一株耐酸細菌纖維素高產菌株及用該菌株制備可食用細菌纖維素的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及食品生物技術領域，尤其是設及一種細菌纖維素高產菌及用該菌株制 備可食用細菌纖維素。
【背景技術】
[0002] 細菌纖維素 (Bacterial cellulose,BC)是由多種細菌新陳代謝的產物形成的不 含木素、半纖維素 W及其他抽提物的高結晶度的S維網狀結構。運種結構使得BC有著一些 特有的特性.如高純度、高結晶度、較大的機械強度、高保水值、抗菌性、無毒性、生物相容性 和生物降解性等，從而在多個領域有著廣泛應用，如生物醫藥與組織工程、食品、電學、造 紙、功能材料等。
[0003] 細菌纖維素屬于水不溶性膳食纖維，它可W改變食物的流變狀態，可W生產低熱 量、低膽固醇的食物。現代研究人員對其作為食品配料的添加應用很多但是對其口感的研 究很少。細菌纖維素作為纖維素食用時會有初性、難切斷、難巧嚼的特點，因此制備高巧嚼 性、口感滑爽、脆嫩、細膩而有彈性的可食用細菌纖維素也是研究的難點。此外，現代眾多研 究者對細菌纖維素菌株篩選、原料選擇、發酵工藝等方面做了大量研究，對于細菌纖維素高 產菌的選育、發酵基質、發酵工藝的研究報道很少。本發明基于運一現狀，篩選出一株適用 于工業化生產的細菌纖維素產生菌株，并W此菌株為出發點研究可食用細菌纖維素的制備 方法。
【發明內容】
[0004] 針對現有技術存在的上述問題，本申請人提供了一株耐酸細菌纖維素高產菌株及 用該菌株制備可食用細菌纖維素的方法。該菌株具有高的抑適應能力，在抑2.5~3.0條件 下能良好生長;該菌株在含有挪漿、牛奶、豆奶等乳品培養基中可W產生高品質可食用膳食 纖維，也可W用該菌株生產細菌纖維素面膜W及醫用材料。
[0005] 本發明的技術方案如下：
[0006] -株生產細菌纖維素的菌株，所述菌株的分類命名為木葡糖醋酸桿菌JXla 化omagataeibacter xylinus JXla),保藏單位為中國典型培養物保藏中屯、，保藏編號為 CCTCC NO:M 2015195,保藏日期為2015年4月6日，保藏地址為中國，武漢，武漢大學。
[0007] -種所述的生產細菌纖維素的菌株的篩選方法，篩選基質為發酵挪漿，篩選培養 基為：葡萄糖：2 ~4%;酵母膏：0.5 ~1.0 % ;K 出 P〇4:0.1~0.2% ;MgS〇4:0.15 ~0.25%;乙 醇：2~4%;CaC03:0.5~l%;瓊脂：1.5~2%，pH自然。余量為水。
[000引一種所述的菌株生產可食用細菌纖維素的方法，采用木葡糖醋酸桿菌JXla 化omagataeibacter xylinus JXla)作為發酵菌株，采用薦糖、葡萄糖為碳源，采用冰醋酸 為能源物質，采用挪漿、挪子粉、牛奶、奶粉、豆奶或豆粉為氮源。具體步驟為：
[0009] (1)初級種子培養:將木葡糖醋酸桿菌JXla化omagataeibacter xylinus JXla)的 斜面種子接到種子培養基，于28~35°C靜置培養17~30h，得到初級種子液；
[0010] (2)發酵種子培養:將初級種子液按5%~10%的接種量接種到發酵種子培養基 中，28~35°C，靜置培養1~3d，得到發酵種子液；
[0011] (3)淺盤靜置發酵:將發酵種子液按10%~30%的接種量接到發酵培養基中，裝液 高度1.5-2.5畑1，28~35°(：下靜置培養6~8(1。
[001 ^ 步驟（1)所述種子培養基組成如下：葡萄糖：2~4% ;酵母膏：0.5~1.0%瓜冊04: 0.1~0.2%;]/%5〇4:0.15~0.化％;乙醇：2~4%;
[0013] 步驟(2)所述發酵種子培養基組成如下：葡萄糖40-80g/L、挪漿5~20g/L、冰醋酸5 ~20g/L、酵母膏0.0 l~Ig/L、屯水合硫酸儀0.2~0.5g/L、p肥.5~3.0;
[0014] 步驟(3)所述發酵培養基組成如下:薦糖20-30g/L、葡萄糖20-30g/L、挪漿5~20g/ L、冰醋酸5~20g/L、大豆蛋白腺0.0 l~0.5g/L、屯水合硫酸儀0.2~0.5g/L。
[0015] 所述木葡糖醋酸桿菌JXla化omagataeibacterxylinusJXla)能夠在抑2.5~3.0 范圍內生長，生產細菌纖維素的發酵產量達到濕重500~700g/L，厚度在10~15mm。
[0016] 步驟(3)發酵得到的細菌纖維素在食用前需按W下方法處理后再食用:將步驟(3) 發酵得到的細菌纖維素切成方塊，常溫水攬拌浸泡2~4次，每次20~30min;將樣品在90~ 95°C下，用0.2~0.4%海藻酸鋼溶液攬拌20-30min，常溫下用0.2~0.4%乳酸巧靜置浸泡 20~30min。
[0017] 本發明有益的技術效果在于：
[0018]本發明提出了 一株挪果的高產菌株，木葡萄糖酸醋桿菌（Komagataeibacter 巧11皿3)將1曰為一株的新菌株，該菌株可^在9出％2.5-3.0條件下生長。用該菌株經初級種 子培養、發酵種子培養、淺盤靜置發酵生產細菌纖維素，產量達到500~700g/L。該菌利用挪 漿、牛奶等乳品為氮源生產的可食用細菌纖維素成本低、得率高、品質好，適合于大規模生 產。本發明制備的產品可應用于飲料、賠烤制品W及乳制品中。
【附圖說明】
[0019] 圖1為木葡萄糖酸醋桿菌化omaga1:aeibacte;r巧linus)JXla的16S rDNA序列表。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合實例進一步闡明本發明的內容，但本發明所保護的內容不僅僅局限于下 面的實例。
[0021] 實施例1:木葡萄糖酸醋桿菌JXla的篩選、分離及鑒定
[0022] 采集海南挪漿，使其自然發酵（即自然條件下自己發酵）15天，吸取Iml于IOml試管 中，再加入9ml無菌水制成1(T蛾度的菌懸液，依次進行稀釋，分別從l(T 2、l(r3濃度梯度稀釋 液中吸取20化1均勻涂布于平板，每個濃度梯度做S個對照，置于30°C培養箱觀察培養情 況，培養4天后，挑取其中菌落長勢良好、分布均勻的、產透明圈的全部單菌落，接種于固體 斜面培養基中，3(TC恒溫培養24~4她。待斜面長出豐厚的菌苔后，挑取一環斜面菌種接種 于IOml發酵培養液中3(TC恒溫培養7d，篩選出產膜快且膜厚實的菌株，劃線分離純化，若為 純培養物，轉入25%甘油，-2(TC保藏，若不是純培養物繼續劃線分離。分離培養基:葡萄糖 2% (w/v)，酵母膏0.5% (w/v)，K2HP04 0.1 % (w/v)，MgS〇4 0.15% (w/v)，乙醇2%，CaC〇3 l%(w/v)，瓊脂1.7%(w/v)，pH自然;斜面培養基：葡萄糖2%(w/v)，酵母膏0.5%(w/v)， K2HPO4 0.1%(w/v)，MgS〇4 0.15%(w/v)，乙醇2%，CaC〇3 l%(w/v)，瓊脂 1.7%(w/v)，pH自 然。
[0023] 木葡萄糖酸醋桿菌化omagataeibacter巧linus)JXla在固體培養基(葡萄糖2%， 酵母膏〇.5%，1(2冊〇4:0.1%，]/^5〇4:0.15%，乙醇2%，〔曰(：〇3:1%，瓊脂1.7%，抑自然）上生 長2地，呈淡黃色圓隆狀，質地較硬，不易挑取，革蘭氏染色呈陰性。顯微鏡16X100倍觀察 呈短桿狀、單細胞或成對。
[0024] 木葡萄糖酸醋桿菌JXla化omaga1:aeibacter xylinus JXla)菌株的遺傳學特征：
[0025] 提取新鮮培養菌體的基因作為模版，采用27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3)和 1492R(5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3)為引物進行細菌的16S rDNA序列擴增。木葡萄糖酸醋 桿菌化omagataeibacter xylinus)JXla 16S rDNA全長 1355bp，與NCBI GenBank中的已知 序列進行同源性比較，與Komagataeibacter X^inus同源性達99%，判定該菌為木葡糖醋 酸桿菌，如圖1所示。
[00%] 木葡萄糖酸醋桿菌JXla化omagataeibacter x}dinus JXla)菌株的理化性能見表 1所示。
[0027] 表1木葡萄糖酸醋桿菌化omaga1:aeibacte;r巧linus)JXla生理生化特性 [002引
[0029] 本菌株在培養時，其培養基的抑為2.5-3,證明本菌株的耐酸性良好;現有技術中 生產細菌纖維素的菌株的pH耐受性在5.0左右。
[0030] 實施例2:可食用細菌纖維素的制備方法
[0031] 將斜面種子調一環接種到IOmL試管中（種子培養基葡萄糖2%、酵母膏0.5%、 K2HPO4 0.2%、MgS〇4 0.15%、乙醇2% )，在30°C的恒溫培養箱中靜置培養2地，待表面長出 纖維膜后，按10%的接種量將其轉接到IOOmL的種子培養基中，在3(TC恒溫培養箱中靜置培 養3d，獲得初級種子液。
[0032] 發酵種子培養:將初級種子液按10%的接種量接種到發酵種子培養基中（葡萄糖 80g/L、挪漿20g/L、冰醋酸13g/L、大豆蛋白腺O.Olg/L、屯水合硫酸儀0.2旨/1、9肥.5)，在30 °C培養箱中靜置培養3d。
[0033] 淺盤靜置發酵:將發酵種子液按20%的接種量接到發酵培養基中（薦糖20g/L、葡 萄糖20g/L、挪漿20g/L、冰醋酸12g/L、大豆蛋白腺0.0 lg/L、屯水合硫酸儀0.2g/L)，混合均 勻后分裝到淺盤中，裝液量75%，在3(TC發酵房中靜置培養8d后收獲細菌纖維素。細菌纖維 素經刮膜處理后切成Icm3的顆粒，產量600g/L。目前現有技術中用只有的菌株來生產細菌 纖維素的最高產量能達到600g/L，遠低于本申請的發酵水平。
[0034] 將生產獲得的可食用細菌纖維素采用刮膜機去除表面挪油W及老皮，采用切粒機 將其切成lcmXlcm的方塊。采用常溫水浸泡3次，攬拌速度l(K)rpm，每次30min，直至浸泡水 抑高于4.5。將處理后的樣品在95°(：下，用0.4%海藻酸鋼溶液處理3〇111111，攬拌速度10化口111。 樣品清洗一遍后用0.4%乳酸巧處理30min，得到可食用纖維素顆粒。
[0035] 對可食用細菌纖維素進行感官評價，該顆粒賄單爽口，易下咽，無殘渣。
[0036] 本文所描述的具體實施案例僅作為對本發明精神和部分實驗做舉例說明。本發明 所述領域的技術人員可W對所描述的具體實施案例做出各種各樣的修改或補充或采用類 似的方式替代，但并不會偏離本發明的精神或者超越所附權利要求書所定義的范圍。
【主權項】
1. 一株生產細菌纖維素的菌株，其特征在于所述菌株的分類命名為木葡糖醋酸桿菌 JXla(Komagataeibacter xylinus JXla)，保藏單位為中國典型培養物保藏中心，保藏編號 為CCTCC NO:M 2015195,保藏日期為2015年4月6日，保藏地址為中國，武漢，武漢大學。2. -種權利要求1所述的生產細菌纖維素的菌株的篩選方法，其特征在于篩選基質為 發酵椰漿，篩選培養基為:葡萄糖:2~4% ;酵母膏:0.5~1.0 % ; K2HP〇4:0.1~0.2 % ;MgS〇4: 0.15~0.25%;乙醇：2~4%;0&0)3:0.5~1% ;瓊脂：1.5~2%4!1自然。3. -種權利要求1所述的菌株生產可食用細菌纖維素的方法，其特征在于采用木葡糖 醋酸桿菌JXla(Komagataeibacter xylinus JXla)作為發酵菌株，采用鹿糖、葡萄糖為碳 源，采用冰醋酸為能源物質，采用椰漿、椰子粉、牛奶、奶粉、豆奶或豆粉為氮源。4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于具體步驟為： (1) 初級種子培養:將木葡糖醋酸桿菌JXla(Komagataeibacter xylinus JXla)的斜面 種子接到種子培養基，于28~35°C靜置培養17~30h，得到初級種子液； (2) 發酵種子培養:將初級種子液按5 %~10 %的接種量接種到發酵種子培養基中，28 ~35°C，靜置培養1~3d，得到發酵種子液； (3) 淺盤靜置發酵:將發酵種子液按10%~30%的接種量接到發酵培養基中，裝液高度 1.5-2.5cm，28~35°C下靜置培養6~8d。 步驟(1)所述種子培養基組成如下:葡萄糖:2~4% ;酵母膏:0.5~1.0% ;K2HP〇4:0.1~ 0.2%;]/%5〇4:0.15~0.25%;乙醇：2~4% ; 步驟（2)所述發酵種子培養基組成如下：葡萄糖40-80g/L、椰漿5~20g/L、冰醋酸5~ 20g/L、酵母膏0 · 01~lg/L、七水合硫酸鎂0 · 2~0 · 5g/L、pH2 · 5~3 · 0; 步驟(3)所述發酵培養基組成如下：蔗糖20-30g/L、葡萄糖20-30g/L、椰漿5~20g/L、冰 醋酸5~20g/L、大豆蛋白胨0 · 01~0 · 5g/L、七水合硫酸鎂0 · 2~0 · 5g/L。5. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述木葡糖醋酸桿菌J X 1 a (Komagataeibacter xylinus JXla)能夠在ρΗ2·5~3.0范圍內生長，生產細菌纖維素的發 酵產量達到濕重500~700g/L，厚度在10~15mm。6. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于步驟(3)發酵得到的細菌纖維素在食用前需 按以下方法處理后再食用:將步驟(3)發酵得到的細菌纖維素切成方塊，常溫水攪拌浸泡2 ~4次，每次20~30min;將樣品在90~95°C下，用0.2~0.4%海藻酸鈉溶液攪拌20-30min， 常溫下用0.2~0.4%乳酸鈣靜置浸泡20~30min。
【專利摘要】一株生產細菌纖維素的菌株，所述菌株的分類命名為木葡糖醋酸桿菌JX1a(Komagataeibacter xylinus JX1a)，保藏單位為中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：M 2015195，保藏日期為2015年4月6日，保藏地址為中國，武漢，武漢大學。該菌株具有高的pH適應能力，在pH2.5～3.0條件下能良好生長；該菌株在含有椰漿、牛奶、豆奶等乳品培養基中可以產生高品質可食用膳食纖維，也可以用該菌株生產細菌纖維素面膜以及醫用材料。CCTCC NO：M 201519520150406
【IPC分類】A23L33/24, C12N1/20, C12P19/04, C12R1/01
【公開號】CN105713860
【申請號】CN201610141006
【發明人】于秋生, 馮偉, 白愛娟, 李珍妮, 徐暉
【申請人】江南大學, 于秋生, 福建省泉州喜多多食品有限公司