肉果草微衛星分子標記的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種生物科學中的DNA分子標記技術，尤其設及一種肉果草微衛星分 子標記、引物對及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 微衛星分子標記又稱作簡單序列重復（Simple Sequence Repeats, SSRs)，是指 基因組中Wl-6個核巧酸為單位串聯組成的核巧酸序列。由于重復次數的不同或重復程度 的不完全相同，造成了微衛星序列長度的高度變異性，由此產生了微衛星分子標記。雖然微 衛星位點核屯、序列的重復次數在個體間呈高度變異性，但是其兩端側翼序列多是保守的單 拷貝序列，因此可W用兩端的側翼序列設計成對引物，通過PCR技術，經聚丙締酷胺凝膠電 泳(PAGE)或其他適宜方式顯示運些分子標記在不同個體間的多態性。微衛星分子標記具有 W下特點：廣泛分布于真核生物的基因組中；多態性信息容量高;呈共顯性;遵循孟德爾遺 傳法則、中性選擇等。基于W上特點，微衛星分子標記被廣泛用于遺傳多樣性分析、植物遺 傳圖譜的構建、基因定位、品種鑒定、種質保存、數量性狀基因的分析、進化與親緣關系等方 面的研究。
[0003] 肉果草化ancea tibetica)，藏名己丫己，隸屬于玄參科肉果草屬，分布于青藏高 原及其郵鄰山區（西藏、青海、甘肅、四川、云南及印屬喜馬拉雅地區等），生于海拔2000-4500米的草地、疏林中或溝谷旁。肉果草為重要的藏藥植物，全草有養肺排脈、清熱止咳功 效，花、果能治療屯、臟病、血性腫瘤(血癌）、哮喘、痛腫瘡瘍等。肉果草藥理作用主要有如下 幾個方面：（1)有抗腫瘤作用；（2)有抗氧化作用；（3)有抗追作用；（4)有抗真菌作用；巧)有 殺菌作用；（6)具有降糖的作用；（7)具有保肝作用。由于其具有很重要的藥用價值，肉果草 已經吸引了很多國內外學者的關注。在與玉樹等地的藏醫交流中發現，肉果草作為一味十 分重要的藏藥材，有著較為廣泛的應用。但由于對該物種的遺傳背景等研究較少，難W開展 人工種植，僅依靠野外采挖獲取，加劇了該物種的溯危進程。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是針對現有技術尚未開發肉果草微衛星標記的現狀，利用限制性酶 切位點相關DNA的簡化基因組測序(RAD-seq)技術開發出肉果草微衛星分子標記并獲得對 應的引物，建立一種制備肉果草微衛星分子標記的方法，并由此可W進一步用運些分子標 記進行遺傳多樣性分析、植物遺傳圖譜的構建、基因定位、品種鑒定、種質保存、數量性狀基 因的分析、進化與親緣關系研究等。
[0005] 為了實現上述目的，本發明的技術方案為： 一種肉果草微衛星分子標記，具有序列表SEQ. ID.No. 1至SEQ. ID.No. 10中任一種或多 種的核巧酸序列，運些分子標記所對應的位點分別編號為LT4、LT7、LT9、LT10、LT12、LT15、 LT16、LT18、LT25、LT28。
[0006] 適于本發明中任意一種或多種肉果草微衛星分子標記的特異性引物，具有序列表 SEQ ID NO. 11至SEQ ID NO.30中任一種或多種的核巧酸序列，各引物的特點及與微衛星分 子標記(位點）的對應關系見表1。
[0007] 表1微衛星片段引物的特點及與微衛星分子標記(位點）的對應關系
一種基于RAD-seq技術獲取本發明所述肉果草微衛星分子標記的方法，其包括W下步 驟： (1) 肉果草DNA文庫的構建:用CTAB法提取肉果草基因組DNA、通過限制性內切酶進行酶 切、連接接頭pl、隨機打斷、末端修復、加 A尾、連接接頭p2、PCR擴增、回收300-7(K)bp序列和 純化，在111皿ina HiSeq測序平臺上進行雙末端測序； (2) 測序數據質量控制：每端測序12化P，用111皿ina化sava 1.8進行堿基識別（Base 化1 ling)，獲得原始測序序列（Sequenced Reads),稱之為raw base,對其測序質量分布、測 序錯誤率分布W及GC含量分布進行檢查，得到clean base; (5) RAD-^g捕獲率統計：統計clean base去重后reads中酶hg開頭的reads數，W及 酶捕獲的reads數目與去重后reads數目的比值，得到RAD-Tag相關統計信息（本發明RAD-Tag捕獲率為97.65%，所有樣本的數據量足夠，測序質量合格，GC含量正常）； (4)聚類與組裝:對于樣本中含有酶識別位點reads,用cd-hit-est軟件進行聚類，并從 中選取reads支持數為10-400之間的類，根據聚類結果，用Velvetopt進行參數設置，對篩 選后的類進行組裝，組裝后，并對12化P W下的cont ig進行過濾； 巧)SSR檢測:對于已經組裝好的contig，用rimmomatic V. 0.32軟件進行SSR檢測，SSR 檢測標準如下：SSR重復單元的最小長度為化p、SSR重復單元的最大長度為6bp、SSR序列的 最小長度為12bp、SSR上下游序列長度為10化P、兩個SSR的最小距離為12bp; (6) 分離SSR引物：用Primer 3軟件批量設計SSR引物，合成SSR引物，并鑒定其在不同肉 果草中的多態性。
[000引一種利用本發明所述引物分析肉果草遺傳多樣性的方法，包括W下步驟： (1) 實驗材料的準備：肉果草采樣，采集野外自然狀態下肉果草生長正常的嫩葉，用娃 膠迅速干燥后帶回實驗室，并分別提取用于檢測分析的每個個體的基因組DNA; (2) PCR擴增:利用本發明所述的任意一對或多對引物，W提取的不同個體的基因組DNA 為模板進行PCR擴增反應，94 °C預變性4分鐘，94 °C變性45秒，退火30秒(退火溫度見表1 )，72 °C延伸35秒，變性至退火=個步驟重復35次，最后72°C充分延伸8分鐘，4°C保存； (3 )電泳檢測:對PCR擴增產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，對于條帶清晰的PCR產物 用聚丙締酷氨凝膠電泳進行檢測； (4)結果分析:用genepop軟件計算期望雜合度和觀察雜合度，并計算近交系數，W此來 描述相關肉果草微衛星DNA多態性的特征。
[0009] 本發明的有益效果:開發出肉果草微衛星分子標記并分離出對應的引物，并建立 了行之有效的獲取肉果草微衛星分子標記的方法，運些分子標記及其引物可進行遺傳多樣 性分析、植物遺傳圖譜的構建、基因定位、品種鑒定、種質保存、數量性狀基因的分析、進化 與親緣關系研究等。根據實際需要，可W采用本發明公開的任意一種或多種標記，或與相關 標記對應的任意一對或多對特異性引物進行分析研究。
【附圖說明】
[0010] 圖1是肉果草的DNA文庫構建及庫檢示意圖； 圖2是測序質量分布檢測； 圖3是測序錯誤率分布檢測； 圖4是G、C含量分布檢測； 圖5是肉果草SSR不同重復單元數量統計； 圖6是LW位點對所有個體擴增后經PAGE電泳檢測圖。
【具體實施方式】
[0011] 為了詳細說明本發明肉果草微衛星分子標記的技術內容、構造特征，W下結合實 施方式并配合附圖作進一步說明。
[0012] 實施例一：肉果草微衛星分子標記的制備方法 I.肉果草DNA文庫的構建 1.1基因組DNA的提取:用CTAB法提取肉果草基因組，然后通過限制性內切酶進行酶切， 酶切后的DNA片段連接接頭pi。
[001引 1.2混池:打斷的DNA，經過末端修復后，在打斷的DNA另一端加上A尾，然后加上p2 接頭。
[0014] 1.3測序：對W上的DNA片段進行PCR擴增，回收300-700bp的序列，純化后，在 111皿ina化Seq測序平臺上進行雙末端測序。肉果草DNA文庫構建及庫檢示意圖見圖1。
[0015] 2.測序數據質量控制 2.1數據質量檢查：每端測序12化P，用Illumina Casava 1.8進行堿基識別（Base Calling),獲得原始測序序列（Sequenced Reads),稱之為raw base、raw data 或 raw reads,對其測序質量分布進行檢測，結果見圖2;對測序錯誤率分布進行檢查，結果見圖3; 對GC含量分布進行檢查，結果見圖4。
[0016] 2.2測序數據過濾：測序得到的2，800，948，250bp的raw base中，錯誤分布率為 0.04%，Q20為93.24%，Q30為87.66%;GC含量為35.33%，共得到2，764，204，500bp的clean base。綜上所述，所有樣本的數據量足夠，測序質量合格，GC含量正常，建庫成功。
[0017] 2.3 RAD-Tag捕獲率統計：統計clean base去重后reads中酶!"ag開頭的reads數。 酶捕獲率的reads數目與去重后reads數目的比值為97.65%，從11056818條clean reads中 共得到8074787條去重后的reads。
[001引 3.聚類與組裝 對于樣本中含有酶識別位點reads,用cd-hit-est軟件進行聚類，并從中選取reads支 持數為10-400之間的類，對過濾的類數的統計見表2。根據聚類結果，用Velvetopt進行參 數設置，對篩選后的類進行組裝，組裝后，對12化pW下的contig進行過濾，結果統計見表3。 [0019]表2類數統計結果
4. SSR檢測 對于已經組裝好的contig，用rimmomatic V. 0.32軟件進行SSR檢測。SSR檢測標準如 下：（I)SSR重復單元的最小長度為2; (2)SSR重復單元的最大長度為6; (3)SSR序列的最小長 度為12;(4)SSR上下游序列長度為lOObp;巧)兩個SSR的最小距離為12bp;其統計結果見圖 5;隨機挑選出100對SSR序列用Primer 3軟件進行引物設計。
[0020] 5.分離SSR引物 用設計的100對SSR引物，對來自3個居群(YD，QML，MY)的56個個體進行PCR擴增，肉果草 居群位置信息見表4。反應程序:94°C預變性4分鐘，94°C變性45秒，退火30秒(退火溫度見表 1)，72°C延伸35秒，變性至退火S個步驟重復35次，最后72°C充分延伸8分鐘，4°C保存，1%的 瓊脂糖凝膠電泳檢測。對于條帶清晰的PCR產物用PAGE電泳進行檢測，得到10個多態性的微 衛星標記。用LW位點對應引物對所有的個體進行擴增后，在PAGE電泳進行檢測的電泳圖見 圖6。
[0021] 親4巧要直臣描仿晉倍烏
實施例二:用所述10對引物進行肉果草遺傳多樣性分析 用gen邱OP軟件計算期望雜合度和觀察雜合度，并計算近交系數，W此來描述10個肉果 草微衛星DNA多態性的特征。結果見表5。
[0022] 由表5可W看出本發明的10個微衛星序列在3個居群的56個個體中都有多樣性。由 此可見，本發明的10個微衛星標記可W用于遺傳多樣性分析、植物遺傳圖譜的構建、基因定 位、品種鑒定、種質保存、數量性狀基因的分析、進化與親緣關系研究等，具有重復性好的特 點，是一種可靠有效的分子標記。
[0023] 親5肉果草的10個引物在3個居趙中結果
注：化:期望雜合度;化:觀察雜合度;NA:零等位基因頻率;Fis :近交系數，*代表偏離哈 德溫伯格平衡的於〇.〇1。
[0024] 從上述分析結果可W看出，本發明公開的任意一種微衛星分子標記及其相應的引 物(對)均可W用于肉果草遺傳多態性的分析研究，可W根據需要和實驗，選定所需的標記、 標記組合及相關引物，可W為其中的某一種、某幾種，也可W是全部。
[0025] 本發明的標記物和/或相應的引物可W應用于肉果草遺傳多樣性分析、植物遺傳 圖譜的構建、基因定位、品種鑒定、種質保存、數量性狀基因的分析和/或進化與親緣關系等 方面的研究中。
[0026] W上掲示的僅為本發明的較佳實施例而已，不能W此來限定本發明之權利范圍， 依本發明權利所做的等同變化，仍屬于本發明所涵蓋的范圍。
【主權項】
1. 一種肉果草微衛星分子標記，其特征在于具有序列表SEQ. ID. No. 1至SEQ. ID. No . 10 中任意一種或多種的核苷酸序列。2. -種適于權利要求1所述分子標記的特異性引物，其特征在于具有序列表SEQ ID NO. 11至SEQ ID NO.30中任意一種或多種的核苷酸序列。3. -種基于RAD-seq技術獲取權利要求1所述的肉果草微衛星分子標記的方法，其特征 在于包括以下步驟： (1) 肉果草DNA文庫的構建：用CTAB法提取肉果草基因組DNA、通過限制性內切酶進行酶 切、連接接頭pl、隨機打斷、末端修復、加 A尾、連接接頭p2、PCR擴增、回收300-700bp序列和 純化，在11 lumina HiSeq測序平臺上進行雙末端測序； (2) 測序數據質量控制:每端測序125bp，用Illumina Casava 1.8進行堿基識別，獲得 原始測序序列raw base，對其測序質量分布、測序錯誤率分布以及GC含量分布進行檢查，得 到clean base; (3) RAD_Tag捕獲率統計:統計clean base去重后reads中酶Tag開頭的reads數，以及酶 捕獲的reads數目與去重后reads數目的比值，得到RAD-Tag相關統計信息； (4) 聚類與組裝:對于樣本中的含有酶識別位點reads，用cd-hit-est軟件進行聚類，并 從中選取reads支持數為10-400之間的類，根據聚類結果，用Velvetopt進行參數設置，對篩 選后的類進行組裝，組裝后，對125bp以下的contig進行過濾； (5) SSR檢測：對于已經組裝好的contig，用rimmomatic ν·0· 32軟件進行SSR檢測，SSR 檢測標準如下：SSR重復單元的最小長度為2bp、SSR重復單元的最大長度為6bp、SSR序列的 最小長度為12bp、SSR上下游序列長度為100bp、兩個SSR的最小距離為12bp; (6) 分離SSR引物：用Primer 3軟件批量設計SSR引物，合成SSR引物，鑒定其在不同肉果 草中的多態性，篩選出具有穩定性和多態性的引物。4. 一種利用權利要求2所述的引物分析肉果草遺傳多樣性的方法，其特征在于包括以 下步驟： (1) 實驗材料的準備：肉果草采樣，并分別提取用于檢測分析的每個個體的基因組DNA; (2) PCR擴增：利用權利要求2所述的引物，以提取的不同個體的基因組DNA為模板進行 PCR擴增反應，94 °C預變性4分鐘，94 °C變性45秒，退火30秒，72 °C延伸35秒，變性至退火三個 步驟重復35次，最后72°C充分延伸8分鐘，4°C保存； (3) 電泳檢測:對PCR擴增產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，對于條帶清晰的PCR產物 用聚丙烯酰氨凝膠電泳進行檢測； (4) 結果分析:用genepop軟件計算期望雜合度和觀察雜合度，并計算近交系數，以此來 描述肉果草相關微衛星DNA多態性的特征。5. 權利要求1所述的分子標記或權利要求2所述的引物在肉果草遺傳多樣性分析、植物 遺傳圖譜的構建、基因定位、品種鑒定、種質保存、數量性狀基因的分析和/或進化與親緣關 系研究中的應用。
【專利摘要】本發明涉及一種肉果草微衛星分子標記，屬DNA分子標記技術領域，其通過RAD?seq技術從肉果草基因組DNA中分離微衛星分子標記，根據每個微衛星分子標記位點兩端的側翼序列設計該分子標記的特異性引物，對來自不同居群的肉果草個體進行PCR擴增并檢測擴增結果的穩定性和多態性，獲得了10個有效的微衛星分子標記。本發明開發出有效的肉果草微衛星分子標記，建立了制備肉果草微衛星分子標記的方法，并可用這些分子標記進行遺傳多樣性分析、植物遺傳圖譜的構建、基因定位、品種鑒定、種質保存、數量性狀基因的分析、進化與親緣關系研究等。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/10, C12N15/11
【公開號】CN105713984
【申請號】CN201610251776
【發明人】張發起, 田尊哲, 陳世龍, 高慶波
【申請人】中國科學院西北高原生物研究所