篩選出具有益生作用的微生物混合并進行培養。
5、陰道菌群凍干粉的制備：往菌液中加入等量的20%的滅菌脫脂乳，均勻混合，冷凍干燥后，制成凍干粉。
6、陰道益生菌群凍干粉的應用：在新生兒產下前，用無菌的生理鹽水溶解凍干粉，配成溶液，待剖腹產新生兒產下1-3分鐘后，用無菌紗布蘸取溶液依次擦拭新生兒的嘴部、面部、肛門等身體的其他部位。
7、新生兒共生微生物的鑒定：為驗證這種分離篩選陰道益生菌群移植的方法是否可以恢復新生兒共生微生物。在新生兒出生的1、3、7、14、21及30天這六個時間點分別在受試母嬰的肛門、口腔及皮膚等部位共采集了樣本，采用16S rRNA測序的方法鑒定其群落組成。