杜松烷型倍半萜Salicifoliusin A及其制備方法和應用
【專利說明】杜松燒型倍半瞄Sa I i c i fo I i US i η A及其制備方法和應用 (-)技術領域
[0001 ]本發明設及一種杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A及其制備方法和應用。 (二)【背景技術】
[0002] 蠟梅在我國已有1000多年的栽培歷史，作為一種香花植物，其葉和花具有揮發性 的芳香油，香氣怡人，常作為花弁盆景和鮮切花來觀賞，因此是我國著名觀賞植物之一。作 為觀賞植物，蠟梅不僅可W在公園、花地等地方孤植或者叢植，也可W栽培在建筑物前、草 坪中或者道路兩旁，還可作為盆景，栽培于室內。
[0003] 蠟梅屬植物除了觀賞價值外還具有藥用價值。《貴陽民間藥草》中記載，顯示蠟梅 花可沖泡為茶，作為一種治療咳嗽的藥茶，因此蠟梅也是一種中藥材，廣泛被人們利用，在 蘇南民間就是用蠟梅花來治療感冒咳嗽。蠟梅不僅可治療感冒咳嗽，還可W治療因風寒引 起的腹痛、腹脹、消化不良，也可W治療傷食引起的胃炎、胃痛、泛酸。
[0004] 柳葉蠟梅(學名：化imonanthus salicifolius S.Y.化)又名山蠟梅、亮葉蠟梅、毛 山茶、巖馬桑、香風茶、石涼茶等，為蠟梅科蠟梅屬常綠灌木，是中國特有的屬、種，主要產于 安徽、江西、浙江。柳葉蠟梅也被應用于醫藥研究，表明其具有抗病毒、止咳化疲、抗菌等療 效。其提取物對人宮頸癌皿LA和人胃癌SGC-7901的生長有抑制作用。柳葉蠟梅葉具有濃郁 的香味，其精油成分不僅有鎮痛、鎮咳、桂疲作用，還能抑制食欲，明顯減緩小鼠體重增長， 起到減肥作用。該藥使用歷史悠久、療效確切、副作用較少，是值得研究開發的藥茶多用品 種。經國家有關科研單位測定，柳葉蠟梅含揮發油、搬皮素、堿、黃酬類等多種有效性成分， 鐵、巧、鋒、儀、砸等微量元素及維生素 B1、維生素 B2、維生素 C等含量豐富，并含18種氨基酸。
[0005] 本發明W柳葉蠟梅枝干等器官為研究對象，進行提取、分離、純化、結構鑒定得到8 α-徑基-T-muurolol(命名為：Salicifoliusin A)，屬于倍半祗類化合物，該化合物具有明 顯的免疫活性。 (Ξ)
【發明內容】
[0006] 本發明旨在提供一種杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A及其制備方法和應用。
[0007] 本發明的技術方案為：
[000引一種式（I)所示的杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A:
[0009]
[0010] 一種式（I)所示的杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A的制備方法，所述的制備方 法按如下步驟進行：
[0011] (1)將柳葉蠟梅的枝干進行粉碎干燥后，用乙醇浸提提取，之后過濾除去不溶物， 取濾液減壓濃縮得到乙醇浸膏；
[0012] (2)將步驟（1)所得乙醇浸膏分散于水中，得到懸浮液，再將所得懸浮液用石油酸 進行萃取，得到石油酸萃取液，減壓濃縮后得到石油酸浸膏；
[0013] (3)脫00~300目柱層析硅膠對步驟(2)所得石油酸浸膏進行柱層析分離，W石油 酸/乙酸乙醋體積比為9:1~1:9的混合液為洗脫劑進行梯度洗脫，收集含目標化合物的洗 脫液，減壓濃縮后合并得粗品，所得粗品依次經洗涂、重結晶，得到所述的杜松燒型倍半祗 Salicifoliusin A;所述粗品的洗涂采用石油酸、乙酸乙醋中的一種或兩者W任意比例的 混合液;所述粗品的重結晶采用甲醇作為重結晶溶劑。
[0014] 本發明所述的制備方法，步驟(1)中，推薦用于浸提提取的乙醇為體積分數95%的 乙醇;所述乙醇浸提提取的具體操作方法為:將粉碎干燥后的柳葉蠟梅枝干與乙醇W料液 質量比1:0.8~1混合，常溫(20~30°C)浸提5~10天，過濾得到乙醇浸提提取液，重復浸提2 ~4次，合并每次所得乙醇浸提提取液，50°C減壓旋蒸回收乙醇，得到乙醇浸膏(粘稠狀，無 醇味）。
[0015] 步驟(2)中，將所述乙醇浸膏分散于水中時，推薦所述乙醇浸膏與水的質量比為1: 2~4;所述懸浮液用石油酸進行萃取時，推薦所述懸浮液用等體積的石油酸萃取3次。
[0016] 步驟(3)中，用200~300目柱層析硅膠對石油酸浸膏進行柱層析分離時，所述梯度 洗脫的具體操作方法為：W石油酸/乙酸乙醋體積比分別為9:1、7:1、5:1、3.5:1、2:1、1:1、 1:2、1:3.5、1:5、1:7、1:9的混合液為洗脫劑，進行梯度洗脫，洗脫劑的流速為5~7mL/min (優選6mL/min)，每種不同比例洗脫劑的洗脫時間為300min~400min，收集含目標化合物的 洗脫液，減壓濃縮后合并得粗品。
[0017] 本發明中，所述的目標化合物(杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A)進行薄層層析 (TLC)時，通常W石油酸：乙酸乙醋= 1:1為展開劑，其Rf值為0.5。所述的制備方法步驟(3) 中，可通過化C檢測收集含目標化合物的洗脫液。
[001引本發明所述杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A在制備免疫活性藥物中具有應用 前景。根據免疫活性測試實驗，本發明杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A與Con A對照組相 比較，對小鼠脾細胞的增值表現出了明確的抑制作用，且具有劑量依賴性，顯示了該化合物 是潛在的降低免疫活性的藥物。
[0019] 本發明的有益效果在于：
[0020] 本發明所述杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A的提取、分離、純化方法簡單，免疫 活性明確，具有潛在的工業化制備和開發為免疫調節藥物的價值，該化合物化學結構及其 絕對構型經過波譜學數據和X-射線單晶衍射分析得到確認，不存在光學異構體，可W避免 光學異構體潛在的風險。 (四）
【附圖說明】
[0021] 圖1是實施例1得到的杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A的單晶衍射圖。 (五)
【具體實施方式】
[0022] 下面通過具體實施例對本發明進行進一步的說明，但本發明的保護范圍并不僅限 于此。
[0023] 實施例 1 :Salicifoliusin A的制備：
[0024] 提取:將柳葉蠟梅的枝干進行粉碎干燥后，得到干燥的柳葉蠟梅枝干粉末879g，用 1.化95 %乙醇常溫浸提一周，過濾得到浸提液，重復浸提3次，合并每次所得浸提液，減壓蒸 饋得到乙醇浸膏765g，將所得乙醇浸膏分散于3000mL水中，得到懸浮液，再將所得懸浮液用 等體積的石油酸萃取3次，合并得到石油酸萃取液，減壓濃縮后得到石油酸浸膏187g。
[0025] 分離：用200~300目柱層析硅膠(500g)對石油酸浸膏進行柱層析分離，W石油酸/ 乙酸乙醋體積比分別為9:1、7:1、5:1、3.5:1、2:1、1:1、1:2、1:3.5、1:5、1:7、1:9 的混合液為 洗脫劑，進行梯度洗脫，洗脫劑的流速為6mL/min，每種不同比例洗脫劑的洗脫時間為 350min，收集含目標化合物的洗脫液，減壓濃縮后得到粗品38.6g。
[0026] 提純：所得粗品用石油酸洗去雜質，然后用甲醇進行重結晶，得到無色晶體 0.603g，即為所述的杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A。
[0027] 實施例2:Salicifoliusin A的制備：
[0028] 提取:將柳葉蠟梅的枝干進行粉碎干燥后，得到干燥的柳葉蠟梅枝干粉末856g，用 0. 化95 %乙醇常溫浸提一周，過濾得到浸提液，重復浸提3次，合并每次所得浸提液，減壓蒸 饋得到乙醇浸膏648g，將所得乙醇浸膏分散于2500M^水中，得到懸浮液，再將所得懸浮液用 等體積的石油酸萃取3次，合并得到石油酸萃取液，減壓濃縮后得到石油酸浸膏159g。
[0029] 分離：用200~300目柱層析硅膠(500g)對石油酸浸膏進行柱層析分離，W石油酸/ 乙酸乙醋體積比分別為9:1、6:1、4:1、1:1、1:4、1:6、1:9的混合液為洗脫劑，進行梯度洗脫， 洗脫劑的流速為5mL/min，每種不同比例洗脫劑的洗脫時間為400min，收集含目標化合物的 洗脫液，減壓濃縮后得到粗品33.5g。
[0030] 提純:所得粗品用石油酸：乙酸乙醋體積比1:1的混合液洗去雜質，然后用甲醇進 行重結晶，得到無色晶體〇.421g，即為所述的杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A。
[0031] 實施例3:Salicifoliusin A的制備：
[0032] 提取:將柳葉蠟梅的枝干進行粉碎干燥后，得到干燥的柳葉蠟梅枝干粉末867g，用 1. 化95 %乙醇常溫浸提一周，過濾得到浸提液，重復浸提3次，合并每次所得浸提液，減壓蒸 饋得到乙醇浸膏699g，將所得乙醇浸膏分散于3000M^水中，得到懸浮液，再將所得懸浮液用 等體積的石油酸萃取3次，合并得到石油酸萃取液，減壓濃縮后得到石油酸浸膏165g。
[0033] 分離：用200~300目柱層析硅膠(400g)對石油酸浸膏進行柱層析分離，W石油酸/ 乙酸乙醋體積比分別為9:1、7:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5、1:7、1:9的混合液為洗脫劑，進行 梯度洗脫，洗脫劑的流速為7mL/min，每種不同比例洗脫劑的洗脫時間為300min，收集含目 標化合物的洗脫液，減壓濃縮后得到粗品36.5g。
[0034] 提純：所得粗品用乙酸乙醋洗去雜質，然后用甲醇進行重結晶，得到無色晶體 0.071g，即為所述的杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A。
[0035] 實施例4:化合物測試
[0036] 表1:實驗所用儀器
[0037]
[0038] 試劑:溶劑均為分析純試劑，未進行處理。
[0039] 對實施例1，實施例2或實施例3制得的杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A進行理 化和波譜學分析，m.P. 113-114°C，ESI-MS測定值m/z: 239[M+扣％237[M-H]-，HR-ESI-MS測定 值m/z : 261.1833[M+Na]%計算值261.1825[打5此602化?，確定其分子式為Ci5出602,分子量為 238，不飽和度為3，比旋光度為[a]D2D-81.5(c 0.22，CHCb)。
[0040] 表2:Salicifoliusin A的NMR數據（DMS0-d6)
[0041]
[0042] 實施例5:免疫活性測試
[0043] 對實施例1制得的杜松燒型倍半祗Salicifoliusin A進行了體外抗腫瘤活性測 試。
[0044] 方法：用淋己細胞增殖的方法，來檢測制得的Salicifoliusin A是否具有免疫活 性。首先制備小鼠脾細胞:雌性小鼠2只，體重為200g，將其處死，用70%乙醇的浸泡，在無菌 的環境中取其脾臟，于蒸發皿中，研磨搗碎，加入3.5mL化nk's液，混合均勻，用尼龍銅布過 濾，濾液放置于lOmL離屯、管，再加入3.5mL化nk' S液洗涂，合并洗涂液共7ιΛ;用1800r/m的 離屯、機將洗涂液離屯、5min，棄上清液，再用化nk's液洗一次，收集脾細胞。將收集的脾細胞 加入到3mL含有10%小牛血清的RPMI 1640完全培養液中，混勻后過濾，取細胞懸液0.1 mL， 加3.9mL 1.5%冰醋酸，混勻，復2管，計數，細胞總數為1 X 108個;取全部細胞懸液加含有 10%小牛血清的RPMI 1640完全培養液，調整濃度至5X106個/mL，4°C保存。然后取10化L處 理好的小鼠脾細胞，加入96孔板中，后加 Con A 5化L(終濃度為化g/mU和不同濃度的倍半 祗各50化，4復孔，倍半祗濃度梯度設置為:200、100、50、25、12.5μΜ。空白對照組設置為Con A 50化和50化1640完全培養基，將96孔板放置于37°C的C〇2解育箱中培養，48小時后每孔 中加入50化MTT( 2mg/mL)，培養4h后去上清液，加含1N HC1的DMS0溶液150μLν孔，振蕩 lOmin，使甲瑣充分溶解。用酶標儀測定490nm處的每孔內溶液的0D值。計算SI值，SI值二刺 激組的0D值/非刺激組的0D值。
[0045] 結果：實施例1所制得的倍半祗Salicifoliusin A與Con A對照組相比較，對小鼠 脾細胞的增值表現出了明確的抑制作用，且具有劑量依賴性。運提示該化合物可能是潛在 的降低免疫活性的藥物(如表3所示）。
[0046] 表3:制得的倍半祗體外免疫活性
[0047]
【主權項】
1. 一種式(I)所示的杜松燒型倍半砲Salicifoliusin A:2. -種式(I)所示的杜松燒型倍半砲Salicifoliusin A的制備方法，其特征在于，所述 的制備方法按如下步驟進行： (1) 將柳葉蠟梅的枝干進行粉碎干燥后，用乙醇浸提提取，之后過濾除去不溶物，取濾 液減壓濃縮得到乙醇浸膏； (2) 將步驟（1)所得乙醇浸膏分散于水中，得到懸浮液，再將所得懸浮液用石油醚進行 萃取，得到石油醚萃取液，減壓濃縮后得到石油醚浸膏； (3) 用200~300目柱層析硅膠對步驟(2)所得石油醚浸膏進行柱層析分離，以石油醚/ 乙酸乙酯體積比為9:1~1:9的混合液為洗脫劑進行梯度洗脫，收集含目標化合物的洗脫 液，減壓濃縮后合并得粗品，所得粗品依次經洗滌、重結晶，得到所述的杜松烷型倍半萜 Salicifoliusin A;所述粗品的洗滌采用石油醚、乙酸乙酯中的一種或兩者以任意比例的 混合液;所述粗品的重結晶采用甲醇作為重結晶溶劑。3. 如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)中，用于浸提提取的乙醇為體積 分數95 %的乙醇。4. 如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)中，所述乙醇浸提提取的具體操 作方法為:將粉碎干燥后的柳葉蠟梅枝干與乙醇以料液質量比1:0.8~1混合，常溫浸提5~ 10天，過濾得到乙醇浸提提取液，重復浸提2~4次，合并每次所得乙醇浸提提取液，50°C減 壓旋蒸回收乙醇，得到乙醇浸膏。5. 如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述乙醇浸膏與水的質量比 為1:2~4〇6. 如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述懸浮液用等體積的石油 醚萃取3次。7. 如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述梯度洗脫的具體操作方 法為：以石油醚/乙酸乙酯體積比分別為9 :1、7:1、5:1、3.5:1、2:1、1 :1、1:2、1:3.5、1:5、1: 7、1:9的混合液為洗脫劑，進行梯度洗脫，洗脫劑的流速為5~7 111171^11，每種不同比例洗脫 劑的洗脫時間為300min~400min，收集含目標化合物的洗脫液，減壓濃縮后合并得粗品。8. 如權利要求1所述的杜松烷型倍半萜Salicifoliusin A在制備免疫活性藥物中的應 用。
【專利摘要】本發明提供了一種式(I)所示的杜松烷型倍半萜Salicifoliusin A及其制備方法，本發明所述杜松烷型倍半萜Salicifoliusin A的提取、分離、純化方法簡單，免疫活性明確，具有潛在的工業化制備和開發為免疫調節藥物的價值，該化合物化學結構及其絕對構型經過波譜學數據和X?射線單晶衍射分析得到確認，不存在光學異構體，可以避免光學異構體潛在的風險；
【IPC分類】C07C29/76, A61P37/02, C07C35/36
【公開號】CN105712844
【申請號】CN201610045940
【發明人】王奎武, 李丹
【申請人】浙江工商大學