一種與水稻江南晚穗瘟抗性基因緊密連鎖的分子標記及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于農作物分子遺傳育種學領域，設及一種與水稻江南晚穗攝抗性基因緊 密連鎖的分子標記及其應用。
【背景技術】
[0002] 水稻是我國最重要的糧食作物之一，對保障我國糧食安全和國民經濟增長具有重 要意義。稻攝病是我國水稻生產上最嚴重的病害，具有傳播快、發生廣、危害重等特點(凌忠 專等，1989,我國北方稻區稻攝病菌生理小種研究.中國農業科學，22(3) :7-13)。進一步發 掘和利用我國抗稻攝病基因資源，培育和種植抗病品種是控制稻攝病發生和減少水稻產量 損失最經濟有效的途徑。
[0003] 迄今，各國科學家從水稻中鑒定了 80多個抗稻攝病基因，其中有24個抗病基因被 成功克隆。運些抗病基因可W引入或聚合到現代品種，選育出高抗、廣譜的品種。但傳統育 種方法費時、費力、表型鑒定困難、育種效率低，由于抗病基因多為顯性、基因間往往存在上 位性互作，抗病基因聚合更為困難。通過分子標記輔助育種可W有效解決運一問題。
[0004] 我國太湖流域稻作歷史悠久，被認為是梗稻起源地之一，蘊藏有豐富的稻種資源， 李培富等(2007，4個太湖流域梗稻地方品種抗稻攝病性的遺傳分析，遺傳，2007年10期)報 道我國太湖流域梗稻地方品種江南晚對稻攝病菌的抗性表現廣譜和高抗的特點。從我國特 有的種質資源中鑒定和克隆穗攝抗性基因，可W獲得具有自主知識產權的基因，對提高我 國水稻抗稻攝病育種水平，尤其是梗稻的抗稻攝病育種有重大意義。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種用于檢測與水稻稻攝病抗性基因緊密連鎖的分子標 記的引物對或引物對組及其應用。
[0006] 本發明的另一目的在于提供一種用于檢測或輔助檢測水稻抗稻攝病基因的試劑 盒及其應用。
[0007] 本發明的又一目的在于提供一種檢測水稻抗稻攝病基因或選擇水稻抗稻攝病品 種的分子標記方法及其應用。
[000引本發明主要提供水稻品種江南晚穗攝抗性基因饑-jnl的分子標記方法。通過檢測 與抗病基因 Pb-jnl緊密連鎖的分子標記，可W確定有無抗病基因 Pb-jnl，并預測水稻植株 的稻攝病抗性，加快抗稻攝病水稻新品種的選育進度。
[0009] 本發明的目的可通過如下技術方案實現：
[0010] -種用于檢測與水稻稻攝病抗性基因緊密連鎖的分子標記的引物對或引物對組， 所述的引物對為引物對A或引物對B;所述的引物對組由引物對A和引物對B組成;所述引物 對A為由如SEQ ID NO. 1所示的核巧酸片段和如SEQ ID NO.2所示的核巧酸片段組成的引物 對;所述引物對B為由如SEQ ID NO. 3所示的核巧酸片段和如SEQ ID NO.4所示的核巧酸片 段組成的引物對。
[0011] 表1為引物對及其所對應的分子標記
[0012]
[0013] 上述的引物對或引物對組在制備檢測或輔助檢測水稻抗稻攝病基因的試劑盒中 的應用。
[0014] -種用于檢測或輔助檢測水稻抗稻攝病基因的試劑盒，該試劑盒包含有上述的引 物對或引物對組。
[0015] 上述的用于檢測或輔助檢測水稻抗稻攝病基因的試劑盒還包含有PCR技術常用的 試劑。
[0016] 上述的引物對、引物對組及試劑盒在檢測或輔助檢測水稻抗稻攝病基因或選擇水 稻抗稻攝病品種中的應用。
[0017] -種檢測水稻抗稻攝病基因或選擇水稻抗稻攝病品種的分子標記方法，包括W下 步驟：
[001引（1)提取待測水稻樣品基因組DNA;
[0019] (2) W步驟（1)提取的基因組DNA為模板，采用上述的引物對或引物對組進行PCR擴 增，獲得PCR產物；
[0020] (3)檢測PCR產物如果擴增出大小為117bp或/和16化P的分子標記片段，標志水稻 樣品中晚穗攝抗性基因化-jn 1存在，則待測的水稻樣品為抗稻攝病品種或候選的抗稻攝病 品種。
[0021] 所述PCR擴增的反應體系為：10 X含Mg2+的緩沖液1.化1，4pmol AU的引物對或引物 對組化l，2.5mM dNTPs 0.2iil，5U/山的化9酶0.化iaOngAU的水稻樣品基因組模板DNA化 1，加水至IOiU。
[0022] 所述PCR擴增的反應程序為:94 °C預變性5分鐘后;94 °C變性30秒，55 °C退火30秒， 72°C延伸展1分鐘，循環35次;最后72°C延伸10分鐘。
[0023] 本發明水稻江南晚穗攝抗性基因化-jnl的分子標記方法的具體步驟為：
[0024] (1)取水稻樣品，提取水稻樣品基因組DNA; (2)利用與水稻江南晚穗攝抗性基因 Pb-jnl緊密連鎖的分子標記引物，對所述的水稻樣品基因組DNA進行PCR擴增，PCR擴增產物 在8%非變性聚丙締酷胺凝膠上進行電泳檢測，如果擴增出對應大小的分子標記DNA片段， 標志著化-jnl基因的存在。
[0025] 上述的方法在提高水稻抗稻攝病品種育種進程中的應用。
[0026] 本發明的有益效果
[0027] 本發明所提供的水稻江南晚穗攝抗性基因的分子標記方法，具有W下優點：
[00%] (1)江南晚為太湖流域梗稻地方品種，具有廣譜高抗穗攝的特征，其主效抗病基因 饑-jnl為一個新的穗攝抗性基因，篩選獲得與之緊密連鎖的分子標記M27273和BS33,為分 子標記輔助選擇育種和克隆化-jnl基因奠定了基礎。利用本發明任意一對與水稻江南晚穗 攝抗性基因 Pb-jnl緊密連鎖的分子標記引物對，進行穗攝抗性基因 Pb-jnl的鑒別，選擇效 率都達到98.8 % W上，利用兩對分子標記引物的選擇效率達99.98 %。
[0029] (2)通過本發明分子標記定位的基因位點精確，鑒定方便。由于運些標記與穗攝抗 性基因 Pb-jnl的重組率低（含1.2%)，通過檢測運些與抗病基因饑-jnl緊密連鎖的分子標 記，可W確定抗稻攝病基因 Pb-jnl(t)的存在與否，預測水稻植株的稻攝病抗性，從而快速 抗病育種進程。
[0030] (3)輔助育種選擇目標明確，節約成本。在傳統抗病育種方法中，對育種材料的穗 攝抗性進行表型鑒定，受接種環境影響較大，表型鑒定的結果可靠性低。因此抗病育種不僅 費時，而且難度大，成本高。通過檢測穗攝抗性基因 Pb-jnl，可W在苗期取樣，提取DNA，利用 上述標記就可鑒定出抗稻攝病的單株，淘汰其它植株，不僅節約生產成本、控制育種群體規 模，而且大大提高抗稻攝病個體的選擇效率。
【附圖說明】
[0031] 圖1.水稻穗攝抗性基因化-jnl緊密連鎖SSR標記RM27273的8%非變性聚丙締酷胺 凝膠電泳圖。
[0032] 其中：M:分子量Marker; J:江南晚；S:蘇御懦;F:雜合型；1-5:抗病重組自交系；6-10:感病重組自交系。
[0033] 圖2.水稻穗攝抗性基因饑-jnl緊密連鎖SSR標記BS33的8%非變性聚丙締酷胺凝 膠電泳圖。
[0034] 其中：M:分子量Marker; J:江南晚；S:蘇御懦;F:雜合型；1-5:感病重組自交系；6-10:抗病重組自交系。
【具體實施方式】
[0035] 實施例1
[0036] ( - )材料與方法：
[0037] 1.李培富等利用抗稻攝病水稻地方品種江南晚（罕）與感病品種蘇御懦(方)雜交獲 得Fi,自交獲得F2分離群體，用于遺傳分析，明確江南晚對"北r菌系的抗性是由兩對抑制基 因互作控制。本發明在此基礎上，采用單粒傳法構建F2:7重組自交系群體，即兩親本雜交獲 得Fi，自交獲得F2，F2隨機選取284個單株，單株自交產生株系，連續自交6代，最終構建成包 括284個株系的F2:7重組自交系群體。利用該群體定位到一個與抗稻攝病相關的主效位點， 此位點位于第11條染色體標記RM27273和BS33之間，并與運兩個標記緊密連鎖，遺傳距離為 4.2CM。其提供不低于60%的抗性。進一步將江南晚與12個日本稻攝病鑒別品種雜交進行等 位性測定，結果表明，江南晚對北1菌系的主效抗性基因與12個鑒別品種所攜帶的已知抗病 基因是不等位的，將該基因命名為化-jnl。
[0038] 2.菌種培養和接種鑒定方法，參照李培富等（中國水稻科學，2007，21:579~584)。
[0039] 3. DNA提取方法:用CTAB法提取分離群體各單株的DNA。
[0040] 4.緊密連鎖分子標記的確定：
[0041 ] (1)標記多態性篩選：W親本江南晚和蘇御懦的DNA為模板，用Gramene網站上公布 的水稻SSR標記化ttp://www.gramene.org)，經PCR反應進行多態性分析。
[0042] (2)多態性標記的抗感池篩選:在重組自交系群體中，隨機選擇5個接種鑒定為抗 病表型的家系材料(抗病重組自交系）和5個接種鑒定為感病表型的家系材料(感病重組自 交系），提取DNA后分別混合，形成抗病池和感病池，對多態性標記進行篩選分析其與抗感之 間的關系，如果某一標記的抗病池電泳結果和抗病親本一致，感病池電泳結果和感病親本 一致，則說明該標記可能與抗病基因緊密連鎖。
[0043] (3)緊密連鎖分子標記的驗證:將可能與抗病基因緊密連鎖的分子標記分別在構 成抗感池的5個家系材料中進行驗證，如果連鎖關系確實存在時，再在所有的家系材料中進 行驗證，根據連鎖的多態性標記與對應的抗感表型，分析標記與基因間的重組頻率，計算出 標記對抗性的選擇效率。
[0044] PCR反應體系：體積為IOiil，其中10 X緩沖液（含Mg2+) 1. Oiil，分子標記引物對 (4pmol AU)化1，2.5mM dNTPs 0.，Taq酶（5UAU )0.化1，模板DNA( IOng/山）化1，加水至 1化1。反應程序為:DNA 94°C預變性5分鐘后，（94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸展1 分鐘)循環35次，最后72°C延伸10分鐘。W水稻的基因組DNA為模板，采用表2中的引物對在 biometre擴增儀上進行PCR擴增，擴增產物在8%非變性聚丙締酷胺凝膠（100mL聚丙締酷胺 溶液中含7.6克丙締酷胺和0.4克甲叉雙丙締酷胺)上進行電泳分離，然后在紫外透射儀上 照相，記錄結果。
[0045] (二)結果與分析：
[0046] 研究結果發現，SSR標記RM27273、BS33與抗病基因饑-jnl緊密連鎖（圖1，圖2)，在 親本中的擴增條帶大小如表2所示。在重組自交系284個家系材料中（332個配子中），選擇效 率計算方法如下：
[0047] SSR標記RM27273與抗病基因 Pb-jnl之間出現2個交換型配子，重組率僅為0.7%， 該標記對抗性的選擇效率達99.3% ;
[004引 SSR標記BS33與抗病基因饑-jnl之間出現1個交換型配子，重組率僅為0.35%，該 標記對抗性的選擇效率達99.65 % ;
[0049] SSR標記RM27273和BS33雙標記篩選的選擇效率為1-0.7%*0.35% =99.99% ;
[0050] 通過上述2個分子標記可W高效鑒定抗稻攝病基因 Pb-jnl存在與否，單標記選擇 效率均達到99.3 %，雙標記組合的選擇效率達99.99 %。可用于分子標記輔助選擇有效提高 水稻抗病品種的育種進程，控制育種群體規模。
[0051 ]表2.擴增分子標記的引物對及擴增條帶大小
[0化2]
【主權項】
1. 一種用于檢測與水稻稻瘟病抗性基因緊密連鎖的分子標記的引物對或引物對組，其 特征在于所述的引物對為引物對A或引物對B;所述的引物對組由引物對A和引物對B組成； 所述引物對A為由如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸片段和如SEQ ID NO.2所示的核苷酸片段組 成的引物對;所述引物對B為由如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸片段和如SEQ ID NO.4所示的 核苷酸片段組成的引物對。2. 權利要求1所述的引物對或引物對組在制備用于檢測或輔助檢測水稻抗稻瘟病基因 的試劑盒中的應用。3. -種用于檢測或輔助檢測水稻抗稻瘟病基因的試劑盒，其特征在于該試劑盒包含有 權利要求1所述的引物對或引物對組。4. 根據權利要求3所述的用于檢測或輔助檢測水稻抗稻瘟病基因的試劑盒，其特征在 于該試劑盒還包含有PCR技術常用的試劑。5. 權利要求1~4中任一所述的引物對、引物對組及試劑盒在檢測或輔助檢測水稻抗稻 瘟病基因或選擇水稻抗稻瘟病品種中的應用。6. -種檢測水稻抗稻瘟病基因或選擇水稻抗稻瘟病品種的分子標記方法，其特征在于 包括以下步驟： (1) 提取待測水稻樣品基因組DNA; (2) 以步驟（1)提取的基因組DNA為模板，采用權利要求1所述的引物對或引物對組進行 PCR擴增，獲得PCR產物； (3) 檢測PCR產物如果擴增出大小為117bp或/和162bp的分子標記片段，標志水稻樣品 中晚穗瘟抗性基因 Pb-jn 1存在，則待測的水稻樣品為抗稻瘟病品種或候選的抗稻瘟病品 種。7. 根據權利要求6所述的檢測水稻抗稻瘟病基因或選擇水稻抗稻瘟病品種的分子標記 方法，其特征在于所述PCR擴增的反應體系為：10 X含Mg2+的緩沖液1. ΟμL，4ρπιο1/μ1的引物 對或引物對組ΙμL，2.5mM dNTPs 0.2μ1，5UAU的Taq酶0. ΙμL，lOng/μΙ的水稻樣品基因組模 板DNA ΙμL，加水至10μ1。8. 根據權利要求6所述的檢測水稻抗稻瘟病基因或選擇水稻抗稻瘟病品種的分子標記 方法，其特征在于所述PCR擴增的反應程序為:94 °C預變性5分鐘后;94 °C變性30秒，55 °C退 火30秒，72°C延伸展1分鐘，循環35次;最后72°C延伸10分鐘。9. 權利要求6所述的方法在提高水稻抗稻瘟病品種育種進程中的應用。
【專利摘要】本發明屬于作物分子遺傳育種學領域，公開了一種與水稻江南晚穗瘟抗性基因緊密連鎖的分子標記及其應用，包括如下步驟：(1)取水稻樣品，提取水稻樣品基因組DNA；(2)利用RM27273和BS33中的任意一對分子標記的引物對，對水稻樣品基因組DNA進行PCR擴增，PCR擴增產物進行電泳檢測，如果擴增出對應大小的分子標記DNA片段，標志著Pb?jn1基因的存在。通過本發明提供的水稻穗瘟抗性基因Pb?jn1的分子標記可以檢測水稻江南晚及其雜交、回交和復交后代是否含有該基因，可預測其對稻瘟病的抗性水平，大大提高水稻抗穗瘟材料的選擇效率，加快抗病育種進程。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105713983
【申請號】CN201610250371
【發明人】鮑永美, 張紅生, 王瑞森, 黃驥, 王建飛, 王州飛, 程金平
【申請人】南京農業大學