人宮頸癌細胞特異性結合的多肽及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，以改良的肽庫消減篩選法篩選對人宮頸癌細胞(SiHa 細胞)特異性結合的多肽(序列），對人宮頸癌細胞具有良好的結合特異性和敏感性。 技術背景
[0002] 宮頸癌(Cervical cancer)是常見的婦科腫瘤之一，其發病率在發達國家僅次于 乳腺癌、子宮內膜癌，在發展中國家則居首位。目前，宮頸癌的治療主要以手術切除為主，但 因早期宮頸癌無明顯癥狀和體征，易造成漏診或誤診，待發現時已到中晚期，喪失最佳手術 時機。放療、化療毒性極大，易產生劑量依賴性和藥物抗藥性等，效果不理想，病人的五年生 存率仍然很低。因此，尋找一種敏感性高且特異性強的早期篩查診斷方法，從而降低宮頸癌 的死亡率也是目前面臨的關鍵問題之一。
[0003] 近年來，迅速發展的分子影像學與靶向治療為宮頸癌的治療帶來了新的希望，其 中，篩選出宮頸癌細胞表面特異性強、敏感度高的靶向分子成為當務之急。
[0004] 噬菌體肽庫技術為宮頸癌細胞靶向分子篩選、宮頸癌的早期診斷和靶向治療提供 了新的途徑，其中的關鍵元件是對癌細胞、癌組織具有特異靶向結合活性的多肽片段的獲 得。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于，提供以改良的肽庫消減篩選由噬菌體12肽庫篩選得到對宮頸 癌細胞特異性結合的多肽序列，并提供鑒定該多肽與宮頸癌細胞特異性親和力的實驗結 果，證明該多肽在宮頸癌的早期分子影像學診斷、靶向化療、與其它材料偶聯而進行的宮頸 癌靶向治療等方面具有巨大應用價值。
[0006] 為了實現上述任務，本發明采取如下的技術解決方案：
[0007] 宮頸癌SiHa細胞特異性結合的多肽，其氨基酸序列為:QQLKDPWHSTPY。該多肽能夠 特異性結合SiHa細胞，而不識別人胚腎HEK293細胞（即正常細胞），并對其他腫瘤細胞表現 出極低的親和力或者無親和力。
[0008] 上述宮頸癌SiHa細胞特異性結合的多肽的篩選方法為以體外培養的SiHa細胞系 為靶細胞，以人胚腎J1EK293細胞系為非特異性吸附細胞，對噬菌體隨機12肽庫進行4輪消減 篩選，隨機挑取60個噬菌體克隆，利用ELI SA鑒定出陽性克隆。對陽性克隆進行DNA測序，分 析其多肽的氨基酸序列組成及基本特征，最后獲得擁有共有序列(Consensus sequence)的 陽性克隆組6個，對它們以細胞免疫熒光法進一步鑒定其特異性和敏感性，確定最佳序列。
[0009] 各種噬菌體克隆水平、最佳序列合成肽探針水平的實驗結果均提示序列 QQLKDPWHSTPY特異性、敏感性最佳，這為該多肽未來用于宮頸癌的早期分子影像學診斷、靶 向化療等提供了實驗依據。由于多肽分子量小、免疫原性低、親和力高、組織穿透性強、易合 成等特點也有望使其與適當的熒光標記物、納米顆粒、脂質體或抗腫瘤藥物等偶聯，從而應 用于腫瘤的早期影像診斷、靶向治療、病程監測及腫瘤治療療效評價等，對于解決目前癌癥 防治所面臨問題具有重要的意義。
[0010] 本發明以宮頸癌SiHa細胞為靶細胞，對噬菌體12肽庫以我們改良的消減篩選法進 行了4輪消減篩選，最后獲得6條共同多肽序列，分別為KNLTNEPQVPLV、ETLPQNESKIPW、 QQLKDPWHSTPY、VTALRKVDHTPL、SLSEWQDVRTTS、TITSKLVKWSRK。通過一系列鑒定分析實驗發 現其中的QQLKDPWHSTPY對于宮頸癌的靶向性最強，提示了其用于宮頸癌診斷、靶向治療方 面的價值。
[0011] 在宮頸癌檢測方面，利用同位素或者熒光標記的多肽可以特異性結合宮頸癌細 胞/組織，適用于腫瘤成像和分子影像診斷，對于宮頸癌早期檢測、癌病灶定位和療效評價 都具有重要意義;在宮頸癌靶向治療方面，有望利用其特異性高、分子量小、穿透力強、親和 力高的特性來與化療藥物偶聯，達到靶向遞送給藥的目的，可大大減小化療藥物的非特異 性和毒副作用。
【附圖說明】
[0012] 圖1為本發明多肽的制備路線圖；
[0013] 圖2為隨機十二肽pill融合蛋白的N末端序列；
[0014] 圖3為專用密碼子表；
[0015]圖4為首次ELISA所選36個陽性噬菌體克隆與SiHa細胞親和力的再鑒定結果；
[0016]圖5為6條共有序列的代表性陽性噬菌體克隆與細胞親和力的免疫熒光鑒定，其中 A:S6+SiHa；B:S6+Hek293；C：S7+SiHa；D：S7+Hek293；E：S21+SiHa；F：S21+Hek293；G：S22+ SiHa；H：S22+Hek293；I：S31+SiHa；J：S31+Hek293；K：S46+SiHa；L：S46+Hek293；M：URPs+ SiHa; N: PBS+SiHa; DAPI 染細胞核；
[0017] 圖6為克隆S7(QQLKDPWHSTPY)與靶細胞親和力鑒定，其中A:SiHa+S7;B:Hek293+ S7; C: SiHa+URP; D: Hek293+URP; E: SiHa+PBS; F: Hek293+PBS; DAPI 染細胞核；
[0018]圖7為細胞免疫化學鑒定陽性噬菌體克隆S7與靶細胞的結合特異性，其中A:SiHa+ S7；B：SiHa+URP；C：SiHa+PBS；D：Hek293+S7；E：Hek293+URP；F：Hek293+PBS；
[0019]圖8為陽性噬菌體克隆S7與多種腫瘤細胞的結合特異性，其中A:S7+SiHa;B:S7+ SMMC-7721(肝癌細胞）；C:S7+MCF-7(乳腺癌細胞）；D:S7+Cac〇-2(結直腸癌細胞）；E:S7+ Hek293; F: PBS+SiHa; G: URPs+SiHa; DAPI染細胞核；
[0020] 圖9為合成多肽(QQLKDPWHSTPY)與靶細胞特異性結合劑量、時間效應，其中左側為 劑量效應檢測，右側為時間效應檢測；
[0021] 圖10為合成多肽(QQLKDPWHSTPY)與靶細胞的結合特異性鑒定，其中A:SiHa+陽性 多肽;B:SiHa+陰性多肽;C:Hek293+陽性多肽;D:Hek293+陰性多肽;DAPI染細胞核；
[0022]圖11為合成多肽(QQLKDPWHSTPY)在靶細胞定位分析，其中A:SiHa+陽性多肽;B: S iHa+陰性多肽;C: Hek293+陽性多肽;D: Hek293+陰性多肽;DAP I染細胞核；
[0023]圖12為細胞免疫熒光鑒定合成多肽(QQLKDPWHSTPY)與多種腫瘤細胞的結合特異 性，其中A:SiHa;B:SMMC-7721(肝癌細胞）；C:MCF-7(乳腺癌細胞）；D:Eca-109(食道癌細 胞）；E:Cac 〇2(結直腸癌細胞）；F:SGC-7901(胃癌細胞）；DAPI染細胞核。
[0024]以下結合附圖和具體實例對本發明作進一步說明。
【具體實施方式】
[0025] 菌體展示技術是1985年由美國Missouri大學的G.P. Smith等創立的一項能夠特 異性篩選多肽或蛋白的技術。該技術將目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌 體表面，與噬菌體的衣殼蛋白融合表達，被展示的多肽或蛋白能夠保持相對獨立的空間結 構和生物活性。目前，噬菌體展示技術已經被廣泛應用于腫瘤標志物的篩選、腫瘤藥物的靶 向運輸和多肽藥物開發等方面的研究。
[0026] 本發明就是利用上述肽庫以改良的肽庫消減篩選法篩選可以特異敏感的結合于 人宮頸癌細胞的一條多肽序列，并以相關實驗證明了該序列對人宮頸癌細胞結合的高度特 異性和敏感性。該多肽具有親和力高、分子量小、組織穿透性強、免疫原性低、易合成等特 點，將其連接其它效應分子，可以用于宮頸癌的早期分子影像學診斷，形成腫瘤三維成像， 大大提高宮頸癌的早期診斷率，并可對治療療效評價;作為宮頸癌化療藥物的導向元件而 用于宮頸癌的靶向化療，可大大降低藥物毒性而提高療效，使化療成為對病人確實有益的 治療方法之一;將多肽與納米脂質體或納米藥物偶聯，可達到更好的靶向治療效果；用于尋 找腫瘤細胞表面相關配體的研究，為腫瘤治療提供新的靶點。
[0027] 本發明以人宮頸癌SiHa細胞為靶細胞，對噬菌體肽庫以改良的肽庫消減篩選法進 行4輪消減篩選，尋找與宮頸癌細胞SiHa具有特異性結合力的噬菌體肽序，為進一步研發宮 頸癌早期靶向診斷試劑和高效低毒靶向治療藥物奠定基礎，具體技術路線如圖1所示。 [0028] 一、材料與方法
[0029] 1.1主要實驗材料
[0030] 1.1.1細胞株人宮頸癌細胞株SiHa，購于美國ATCC(Rockville，USA)，人胚腎細胞 株HEK293，為本實驗室保存。
[0031] 1.1.2噬菌體隨機十二肽庫貯存:與甘油1:1保存在TBS溶液中，1.5 X 1013pfu/ml。 復雜度:~2.7X109個轉化子。載體M13KE的外殼基因-96gIII測序引物:5'-HQCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3,。
[0032] 1.1.3宿主菌￡.(：〇11￡1?2738，與甘油1:1保存在-80°(：超低溫冰箱中。
[0033] 1.2實驗方法
[0034] 1.2.1細胞培養
[0035] 用DMEM完全培養基、37 °C、飽和濕度、5 % C02孵箱。
[0036] 1.2.2宿主菌￡.(：〇11￡1?2738的準備
[0037] E.coli ER2738是NEB公司的Ph.D系列噬菌體肽庫的專用菌株。用LB-Tet培養基、 37 °C恒溫搖床、300rpm振蕩過夜。
[0038] 1.2.3噬菌體隨機十二肽庫體外快速消減篩選
[0039]以人胚腎細胞HEK293作為陰性吸附細胞預吸附以排除非正常細胞靶向克隆，再以 人宮頸癌細胞SiHa和作為祀細胞，對革E1向宮頸癌克隆以改良的消減篩選法（Subtraction Biopanning)進行淘篩，重復4輪。相對于噬菌體肽庫試劑盒生產商一一美國新英格蘭生物 實驗室公司（New England BioLabs Inc.，NEB)提供的傳統經典Biopanning方法(見試劑盒 說明書），在此基礎上，改良的消減篩選法每一輪Biopanning的特色如下：（1)每輪第一步增 加了以正常細胞對投入噬菌體肽庫的預吸附，以盡可能除去非癌細胞靶向的噬菌體克隆； (2)將傳統步驟要求的"擴增"步驟的25ml菌液體積改為3ml。這一改變大大簡化了實驗難度 和提高了篩選效率；（3)由于第(2)項改變，最后一輪(一般做4輪Biopanning)可以隨機挑選 至少60個或更多的噬菌體克隆。
[0040]所選噬菌體克隆擴增后以ELISA法鑒定與靶細胞SiHa的親和力。
[0041 ] 1.2.4陽性噬菌體克隆多肽序列的測定
[0042]對噬菌體陽性克隆、無關克隆進行測序，根據遺傳密碼子表格(參見圖2、圖3)，將 多肽序列翻譯成氨基酸序列并獲得Consensus序列。
[0043] 1 ? 2 ? 5Consensus序列的結合特異性鑒定
[0044] 以Consensus序列的代表性克隆通過常規細胞免疫熒光法進行結合特異性和敏感 性的鑒定。
[0045] 1.2.6統計學分析
[0046]利用SPSS 16.0數據處理軟件進行數據分析，數據結果用x土SD表示，P〈0.01表示 差異極顯著，P〈〇.05表示差異顯著，P>0.05說明差異不顯著，無統計學意義，組間多重比較 采用Duncan檢驗處理。
[0047] 二、實驗結果
[0048] 2.1陽性克隆的ELISA鑒定和測序
[0049] 獲得陽性噬菌體克隆36個，其中克隆S7與SiHa細胞結合特異性最高，結果如圖4所 示。陽性噬菌體克隆有6個共有序列:KNLTNEPQVPLV(代表性克隆S22);ETLPQNESKIPW(代表 性克隆S6) ;QQLKDPWHSTPY(代表性克隆S7) ;VTALRKVDHTPL(代表性克隆S21) ;SLSEWQDVRTTS (代表性克隆S31) ;TITSKLVKWSRK(代表性克隆S46);無關克隆（陰性克隆）序列為 SSLNHLTSLTNW。
[0050] 2.2陽性噬菌體克隆的結合特異性
[0051 ] 結果如圖5-圖8所示，陽性噬菌體克隆均結合SiHa細胞而不與HEK293細胞結合，以 克隆S7 (QQLKDPWHSTPY)最佳，說明該陽性多肽有很好的靶向性。
[0052] 2.3合成FITC標記多肽QQLKDPWHSTPY的特異性和敏感性鑒定
[0053] 結果如圖9-圖12所示。多肽QQLKDPWHSTPY特異結合于SiHa細胞表面而不與HEK293 結合，或與其他種類癌細胞呈現極低結合力。
【主權項】
1. 人宮頸癌細胞特異性結合的多肽，其特征在于，該多肽的氨基酸序列為： QQLKDPWHSTPY。2. 權利要求1所述多肽特異結合人宮頸癌細胞的應用。3. 權利要求1所述多肽用于制備治療人宮頸癌藥物的應用。
【專利摘要】本發明涉及人宮頸癌細胞SiHa特異性結合的多肽及其應用，所涉及多肽的氨基酸序列為：QQLKDPWHSTPY。所涉及的應用為本發明的人宮頸癌細胞SiHa特異性結合的多肽特異結合人宮頸癌的應用。本發明篩選和初步鑒定獲得的宮頸癌靶向多肽具有明顯的宮頸癌細胞結合特異性，可用于研發宮頸癌早期靶向診斷試劑、高效低毒靶向治療藥物。
【IPC分類】A61K47/42, C07K7/08, A61P35/00
【公開號】CN105713071
【申請號】CN201610085382
【發明人】侯穎春, 何慧敏, 肖麗, 高曉杰, 薛琴琴, 達苗苗, 馬樂樂, 馬妮, 程思楠
【申請人】陜西師范大學