一種2-苯乙醇的生物制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種2-苯乙醇的生物制備方法，屬于微生物技術領域。
【背景技術】
[0002]2-苯乙醇，又稱β-苯乙醇、二苯基乙醇，是一種具有玫瑰花香的芳香醇，其味淡雅細膩，多存在于玫瑰、水仙、百合、茉莉等植物精油中，2-苯乙醇也是面包、奶酪、餅干、葡萄酒等食品中的風味物質，該物質在堿性環境以及對空氣的氧化作用穩定，其衍生酯類物質，如乙酸苯乙酯等也是重要的芳香產品。是一種具有玫瑰花香的芳香醇，其味淡雅細膩，多存在于玫瑰、水仙、百合、茉莉等植物精油中，2-苯乙醇也是面包、奶酪、餅干、葡萄酒等食品中的風味物質，該物質在堿性環境以及對空氣的氧化作用穩定，其衍生酯類物質，如乙酸苯乙酯等也是重要的芳香產品。
[0003]目前生物轉化生產2-苯乙醇的菌株主要集中在酵母。常見的2-苯乙醇酵母生產菌株包括:釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，馬克斯克魯維酵母(KluyveromycesmarXianus)，解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)等。高濃度的2_苯乙醇(Log Pow =1.36)對微生物細胞有一定的毒性。研究表明濃度為2g/L的2-苯乙醇就能完全抑制馬克斯克魯維酵母的生長(Fabre CE,Blanc PJ,Goma G.Product1n of 2-phenylethyl alcoholby Kluyveromyces marxianus[J].B1technol Prog，1998，14:270-274.);2.5g/L 2-苯乙醇能使得釀酒酵母生物量降低75%，3g/L 2-苯乙醇幾乎能完全抑制釀酒酵母菌株生長(Seward RJ1Willets MG1Dinsdale,et al.The effects of ethanol,hexan-l-ol,and 2-phenylethanol on cider yeast growth,viability,and energy status；Synergisticinhibit1n[J].J I Brewing.1996,102(6):439-443.)。最終導致2-苯乙醇的產率較低，發酵液中2-苯乙醇的濃度大都低于4g/L。
[0004]產甘油假絲酵母(Candida glycerinogenes CCTCC M 93018)是我國擁有自主知識產權的一株具有優良發酵性能的工業菌株，能在55%葡萄糖或15%NaCl的高滲透壓培養基上正常生長繁殖，具有耐高滲和高抗逆性的特點。
【發明內容】
[0005]本發明為解決上述的技術問題，提供了一種以耐高滲透壓的產甘油假絲酵母為生產菌株生產2-苯乙醇的方法。
[0006]—種2-苯乙醇的生物制備方法，步驟如下:
[0007](I)挑取I環產甘油假絲酵母接入種子培養基中，在30°C，200r/min條件下，振蕩培養18h，得到液態種子。
[0008](2)將步驟(I)得到的液態種子按4% (v/V)的接種量接入發酵培養基中，控制發酵溫度為30 0C，轉速為500r/min，時間為50h，發酵結束。
[0009]根據本發明優選的，所述步驟(I)中種子培養基為酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量為水;根據本發明優選的，所述步驟(2)中發酵培養基為L-苯丙氨酸7g/L，葡萄糖90g/L，KH2P04 5g/L，酵母粉4g/L，MgS04.7H20 0.5g/L，余量為水。
[0010]本發明的有益效果:
[0011]1.本發明所選的產甘油假絲酵母菌株2-苯乙醇耐受性高，可達4g/L。進一步克服了2-苯乙醇在發酵過程中對菌株的毒害作用，有利于該菌株在2-苯乙醇工業生產中的應用。
[0012]2.本發明所選的產甘油假絲酵母菌株具有2-苯乙醇產量高，轉化率高的特點，經檢測，該菌株可利用7g/L的L-苯丙氨酸生成5g/L的苯乙醇，轉化率為0.71(g/g)。
【附圖說明】
[0013]圖1是產甘油假絲酵母在含不同濃度2-苯乙醇培養基中的生長情況。
[0014]圖2是產甘油假絲酵母菌株產2-苯乙醇樣品的氣相色譜-質譜聯用圖譜。a是產甘油假絲酵母菌株產2-苯乙醇樣品的氣相色譜圖；b是產甘油假絲酵母菌株產2-苯乙醇樣品的質譜圖。
[0015]圖3是產甘油假絲酵母發酵合成2-苯乙醇的過程曲線。
【具體實施方式】
[0016]下面通過實施例對本發明進一步詳細描述。
[0017]實例I
[0018]挑取I環產甘油假絲酵母接入種子培養基(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量為水)中，在30 0C，200r/min條件下，振蕩培養18h，得到液態種子。將得到的液態種子按4%(v/v)的接種量接入含有不同濃度的2-苯乙醇培養基(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量為水)中，2-苯乙醇的濃度分別為Og/L，1.0g/L，2.0g/L，3.0g/L，3.5g/L，4.0g/L。裝液量為50mL/250mL，控制培養溫度為30°C，轉速為200r/min，在不同時間取樣測定酵母的生長量0D6Q()(附圖1)。
[0019]實例2
[0020]挑取I環產甘油假絲酵母接入種子培養基(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量為水)中，在30 0C，200r/min條件下，振蕩培養18h，得到液態種子。將得到的液態種子按4%(v/v)的接種量接入接入發酵培養基(L-苯丙氨酸7g/L，葡萄糖90g/L，KH2PO4 5g/L，無氨基酸酵母氮源YNB 0.17g/L,MgSO4.7H20 0.5g/L，余量為水)中，裝液量為30mL/250mL，控制發酵溫度為30 V，轉速為200r/min，時間為50h，發酵結束。
[0021]產物確認采用氣相色譜-質譜聯用檢測，將實施例2制得的發酵液4°C，10，000r/m離心lOmin，取上清液于分液漏斗，加入相同體積的正戊烷與環己烷的混合溶液(2:1，v: V)混勻，萃取過夜，將有機相添加無水硫酸鈉脫水，取上清液供氣-質聯用檢測。
[0022]氣相色譜-質譜(GC-MS)儀(BrokerSC1N SQ，USA)，色譜柱DB-wax，( 30m X
0.25mm，0.25ym)，進樣量0.2yL，載氣為He，流速0.8mL/min，進樣口溫度為260 °C，柱溫箱起始溫度為50°C，保留lmin，以10°C/min程序升溫至230°C，保留5min至終點。連接桿溫度250°C，質量掃描范圍33-400m/z，電離電壓70eV。使用Nist 98譜庫進行圖譜檢索。質譜離子圖解析結果附圖2所示。
[0023]實例3
[0024]挑取I環產甘油假絲酵母接入種子培養基(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量為水)中，在30 0C，200r/min條件下，振蕩培養18h，得到液態種子。將得到的液態種子按4%(v/v)的接種量接入接入含有2.5L發酵培養基(L-苯丙氨酸7g/L，葡萄糖90g/L，KH2PO4 5g/L，酵母粉4g/L，MgS04.7H20 0.5g/L，余量為水)的5L發酵罐中，控制發酵溫度為30 0C，轉速為500r/min，時間為50h，發酵結束。
[0025]發酵液中2-苯乙醇的測定方法，采用高效液相色譜法(HPLC)分析，具體如下:將發酵液10，000r/min離心，離心后再用0.45μηι微孔濾膜過濾處理，高效液相色譜儀(Agilent,USA)，色譜柱為C18柱(250mmX 4.6mm，10ym；Ailite，中國)，流動相為甲醇:水=50:50(v/V)，流動相流速0.7mL/min，柱溫30°C，檢測波長260nm，進樣1yL檢測。發酵結束后2-苯乙醇的濃度為5g/L(附圖3)，轉化率為0.71(g/g)。
[0026]以上所述內容僅為本發明構思下的基本說明，而依據本發明的技術方案所作的任何等效變換均應屬于本發明的保護范圍。
【主權項】
1.一種2-苯乙醇的生物制備方法，其特征在于，通過選取耐高滲透壓的產甘油假絲酵母(Candida glycerinogenes CCTCC M 93018)，轉化L-苯丙氛酸發酵生產2_苯乙醇。2.如權利要求1所述2-苯乙醇的制備方法，其特征在于，所述的酵母菌株為耐高滲透壓，同時對2-苯乙醇的耐受性可達4g/L的產甘油假絲酵母。3.如權利要求1或2所述2-苯乙醇的制備方法，步驟如下: (1)挑取I環產甘油假絲酵母接入種子培養基中，在30°C，200r/min條件下，振蕩培養18h，得到液態種子。 (2)將步驟(I)得到的液態種子按4%(v/v)的接種量接入發酵培養基中，控制發酵溫度為30 0C，轉速為500r/min，時間為50h，發酵結束。4.如權利要求3的方法，其特征在于，所述步驟(I)中種子培養基為酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量為水。5.如權利要求3的方法，其特征在于，所述步驟(2)中發酵培養基為L-苯丙氨酸7g/L，葡萄糖90g/L，KH2P04 5g/L，酵母粉4g/L，MgS04.7H20 0.5g/L，余量為水。
【專利摘要】本發明公開了一種2?苯乙醇的生物制備方法。即選取耐高滲透壓的產甘油假絲酵母(Candida glycerinogenes CCTCC M 93018)轉化L?苯丙氨酸發酵生產2?苯乙醇。該酵母對2?苯乙醇的耐受性可達4g/L，有效克服了2?苯乙醇對宿主生產菌的生長抑制，2?苯乙醇的產量達到5g/L、轉化率達到0.71(g/g)。本發明的制備方法具有操作方便、轉化效率高、生產成本低、工業化應用前景廣等特點。
【IPC分類】C12R1/72, C12P7/22
【公開號】CN105713933
【申請號】CN201610256845
【發明人】諸葛斌, 王玉芹, 陸信曜, 宗紅
【申請人】江南大學