本發明涉及生物技術領域的一種超臨界co2流體色譜技術制備腸激酶工藝。
背景技術：
腸激酶(enterokinase，ek)是存在于哺乳動物十二指腸內的一種異源二聚體絲氨酸蛋白酶(ec3.4.21.9)。天然腸激酶分子量為150kda，由1條115kda重鏈和1條35kd輕鏈組成，重鏈負責在消化道細胞膜上的錨定以及與腸激酶融合蛋白的結合，輕鏈具有催化活性，可以特異性識別asp-asp-asp-asp-lys序列并在其羧基端切割，將腸激酶融合蛋白活化為腸激酶，從而啟動消化道內各種酶原活化的級聯反應。由于腸激酶識別位點的特異性和切割后在目標蛋白n末端不留任何氨基酸殘基，而且可以在ph4.5～9.5、溫度4～45℃范圍內特異性水解蛋白底物，因此它已經成為基因工程制藥領域融合蛋白切割的的首選工具酶，廣泛應用于各種重組蛋白、多肽藥物的加工成熟。天然的腸激酶來源有限，需從動物組織分離提取，因為從動物組織提取的腸激酶易殘留其他的蛋白酶，對融合蛋白的產生降解；另外，來源于動物組織的腸激酶可能帶有未知病毒等動物源性污染，為藥物蛋白生產增加了額外的風險。通過基因工程的方法生產的腸激酶輕鏈，具有天然腸激酶的全酶活性和特異性，在融合蛋白切割中被廣泛應用。已有報道的重組腸激酶輕鏈多為實驗室級別，存在大量宿主蛋白殘留、鎳離子殘留和其他雜質，而且作為原輔料進行藥物蛋白生產時，其殘留不能被有效檢測和控制，對藥用蛋白的生產中增加許多風險。
技術實現要素：
本發明提供一種重組腸激酶的制備方法，以克服現有技術中重組腸激酶輕鏈多為實驗室規模制備，存在大量宿主蛋白殘留、鎳離子殘留和其他雜質的技術缺陷。
本發明是通過以下技術方案實現的：
一種超臨界co2流體色譜技術制備腸激酶工藝，其特征在于：工藝步驟如下：
培養包含腸激酶基因的工程菌并誘導腸激酶基因表達，具體為：接種重組工程菌陽性克隆到lb培養基中，于30-40℃下搖床振蕩培養過夜，按1-10％接種量接過夜菌于lb培養基中，37℃下搖床振蕩培養到對數期，按1-10％接種量接種到裝有發酵培養基的發酵罐中，調節攪拌轉速與通氣量以維持溶氧在35％以上，發酵培養基配方如下：酵母浸出粉20g/l，葡萄糖6g/l，十二水合磷酸氫二鈉8g/l，磷酸二氫鉀4g/l，硫酸銨6g/l，七水硫酸鎂1.13g/l，二水氯化鈣0.073g/l，補料培養基：酵母浸出粉20g/l，葡萄糖30g/l，50％氨水和30％磷酸用于發酵過程中ph調控，當培養基中養分耗盡，溶氧迅速上升時開始補料，調節補料速度、轉速、通氣控制溶氧在30％以上，補料4h后，降溫至23℃，調節ph至7.0，加入終濃度為0.1-0.5mmol/l的iptg進行有氧誘導，繼續培養6h放罐；培養包含腸激酶基因的工程菌并誘導腸激酶基因表達，具體為：接種重組工程菌陽性克隆200μl到20ml的lb培養基中，于30℃下搖床振蕩培養過夜，按4％接種量接過夜菌于500ml的lb培養基中，37℃下搖床振蕩培養到對數期，接種到裝有6l發酵培養基的發酵罐中，初始參數為：發酵溫度37℃，攪拌速度200rpm，通氣量15l/min，ph為6.7，調節攪拌轉速與通氣量以維持溶氧始終在35％以上，發酵培養基如下：酵母浸出粉20g/l，葡萄糖6g/l，十二水合磷酸氫二鈉8g/l，磷酸二氫鉀4g/l，硫酸銨6g/l，七水硫酸鎂1.13g/l，二水氯化鈣0.073g/l，補料培養基：酵母浸出粉20g/l，葡萄糖30g/l，50％氨水和30％磷酸用于發酵過程中ph調控；當培養基中養分耗盡，溶氧迅速上升時開始補料，通過控制泵的轉速合理控制補料速度，控制溶氧在30％以上，補料4h后，降溫至23℃，調節ph至7.0，加入終濃度為0.3mmol/l的iptg進行有氧誘導，控制溶氧不低于20％，6h后出罐；破碎菌體的緩沖液為25mmol/ltris-hcl+5mmol/ledta，ph7.5；洗滌包涵體的緩沖液為2mol/l尿素+1.5％triton；包涵體復性的緩沖液為0.2mol/l尿素+10mmol/ledta+25mmol/ltis-hcl，gsh∶gssg＝1mmol/l∶0.3mmol/l，ph10；腸激酶原活化的條件是經腸激酶在室溫下酶解2-10小時，腸激酶/腸激酶原重量比為1/200；活性腸激酶的純化依次包括陰離子層析純化、陽離子層析純化和疏水層析純化步驟。
具體實施方式
下面通過具體操作工藝對本發明的內容作進一步的說明：
首先接種重組工程菌陽性克隆到lb培養基中，于30-40℃下搖床振蕩培養過夜，按1-10％接種量接過夜菌于lb培養基中，37℃下搖床振蕩培養到對數期，按1-10％接種量接種到裝有發酵培養基的發酵罐中，調節攪拌轉速與通氣量以維持溶氧在35％以上，發酵培養基配方如下：酵母浸出粉20g/l，葡萄糖6g/l，十二水合磷酸氫二鈉8g/l，磷酸二氫鉀4g/l，硫酸銨6g/l，七水硫酸鎂1.13g/l，二水氯化鈣0.073g/l，補料培養基：酵母浸出粉20g/l，葡萄糖30g/l，50％氨水和30％磷酸用于發酵過程中ph調控，當培養基中養分耗盡，溶氧迅速上升時開始補料，調節補料速度、轉速、通氣控制溶氧在30％以上，補料4h后，降溫至23℃，調節ph至7.0，加入終濃度為0.1-0.5mmol/l的iptg進行有氧誘導，繼續培養6h放罐；培養包含腸激酶基因的工程菌并誘導腸激酶基因表達，具體為：接種重組工程菌陽性克隆200μl到20ml的lb培養基中，于30℃下搖床振蕩培養過夜，按4％接種量接過夜菌于500ml的lb培養基中，37℃下搖床振蕩培養到對數期，接種到裝有6l發酵培養基的發酵罐中，初始參數為：發酵溫度37℃，攪拌速度200rpm，通氣量15l/min，ph為6.7，調節攪拌轉速與通氣量以維持溶氧始終在35％以上，發酵培養基如下：酵母浸出粉20g/l，葡萄糖6g/l，十二水合磷酸氫二鈉8g/l，磷酸二氫鉀4g/l，硫酸銨6g/l，七水硫酸鎂1.13g/l，二水氯化鈣0.073g/l，補料培養基：酵母浸出粉20g/l，葡萄糖30g/l，50％氨水和30％磷酸用于發酵過程中ph調控；當培養基中養分耗盡，溶氧迅速上升時開始補料，通過控制泵的轉速合理控制補料速度，控制溶氧在30％以上，補料4h后，降溫至23℃，調節ph至7.0，加入終濃度為0.3mmol/l的iptg進行有氧誘導，控制溶氧不低于20％，6h后出罐；破碎菌體的緩沖液為25mmol/ltris-hcl+5mmol/ledta，ph7.5；洗滌包涵體的緩沖液為2mol/l尿素+1.5％triton；包涵體復性的緩沖液為0.2mol/l尿素+10mmol/ledta+25mmol/ltis-hcl，gsh∶gssg＝1mmol/l∶0.3mmol/l，ph10；腸激酶原活化的條件是經腸激酶在室溫下酶解2-10小時，腸激酶/腸激酶原重量比為1/200；活性腸激酶的純化依次包括陰離子層析純化、陽離子層析純化和疏水層析純化步驟。