間充質干細胞培養試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于干細胞培養領域，具體涉及一種間充質干細胞培養試劑盒。
【背景技術】
[0002]間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干細胞家族的重要成員，來源于發育早期的中胚層和外胚層。MSC最初在骨髓中發現，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調控和自我復制等特點而日益受到人們的關注。如間充質干細胞在體內或體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復。
[0003]間充質干細胞包括臍帶間充質干細胞和骨髓間充質干細胞。
[0004]臍帶間充質干細胞是一類具有自我更新、增殖和多向分化潛能的干細胞，具有來源廣泛、易于采集、保存和運輸、無異體排斥、避免倫理爭議等諸多優點。流式細胞儀分析發現臍帶間充質干細胞高表達間質細胞標志(⑶44、CD105)、整合素受體(⑶29、CD49b、⑶49c、⑶51)、不表達造血系標志(⑶34、CD45)白細胞抗原HLA-DR和內皮細胞標志CD31。臍帶間充質干細胞在體內外可以分化為骨細胞、軟骨細胞、肝細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞以及神經元細胞等。目前人臍帶間充質干細胞在組織工程骨、人工血管以及基因治療等臨床應用研究中已逐漸深入，并已顯示出廣闊的應用前景。目前，對臍帶間充質干細胞的分離培養、擴增還沒有統一的標準，存在純度低、原代培養時間長等缺點。各種類型的成纖維成體干細胞擴增一般在2?3天開始進入指數式生長，相差不大，而原代細胞由于組織來源不同，出現細胞克隆時間差異較大，所以，原代細胞傳代時間是分離得到目的細胞的關鍵。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種能夠提高間充質干細胞原代細胞傳代時間的培養試劑盒，以使間充質干細胞多次傳代后依然保持有細胞全能性。
[0006]本發明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現的:
[0007]—種間充質干細胞培養試劑盒，包括細胞培養液A和細胞培養液B;
[0008]所述細胞培養液A為含80?120ng/ml細胞因子LIF、80?120ng/ml細胞因子bFGF和20?30yg/ml Granulodiene A的Knockout-DMEM培養基；
[0009]所述細胞培養液B為胎牛血清。
[0010]進一步地，所述細胞培養液A為含100ng/ml細胞因子LIF、100ng/ml細胞因子bFGF和25yg/ml Granulodiene A的Knockout-DMEM培養基。
[0011]進一步地，所述間充質干細胞為臍帶間充質干細胞。
[0012]進一步地，所述間充質干細胞為骨髓間充質干細胞。
[0013]進一步地，所述細胞培養液A和細胞培養液B均為無菌，并各自獨立包裝。
[0014]進一步地，所述的間充質干細胞培養試劑盒還包括細胞洗滌液和細胞消化液;所述細胞洗滌液為生理鹽水;所述細胞消化液為Collagenase II水溶液。
[0015]進一步地，所述細胞消化液為濃度為0.2g/100ml的Collagenase II水溶液。
[0016]進一步地，所述生理鹽水由氯化鈉和水組成，氯化鈉的濃度為0.9g/100ml。
[0017]進一步地，所述細胞培養液A、細胞培養液B、細胞洗滌液和細胞消化液均為無菌，并各自獨立包裝。
[0018]上述間充質干細胞培養試劑盒在間充質干細胞培養中的應用。
[0019]本發明的優點:
[0020]本發明提供的培養試劑盒能夠提高間充質干細胞原代細胞傳代時間，使間充質干細胞多次傳代后依然保持有細胞全能性。
【具體實施方式】
[0021]下面結合實施例進一步說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明保護范圍。盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。
[0022]本發明化合物Granulodiene A的制備方法參見文獻:Sesquiterpenes from thesaprotrophic fungus Granulobasidium ve 11 ereum( El I i s&Cragin) Jill i ch，Phytochemistry 102(2014)197-204。
[0023]實施例1:試劑盒的制備
[0024]1、組分的制備
[0025]細胞洗滌液的制備:將9gNaCl溶于去離子水并用去離子水定容至1000ml，高壓滅囷后置于4 C冰箱內備用。
[0026]細胞培養液A的制備:將細胞因子LIF、細胞因子bFGF和化合物Granulodiene A溶于無菌Knockout-DMEM培養基(液體)，細胞因子LIF的濃度為100ng/ml，細胞因子bFGF的濃度為100ng/ml，化合物Granulodiene A的濃度為25yg/ml。置于4°C冰箱內備用。
[0027]細胞培養液B為無菌胎牛血清，置于-20V冰箱內備用。
[0028]細胞消化液:將Collagenase II溶于去離子水使CollagenaseII的濃度為0.2g/100ml，置于4°C冰箱內備用。
[0029]2、組分的分裝以及試劑盒的制備
[0030]用于分離臍帶間充質干細胞的試劑盒(I次/盒)由獨立包裝的如下組分組成:I瓶細胞洗滌液(10ml/瓶)、I瓶細胞培養液A(80ml/瓶)，I瓶細胞培養液B(20ml/瓶)和I瓶細胞消化液(10ml/瓶)。
[0031]實施例2:試劑盒的制備，與實施例1對比，僅細胞培養液A中不添加GranulodieneA
[0032]1、組分的制備
[0033]細胞洗滌液的制備:將9gNaCl溶于去離子水并用去離子水定容至1000ml，高壓滅囷后置于4 C冰箱內備用。
[0034]細胞培養液A的制備:將細胞因子LIF和細胞因子bFGF溶于無菌Knockout-DMEM培養基(液體)，細胞因子LIF的濃度為100ng/ml，細胞因子bFGF的濃度為100ng/ml。置于4°C冰箱內備用。
[0035]細胞培養液B為無菌胎牛血清，置于-20V冰箱內備用。
[0036]細胞消化液:將Collagenase II溶于去離子水使CollagenaseII的濃度為0.2g/100ml，置于4°C冰箱內備用。
[0037]2、組分的分裝以及試劑盒的制備
[0038]用于分離臍帶間充質干細胞的試劑盒(I次/盒)由獨立包裝的如下組分組成:I瓶細胞洗滌液(10ml/瓶)、I瓶細胞培養液A(80ml/瓶)，I瓶細胞培養液B(20ml/瓶)和I瓶細胞消化液(10ml/瓶)。
[0039]實施例3:臍帶間充質干細胞的分離與快速擴增培養
[0040]分別用實施例1(實驗組)和實施例2(對照組)制備的試劑盒進行臍帶間充質干細胞的分離與快速擴增培養。
[0041 ]細胞培養液的制備:將細胞培養液A和細胞培養液B按照5:1的體積比混合。
[0042]1、無菌收集離體臍帶(來源為人)，浸沒于含雙抗的細胞培養液(含雙抗的細胞培養液由細胞培養液、青霉素和鏈霉素組成，青霉素的濃度為lg/100ml、鏈霉素的濃度為Ig/10ml)中，玻璃容器密封運輸至實驗室。
[0043]2、在生物安全柜中剪取約1cm長的臍帶，用細胞洗滌液清洗血污；用解剖刀去除外被羊膜、2條臍靜脈和I條臍動脈，得到華爾通氏膠(動靜脈之間的胚胎粘液樣結締組織)。
[0044]3、將華爾通氏膠剪碎成肉糜狀，轉移到離心管中，加入20ml細胞消化液，混勻37°C過夜消化(約6小時)；吸取液相、離心(2500rpm，5分鐘)，收集沉淀(原代細胞)。
[0045]4、用細胞培養液重懸原代細胞，接種于0.2%明膠包被的培養瓶中(每16個細胞接種到I個25cm2培養瓶)，置于37°C,5%CO2培養箱中培養;持續觀察細胞貼壁生長情況，細胞多數貼壁后(約24小時)更換為新的細胞培養液，除去未貼壁細胞和雜質，以后每3天半量更換細胞培養液(半量即原細胞培養液體積的一半;也可每4天半量更換細胞培養液)，原代細胞培養7天后細胞密度達到90%。
[0046]5、原代細胞培養至細胞密度達到90%后進行第一次傳代，之后均在細胞密度達到90% (培養2?3天)時進行傳代;繼續傳代20次(即第一次傳代后，又連續傳代了 19次)。
[0047]實施例4:細胞純度測定
[0048]分別取實施例1(實驗組)和實施例2(對照組)制備的試劑盒按實施例3方法分離培養傳代20次的細胞進行流式細胞儀檢測，以驗證細胞樣本的純度。
[0049]通過流式細胞儀分別檢測第20次傳代后的細胞樣本的表面抗原CD29的圖譜，實驗組細胞樣本的陽性率為95.7%，而對照組細胞樣本的陽性率僅為79.4%o結果表明，采用本發明提供的細胞培養液將原代細胞傳代20次后，細胞的純度依然非常高。
[0050]實施例5:全能性驗證
[0051]為證實臍帶間充質干細胞的多向分化潛能，本實施例對實施例3中第15次傳代后的細胞樣本向成骨細胞和脂肪細胞分化的潛能進行鑒定。
[0052]1、向成骨細胞分化
[0053]將細胞樣本以3000cells/cm2接種，然后加入成骨誘導培養基(向Knock out-DMEM培養基中添加地塞米松至ΙΟΟηΜ、抗壞血酸至50μΜ、β-甘油磷酸鈉至10mM)，于37°C、5%⑶2培養箱中培養，大約5?7天后觀察。
[0054]結果實驗組可觀察到如下現象:細胞匯合成單層，細胞突起互相連接，并可重疊生長而不發生接觸抑制；重疊生長的細胞逐漸形成結節狀，隨后膠原堆積及鈣鹽沉積，細胞間出現致密的圓形不透光團塊物質，表明細胞樣本可以向成骨細胞分化。
[0055]對照組未觀察到實驗組所見現象，說明使用實施例2制備的試劑盒所培養的臍帶間充質干細胞傳代15代后基本喪失繼續分化為成骨細胞的能力。
[0056]2、向脂肪細胞分化
[0057]將細胞樣本以3000cells/cm2接種，然后加入成脂肪誘導培養基(向Knockout-DMEM培養基中添加地塞米松至ΙμΜ、甲基-異丁基黃嘌呤至0.5mM、胰島素至10yg/ml、吲哚美辛至ΙΟΟμΜ)，持續培養。
[0058]結果實驗組可見如下現象:第2天細胞匯合成單層;2周后部分細胞形態變圓，胞漿內出現亮圓形脂滴;隨著時間延長，圓形細胞逐漸增多。表明細胞樣本可向脂肪細胞分化。
[0059]對照組未觀察到實驗組所見現象，說明使用實施例2制備的試劑盒所培養的臍帶間充質干細胞傳代15代后基本喪失繼續分化為脂肪細胞的能力。
[0060]以上結果表明，采用本發明提供的細胞培養液將臍帶間充質干細胞傳代15次后，細胞仍然維持很高的純度和良好的全能性。
[0061]采用本發明提供的細胞培養液培養骨髓間充質干細胞，也取得了同樣好的效果。
[0062]上述實施例的作用在于說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明的保護范圍。本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和保護范圍。
【主權項】
1.一種間充質干細胞培養試劑盒，其特征在于:包括細胞培養液A和細胞培養液B; 所述細胞培養液A為含80?120ng/ml細胞因子LIF、80?120ng/ml細胞因子bFGF和20?30yg/ml GranulodieneA的Knockout-DMEM培養基； 所述細胞培養液B為胎牛血清。2.根據權利要求1所述的間充質干細胞培養試劑盒，其特征在于:所述細胞培養液A為含 100ng/ml細胞因子LIF、100ng/ml細胞因子bFGF和25yg/ml Granulodiene A的Knockout-DMHM培養基。3.根據權利要求1所述的間充質干細胞培養試劑盒，其特征在于:所述間充質干細胞為臍帶間充質干細胞。4.根據權利要求1所述的間充質干細胞培養試劑盒，其特征在于:所述間充質干細胞為骨髓間充質干細胞。5.根據權利要求1所述的間充質干細胞培養試劑盒，其特征在于:所述細胞培養液A和細胞培養液B均為無菌，并各自獨立包裝。6.根據權利要求1所述的間充質干細胞培養試劑盒，其特征在于:還包括細胞洗滌液和細胞消化液;所述細胞洗滌液為生理鹽水;所述細胞消化液為Collagenase II水溶液。7.根據權利要求6所述的間充質干細胞培養試劑盒，其特征在于:所述細胞消化液為濃度為0.2g/100ml的Collagenase II水溶液。8.根據權利要求6所述的間充質干細胞培養試劑盒，其特征在于:所述生理鹽水由氯化鈉和水組成，氯化鈉的濃度為0.9g/100ml。9.根據權利要求6所述的間充質干細胞培養試劑盒，其特征在于:所述細胞培養液A、細胞培養液B、細胞洗滌液和細胞消化液均為無菌，并各自獨立包裝。10.權利要求1?9任一所述間充質干細胞培養試劑盒在間充質干細胞培養中的應用。
【專利摘要】本發明公開了間充質干細胞培養試劑盒，包括細胞培養液A和細胞培養液B；所述細胞培養液A為含80～120ng/ml細胞因子LIF、80～120ng/ml細胞因子bFGF和20～30μg/mlGranulodiene A的Knockout?DMEM培養基；所述細胞培養液B為胎牛血清。采用本發明提供的細胞培養液將臍帶間充質干細胞傳代15次后，細胞仍然維持很高的純度和良好的全能性。采用本發明提供的細胞培養液培養骨髓間充質干細胞，也取得了同樣好的效果。這些結果表明，本發明提供的培養試劑盒能夠提高間充質干細胞原代細胞傳代時間，使間充質干細胞多次傳代后依然保持有細胞全能性。
【IPC分類】C12N5/0775
【公開號】CN105713872
【申請號】CN201610201894
【發明人】趙順英
【申請人】趙順英