七重pcr快速篩查檢測商業化應用轉基因油菜的引物及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于轉基因檢測技術領域，設及屯重PCR快速篩查檢測商業化應用轉基因 油菜的引物及檢測方法。
【背景技術】
[0002] 根據加拿大轉基因數據庫W及歐洲轉基因生物指南提供的信息，選擇目前已商業 化種植的16個轉基因油菜轉化事件作為本發明的研究對象。隨著轉基因油菜在市場上所占 份額的不斷增加給轉基因檢測帶來更多需求。同時，轉基因作物的多樣性和復雜性，也給轉 基因產品的檢測帶來了挑戰。如何快速、準確、科學地對樣品進行轉基因鑒定，是當前轉基 因檢測行業所面臨的一個關鍵問題。轉基因篩查是轉基因檢測中最基礎的一步，篩查得到 的正確結果，可有效指導轉化事件的進一步鑒定。
[0003] 在轉基因植物及產品檢測技術中主要有蛋白質檢測和核酸檢測兩類，核酸檢測技 術中普通PCR技術在實際檢測需求中運用較多，其特點為敏感、快速、簡便，主要用于檢測轉 基因作物及產品中的單個外源基因。然而在產品檢測時，往往需要對多個外源基因進行檢 測來確認其含哪些轉基因成分及是否為轉基因產品，用普通PCR技術分別對運些外源基因 進行檢測時，存在時間和試劑耗費大、操作繁瑣等缺點。
[0004] 多重PCR是在普通PCR基礎上發展的一種新型擴增技術，即可在一個反應體系中加 入兩對或W上引物，同時擴增多個核酸片段，解決了普通PCR存在的缺點。多重PCR已在病理 學、微生物、基因組學等學科中得到了廣泛應用。多重PCR檢測技術主要利用多重擴增產生 長度不同的擴增片段，采用瓊脂糖凝膠電泳或毛細管凝膠電泳分辨出長度不同的片段。普 通瓊脂糖凝膠電泳存在操作繁雜，試驗周期長，易造成試驗室污染等缺點，而毛細管凝膠電 泳可在PCR后直接上機電泳，無需其他點樣等操作，節約時間，減少污染。可W說多重PCR相 比單一PCR反應更快捷、更經濟，只需要1次PCR反應就能同時檢測多個祀標基因，運種方法 具有更大的可靠性和適應性，并能降低檢測成本。
[0005] 目前關于已商業化應用的轉基因油菜的檢測技術，主要集中在單一調控元件或單 個轉化事件PCR方法和標準，也有學者針對目前已商業化應用的轉基因油菜進行單一PCR篩 查檢測技術研究，但尚無針對目前已商業化應用的轉基因油菜的多重PCR篩查檢測技術。通 過對目前已商業化應用的轉基因油菜基因元件分析發現，每種轉基因油菜都含有多個外源 基因元件，為了增加檢測的可靠性，開發一種能同步篩查檢測已商業化應用的轉基因油菜 外源基因至少兩次的多重PCR檢測方法就顯得非常有必要。本發明正是提供了一種可同步 篩查檢測已商業化應用的轉基因油菜外源基因至少兩次的多重PCR檢測方法，增加了檢測 方法的可靠性，彌補了現有技術的缺點。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的主要是提供一種準確、快速、可靠、省時省力的多重PCR快速篩查商 業化應用的轉基因油菜外源基因至少兩次的多重PCR檢測方法。
[0007]本發明通過下述技術方案實現：
[000引屯重PC財夾速篩查檢測商業化應用轉基因油菜的引物，包括W下引物序列：
[0009] pat-F：5'-CGCGGTTTGTGATATCGTTAAC-3'；
[0010] pat-R:5，-TCTTGCAACCTCTCTAGATCATCAA-3，；
[0011] CruA-F:5'-GGCCAGGGCTTCCGTGAT-3';
[0012] CruA-R:5'-CTGGTGGCTGGCTAAATCGA-3';
[0013] P-FMV 35S-F:5'-CAGCATTCCAGATTGGGTTCA-3';
[0014] P-FMV 35S-R:5'-CTTTTGGCTAATGGTTTGGAGAC-3';
[0015] T-NOS-F:5'-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3';
[0016] T-NOS-R:5'-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3';
[0017] P-CaMV 35S-F:5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3';
[0018] P-CaMV 35S-R:5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3';
[0019] CP4-EPSPS-F：5'-GACTTGCGTGTTCEGGCTT-3'；
[0020] CP4-EPSPS-R:5'-AACACCGTTGAGCTTGAGA-3';
[0021] bar-F:5 '-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3 '；
[0022] bar-R:5，-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3，。
[0023] 屯重PC財夾速篩查檢測商業化應用轉基因油菜的方法，包括W下步驟：
[0024] (1)合成W下引物：
[00 巧]pat-F:5'-CGCGGTTTGTGATATCGTTAAC-3';
[00%] pat-R:5 '-TCTTGCAACCTCTCTAGATCATCAA-3 '；
[0027] CruA-F:5'-GGCCAGGGCTTCCGTGAT-3';
[0028] CruA-R:5'-CTGGTGGCTGGCTAAATCGA-3';
[00巧]P-FMV 35S-F:5，-CAGCATTCCAGATTGGGTTCA-3，；
[0030] P-FMV 35S-R:5'-CTTTTGGCTAATGGTTTGGAGAC-3';
[0031] T-NOS-F：5'-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3'；
[0032] T-NOS-R:5'-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3';
[0033] P-CaMV 35S-F:5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3';
[0034] P-CaMV 35S-R:5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3';
[0035] CP4-EPSPS-F:5'-GACTTGCGTGTTCEGGCTT-3';
[0036] CP4-EPSPS-R:5'-AACACCGTTGAGCTTGAGA-3';
[0037] bar-F:5 '-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3 '；
[0038] bar-R:5，-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3，；
[0039] (2)制備待測DNA稀釋液；
[0040] (3)配制PCR反應體系；
[0041 ] (4)進行 PCR 檢測；
[0042] (5)取PCR反應產物進行毛細管電泳。
[0043] 進一步地，步驟（1)中pat引物的濃度為0.3皿ol/L，CruA引物的濃度為0.05皿〇1/ UP-CaMV 35S引物和bar引物的濃度為0.15皿ol/L，CP4-EPSPS引物的濃度為0.25皿ol/L， P-FMV 35S引物和T-NOS引物的濃度均為0.2曲lol/l;步驟(2)所述制備的DNA稀釋液的濃度 為 50ng/]iL。
[0044] 再進一步地，所述PCR反應條件為:94°C變性5min;然后進入35個循環，94°C 30s，56 1：3〇3,721：3〇3;循環結束后72°(：延伸3111111。
[0045] 再進一步地，引物退火溫度為58°C。
[0046] 本發明具有W下優點及有益效果：
[0047] 本發明在同一次PCR反應中可W同時檢出油菜內標基因和轉基因油菜中使用頻率 較高的6種外源基因。
[0048] 本發明采用毛細管電泳儀進行結果分析，不僅分辨率可達幾個堿基(普通凝膠電 泳幾乎不能將其分開），而且相對普通凝膠電泳的分離效果更好，并且只需要一次電泳分析 即可得知樣品是否含有轉基因油菜中使用頻率較高的6種外源基因。
[0049] 本發明僅一次PCR反應可快速、準確檢測出隨機選擇的目前已商業化轉基因油菜 中所含有的外源基因，且成本低、準確率高，屯重PCR技術體系也能有效控制假陰性和假陽 性的出現。
【附圖說明】
[0050] 圖1為本發明屯重PCR引物濃度梯度和退火溫度梯度正交優化試驗擴增圖譜。
[0051] 圖2為本發明屯重PCR靈敏度試驗擴增圖譜。
[0化2]圖3為本發明屯重PCR已知樣品驗證擴增圖譜。
【具體實施方式】
[0053] 下面結合實施例對本發明做進一步的說明，但本發明的實施方式并不限于此。
[0054] 實施例
[0055] 屯重PC財夾速篩查檢測商業化應用轉基因油菜的方法，包括W下步驟：
[0056] (1)合成W下引物：
[0化 7] pat-F：5'-CGCGGTTTGTGATATCGTTAAC-3'；
[005引 pat-R:5 '-TCTTGCAACCTCTCTAGATCATCAA-3 '；
[0059] CruA-F:5'-GGCCAGGGCTTCCGTGAT-3';
[0060] CruA-R:5'-CTGGTGGCTGGCTAAATCGA-3';
[0061 ] P-FMV 35S-F:5'-CAGCATTCCAGATTGGGTTCA-3';
[0062] P-FMV 35S-R:5'-CTTTTGGCTAATGGTTTGGAGAC-3';
[0063] T-NOS-F:5'-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3';
[0064] T-NOS-R:5'-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3';
[00化]P-CaMV 35S-F:5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3';
[0066] P-CaMV 35S-R:5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3';
[0067] CP4-EPSPS-F:5'-GACTTGCGTGTTCEGGCTT-3';
[006引 CP4-EPSPS-R:5'-AACACCGTTGAGCTTGAGA-3';
[0069] bar-F:5 '-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3 '；
[0070] bar-R:5，-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3，；
[0071] (2)制備待測DNA稀釋液；
[0072] (3)配制PCR反應體系；
[0073] (4)進行 PCR 檢測；
[0074] (5)取PCR反應產物進行毛細管電泳。
[00對其中，步驟（1)中pat引物的濃度為0.3皿01 /L，CruA引物的濃度為0.05皿01 /L，P-CaMV 35S引物和bar引物的濃度為0.15皿ol/L，CP4-EPSPS引物的濃度為0.25皿ol/L,P-FMV 35S引物和T-NOS引物的濃度均為0.2wiiol/l;步驟(2)所述制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/ 化;所述PCR反應條件為:94°C變性5min;然后進入35個循環，941：303,561：303,721：303;循 環結束后72°C延伸3min;引物退火溫度為58°C。
[0076] 為了驗證本發明的篩查檢測效果W及相應的參數選取的真實性，對各步驟進行具 體的驗證試驗，其具體情況如下：
[0077] (1)擴增檢測引物的合成：
[007引表1引物序列信息表
[0079]
[0080] (2)待測轉基因 DNA的小量提取：
[0081] 采用天根生化科技(北京)有限公司生產的植物基因組DNA提取試劑盒(DP305)提 取樣品基因組DNA，稱取轉基因粉末樣品200mg，加入70iil洗脫液TE洗脫樣品基因組DNA，其 他提取步驟參照試劑盒說明書操作。
[0082] 采用化ermo Nano Drop 1000紫外分光光度計測定樣品基因組DNA的濃度和純度， 并將樣品DM濃度稀釋至SOngAiL待測。
[0083] (3)屯重 PCR
[0084] ①引物濃度梯度和引物退火溫度梯度正交試驗：
[0085] PCR反應體系組成為：PCR Master Mix終濃度為IX，CruA、pat、P-FMV 35S、T-N0S、 P-化MV 35S、CP4-EPSPS、bar引物終濃度梯度見表2，待測DNA模板3.化L，補充d地2〇至體積 為2如L。
[0086] 表2反應體系引物終濃度(皿ol/L)梯度
[OORTl
[0088] 在定性PCR儀上運行如下反應程序:94 °C變性5min;然后進入35個循環，94 °C 30s， 退火 303,721：303;循環結束后72°(：延伸5111111。退火溫度梯度為50°(：、54°(：、56°(：、58°(：、60 °C、64°C。引物濃度梯度和引物退火溫度梯度采用正交設計進行試驗。結果見附圖1，其中泳 道M:size maker;泳道1-6對應終濃度梯度1:泳道7-12對應終濃度梯度2;泳道13-18對應終 濃度梯度3;泳道19-24對應終濃度梯度4;泳道25-30對應終濃度梯度5;泳道31-35對應終濃 度梯度6;其中，泳道1-6，、泳道7-12、泳道13-18、泳道19-24、泳道25-30、泳道31-35退火溫 度依次為50 °C、54°C、56 °C、58 °C、60 °C、64°C。
[0089] 結論：由圖I結果可知：CruA、pat、P-FMV 35S、T-N0S、P-CaMV 35S、CP4-EPSPS、bar 引物終濃度(皿ol/L)為終濃度3及引物退火溫度為58°C時，各外源基因特異性條帶擴增效 率更高更一致。
[0090] ②靈敏度試驗：
[0091] PCR反應體系組成為:PCR Master Mix終濃度為1 X，引物濃度配比參照引物濃度 梯度試驗結果，待測DNA模板終濃度(ng/化)梯度1.5、1、0.3、0.1、0.03,補充d地2〇至體積為 2!5化。
[0092] 在定性PCR儀上運行如下反應程序:94 °C變形5min;然后進入35個循環，94 °C 30s， 58°C30s，72°C30s;循環結束后72°C延伸5min。結果見附圖2,其中泳道M:size maker,泳道 1-5分別對應濃度梯度1.5、1、0.3、0.1、0.03,泳道6為dd也0對照。
[0093] 結論：由圖2結果可知，模板濃度低至0.：3ngAiL條件下，燈^、口曰*、口斗1￥355、1'-N0S、P-CaMV 35S、CP4-EPSPS、bar的特異性條帶結果能被清晰判斷。
[0094] ③已知樣品驗證試驗：
[0095] PCR反應體系組成為:PCR Master Mix終濃度為I X，引物濃度配比參照引物濃度 梯度試驗結果，待測DNA模板3.化L，補充d地2〇至體積為化化。
[0096] 在定性PCR儀上運行如下反應程序:94 °C變性5min;然后進入35個循環，94 °C 30s， 56°C30s，72°C30s;循環結束后72°C延伸5min。結果見附圖3,其中泳道M:size maker,泳道 1-14:轉基因油菜混合陽性(GT73+RF3巧45)、轉基因油菜RF1、RF2、RF3、MS1、MS8、轉基因玉 米 GA2UM0N810、化 1UM0N863、轉基因棉花 M0N1445、LLC0TT0N25、轉基因水稻 TT51-1、轉基 因大豆GTS40-3-2，15: d地2〇對照。
[0097] 結論:由圖3結果可知，各已經樣品都能檢測到相關特異性條帶。
【主權項】
1. 七重PCR快速篩查檢測商業化應用轉基因油菜的引物，其特征在于，包括以下引物序 列： pat-F:5 '-CGCGGTTTGTGATATCGTTAAC-3 '； pat-R:5 '-TCTTGCAACCTCTCTAGATCATCAA-3 '； CruA-F:5，-GGCCAGGGCTTCCGTGAT-3，； CruA-R:5，-CTGGTGGCTGGCTAAATCGA-3，； P-FMV 35S-F:5 '-CAGCATTCCAGATTGGGTTCA-3 '； P-FMV 35S-R:5 '-CTTTTGGCTAATGGTTTGGAGAC-3 '； T-NOS-F：5'-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3'； T-NOS-R:5 '-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3 '； P-CaMV 35S-F:5 '-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3 '； P-CaMV 35S-R:5 '-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3 '； CP4-EPSPS-F:5 '-GACTTGCGTGTTCEGGCTT-3 '； CP4-EPSPS-R:5 '-AACACCGTTGAGCTTGAGA-3，； bar-F: 5 '-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3 '； bar-R: 5 '-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3 '。2. 七重PCR快速篩查檢測商業化應用轉基因油菜的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 合成以下引物： pat-F:5 '-CGCGGTTTGTGATATCGTTAAC-3 '； pat-R:5 '-TCTTGCAACCTCTCTAGATCATCAA-3 '； CruA-F:5，-GGCCAGGGCTTCCGTGAT-3，； CruA-R:5，-CTGGTGGCTGGCTAAATCGA-3，； P-FMV 35S-F:5 '-CAGCATTCCAGATTGGGTTCA-3 '； P-FMV 35S-R:5 '-CTTTTGGCTAATGGTTTGGAGAC-3 '； T-NOS-F：5'-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3'； T-NOS-R:5 '-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3 '； P-CaMV 35S-F:5 '-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3 '； P-CaMV 35S-R:5 '-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3 '； CP4-EPSPS-F:5 '-GACTTGCGTGTTCEGGCTT-3 '； CP4-EPSPS-R:5 '-AACACCGTTGAGCTTGAGA-3，； bar-F: 5 '-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3 '； bar-R: 5 '-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3 '； (2) 制備待測DNA稀釋液； (3) 配制PCR反應體系； (4) 進彳丁PCR檢測； (5 )取PCR反應產物進行毛細管電泳。3. 根據權利要求2所述的七重PCR快速篩查檢測商業化應用轉基因油菜的方法，其特征 在于，步驟（1)中pat引物的濃度為0.3ymol/L，CruA引物的濃度為0.05ymol/L，P-CaMV 35S 引物和匕31引物的濃度為0.15以111〇1/1，0?44?5?3引物的濃度為0.254111〇1/1，？-卩]/^355引 物和T-NOS引物的濃度均為0.2ymol/L;步驟(2)所述制備的DNA稀釋液的濃度為50ngAiL。4. 根據權利要求2或3所述的七重PCR快速篩查檢測商業化應用轉基因油菜的方法，其 特征在于，所述PCR反應條件為:94°C變性5min;然后進入35個循環，94°C 30s，56 °C30s，72°C 30s;循環結束后72°C延伸3min。5. 根據權利要求4所述的七重PCR快速篩查檢測商業化應用轉基因油菜的方法，其特征 在于，引物退火溫度為58°C。
【專利摘要】本發明公開了一種快速篩查檢測商業化應用的轉基因油菜外源基因至少兩次的多重PCR檢測方法，所述引物具有較強的特異性，能夠用于多重PCR篩查檢測分析。所述檢測方法提供了一種檢測快速、操作簡便、擴增性能好、靈敏度高的轉基因篩查檢測方法，實現了轉基因油菜多個外源基因同步檢測。利用毛細管電泳對PCR擴增產物進行分析，其片段大小區分率可達數個堿基，分辨率高。本發明的引物和檢測方法為轉基因植物提供了一種快速、有效、可靠的高通量篩查檢測方法。本發明建立的多重PCR反應體系不僅可以檢測轉基因油菜外源基因，而且還能擴增到其他轉基因植物的篩查檢測。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105713977
【申請號】CN201610189016
【發明人】尹全, 李憶, 宋君, 張富麗, 劉勇, 雷紹榮, 郭靈安, 王東, 劉文娟, 常麗娟
【申請人】四川省農業科學院分析測試中心