測定樣品中PIK3CA突變狀態的方法與流程

本發明涉及一種用于確定以下各項的DNA樣品中PIK3CA突變狀態的高靈敏度方法：例如，循環腫瘤細胞(CTC)、血漿/血清無細胞DNA(cfDNA)和福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織。

背景技術：

循環腫瘤細胞(CTC)檢測和計數可以充當“液體活組織檢查”及響應于全身治療的早期標志物，而它們的分子表征具有被翻譯為個體化靶向治療并使癌癥患者免遭不必要的和無效的治療的強大潛力。

已經顯示在輔佐化療之前在7.5mL血液中對一個或多個CTC的檢測可以準確地預測總體存活期(OS)。在隨訪的最初5年期間對CTC的持續檢測與晚期疾病復發和死亡的風險增加有關，并指出化療和激素治療抵抗性殘余疾病的存在。最近一項前瞻性臨床研究證實一個或多個CTC的存在預測早期復發和減少的總體存活期(OS)。

在轉移性乳腺癌(MBC)中，CTC代表無進展存活期(PFS)和OS的獨立預后因素，而CTC計數測定法(enumeration assay)(CellSearch^TM系統，Veridex)由FDA批準用于轉移性乳腺癌、前列腺癌、和結腸直腸癌。療法的第二個周期之前增加的CTC數量是不良的PFS和OS的早期預測性標志物，并且可以用于監測治療益處，然而接受治療的CTC減少隨著靶向療法而更強。在一線治療前患有MBC的患者中的CTC檢測可以定義具有慘淡臨床結果的患者的亞組。

現在確立的是，無細胞DNA(cfDNA)從經歷細胞凋亡或其他由微環境脅迫誘導的生理事件的細胞釋放到循環中并且可以在患有癌癥的患者的血液樣品中被鑒別。然而，與產生的cfDNA片段的長度(DNA完整性)相關，cfDNA的來源可以區別于凋亡或壞死原點。術語循環腫瘤DNA(ctDNA)基本上包括衍生自腫瘤的總cfDNA的一個亞型。許多研究表明，ctDNA和CTC兩者不僅存在于晚期而且甚至存在于早期階段的癌癥患者的血漿/血清和外周血中。

雖然有許多可商購的cfDNA提取試劑盒，但是由于起始材料在提取過程中的損失，效率和產量仍然很低，并且因為缺乏標準化，其定量是可變的。盡管如此，cfDNA提取效率可以直接影響突變檢測即測定靈敏度的結果。

磷酸肌醇3-激酶(PI3K)包括在20世紀80年代發現的脂質激酶家族，其負責調解重要的生物功能，例如細胞存活、分化和增殖。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信號傳導途徑牽涉于包括癌癥的人類疾病，并且理解此途徑的復雜性可以為治療性干預提供新途徑。在PI3K的p110α催化亞基中的體細胞突變，在許多類型的實體癌如乳腺癌、結腸直腸癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、頭頸癌、食道癌、肺癌、腦癌、皮膚癌、肝癌、胰腺癌、胃癌或甲狀腺癌中是非常頻繁的，并且在響應于分子靶向療法中起關鍵作用并與乳腺癌中的HER-2擴增共同發生。PIK3CA的突變已經在18％-40％的乳腺癌患者中進行了報道，而絕大多數(包括大約90％的病例)聚集在外顯子9與外顯子20中的兩個熱點區域中。

在CTC、cfDNA或FFPE組織的DNA樣品中檢測PIK3CA熱點突變的臨床相關性是很重要的，因為PIK3CA突變的存在與靶向療法中的藥物抗性相關。問題是，突變以非常低的數量存在于臨床腫瘤樣品中，并且現有方法學的檢測限是非常低的，因此導致假陰性，其可以影響臨床診斷和患者管理。

ctDNA的分析已被證明為一個有用的工具以評價腫瘤進展及評價預后、診斷和治療反應。許多研究已經證實ctDNA的臨床效用和許多技術已經被開發以增加用于此目的的方法的分析靈敏度。揚庫(Janku)等人，使用分批整經法(beaming method)，已經表明，在這兩個外顯子中PIK3CA突變在組織與血漿之間的一致性比例為91％[揚庫F(Janku F)，等人.參與實驗靶向療法的患晚期癌癥患者的血漿無細胞DNA中的可行突變(Actionable mutations in plasma cell-free DNA in patients with advanced cancers referred for experimental targeted therapies).癌靶標(Oncotarget).2015；6:12809-21]。在另一項研究中，使用數字PCR(dPCR)測定，ctDNA中的PIK3CA突變的百分比發現于22.7％的患有乳腺癌的患者中[大城C(Oshiro C)，等人.血清DNA中的PIK3CA突變預示著原發性乳腺癌患者中的復發(PIK3CA mutations in serum DNA are predictive of recurrence in primary breast cancer patients).乳腺癌研究與治療(Breast Cancer Res Treat).2015；150:299-307)。

出于這個原因，用于PIK3CA熱點突變的新穎方法已被開發，其特征在于極端靈敏度(0.05％)和高特異性(100％)[馬爾茍A(MARKOU A)，等人.循環腫瘤細胞中的PIK3CA突變狀態可以在患有乳腺癌患者的疾病復發或進展期間改變(PIK3CA mutational status in circulating tumor cells can change during disease recurrence or progression in patients with breast cancer).臨床癌癥研究(Clin Cancer Res).2014年11月15日；20(22):5823-34]。此測定提供許多優點：它可以在過量的野生型等位基因存在下檢測極少量的具有PIK3CA突變的突變等位基因。另外，通過使用所開發的方法，分離自CTC的DNA中的PIK3CA突變在早期乳腺癌患者(20.3％)和患有臨床確診轉移的患者(35.1％)兩者中均能以比以前報道高得多的百分比檢測出。

出于這個原因，用于檢測CTC中的PIK3CA熱點突變(外顯子9和20)的超靈敏和高度特異的方法，基于等位基因特異引發、野生型擴增的競爭性阻斷探針、不對稱PCR、以及探針解鏈分析[馬爾茍A，等人.循環腫瘤細胞中的PIK3CA突變狀態可以在患有乳腺癌患者中的疾病復發或進展期間改變.臨床癌癥研究.2014年11月15日；20(22):5823-34]的組合而開發和驗證。數據還表明，PIK3CA突變狀態可以在患有乳腺癌患者中的疾病復發或進展期間改變，并且在CTC中PIK3CA突變的存在與患有臨床確診轉移的患者中的較差存活相關聯[馬爾茍A，等人.CTC中的PIK3CA突變狀態可在乳腺癌患者中的疾病復發或進展期間發生改變.臨床癌癥研究.2014年11月15；20(22):5823-34]。

技術實現要素：

目的是提供一種用于確定例如CTC的樣品中的PIK3CA突變狀態的改進方法。

這個目的通過根據權利要求1所述的方法完全或部分實現。本發明的實施例和進一步細節在所附的從屬權利要求、附圖和序列表中闡述。

因此，該方法涉及對樣品中PIK3CA等位基因的存在進行確定，即對樣品中含有一個或多個突變(如一個或多個熱點突變)的PIK3CA等位基因的存在進行確定。該樣品可以，例如，屬于CTC，但該方法也可用于任何其他類型的生物樣品中，例如用于實體瘤血漿/血清或FFPE組織中的無細胞DNA中。一個或多個PIK3CA突變的檢測可被用來確定多種類型的癌癥，包括結腸癌、乳腺癌、腦癌、甲狀腺癌、胰腺癌、前列腺癌、頭頸癌、卵巢癌、宮頸癌、肝癌、胃癌、食道癌、皮膚癌和肺癌。當確定罹患癌癥的風險時，該方法特別有利，其中PIK3CA突變可能如例如在乳腺癌的早期診斷期間存在。

本發明的方法是基于由L.周(Zhou)等人針對BRAF突變而首次描述的途徑[周L等人.通過等位基因特異性PCR、競爭性探針阻斷及解鏈分析的罕見的等位基因富集與檢測.生物技術(BioTechniques)2011；50:311-8]。使用這種方法的基本途徑，設計從頭引物和探針并檢查所有的實驗條件以便檢測CTC樣品中的PIK3CA熱點突變。解鏈分析和未標記探針方面自猶他州愛達荷州技術大學取得授權。

根據本發明的方法可以增強在均相體系中的罕見等位基因檢測。該方法包括使用競爭性阻斷探針和解鏈分析的非對稱的及等位基因特異性聚合酶鏈反應(PCR)。該方法需要一種與有待擴增的突變等位基因DNA靶標的第一鏈的3'(三撇(prime))端互補的突變等位基因特異性引物以及一種未標記的阻斷探針(競爭性探針)，該阻斷探針是一種寡核苷酸，其與野生型DNA的相應第一鏈的野生型序列互補并且有待檢測的突變恰好存在于該位置處。此外，該方法包括一個通用引物，其與有待通過PCR擴增的DNA靶標的第二鏈的3'端互補。

根據本發明的用于確定PIK3CA突變等位基因在例如CTC的樣品中存在的方法則包括以下步驟：

·進行非對稱的和等位基因特異性聚合酶鏈反應(PCR)，和

·進行在PCR中產生的DNA的解鏈分析，

該PCR通過使用以下項來進行：

·突變等位基因特異性引物，其與有待擴增的突變等位基因DNA靶標的第一鏈的3'(三撇)端互補，

·未標記阻斷探針，其是與對應于突變等位基因第一鏈的野生型DNA第一鏈的野生型序列互補的寡核苷酸，并且在該對應位置中存在有待檢測的突變，并且在PCR反應中所述探針被阻斷而不作為用于DNA合成的引物；和

·一個通用引物，其與有待通過PCR擴增的DNA靶標的第二鏈的3'端互補。

解鏈分析通過利用以下項進行

·為未標記探針的解鏈探針，該解鏈探針是一種寡核苷酸，該寡核苷酸包含與野生型等位基因序列互補的序列并且與突變等位基因的序列重疊；和

·用于測量雙鏈DNA組分的解鏈溫度的可檢測組分，該雙鏈DNA組分至少包括結合到擴增的突變等位基因鏈或野生等位基因鏈的解鏈探針的雙鏈組分，其中該解鏈溫度在結合到擴增的突變等位基因鏈的解鏈探針的雙鏈組分與結合到擴增的野生等位基因鏈的解鏈探針之間不同。

然后使用等位基因特異性PCR來富集罕見的等位基因。該等位基因特異性PCR需要一個為突變等位基因特異性引物(反向或正向)的第一引物，將該第一引物設計為對所希望突變等位基因完全特異并且將其3'端設計為恰好在應檢測的突變位點處。還使用為通用引物(正向或反向)的第二引物，該第二引物結合到第一引物所結合到的互補鏈，并且可以用于擴增突變體與野生型鏈等位基因兩者。以這種方式，存在于例如野生型的樣品中的其他等位基因是錯配的并且非特異性擴增受到限制。然而，通過僅使用一個突變等位基因特異性引物，這種抑制在目前為止所描述的所有情況下不是100％完成的，由于野生型通常以過量的濃度存在。

因此，該方法包括競爭性探針阻斷的使用，其中使用一種未標記的阻斷探針。該未標記的阻斷探針(競爭性探針)是一種恰好在有待檢測的突變存在的位置處與野生型序列互補的寡核苷酸。這個未標記的阻斷探針在其3'端被阻斷用作該PCR中的引物，例如與用于PCR的正常引物相比，通過在其3'端具有額外的磷酸基團而阻斷。將這個未標記的阻斷探針用于野生型等位基因的競爭性阻斷并且以比突變等位基因特異性引物更高的濃度添加，例如該等位基因特異性引物的5至20倍或10倍更高的濃度。突變等位基因特異性引物和未標記的阻斷探針的序列存在著重疊，并且當突變等位基因特異性引物和此未標記的阻斷引物兩者均存在(野生型和突變體)時；該未標記的阻斷探針雜交到野生型，并且該突變等位基因特異性引物雜交到突變等位基因。因此，該未標記的阻斷探針與等位基因特異性引物競爭增加的靈敏度，因為它被設計成與野生型相匹配，從而準確地結合在野生型等位基因上。該未標記的阻斷探針可被設計，使得相應的熱點突變盡可能靠近未標記的阻斷探針的中心來放置。以這種方式，野生型的非特異性擴增可以降低到最小程度。罕見的等位基因富集是最佳的，其中與等位基因特異性引物相比，阻斷探針和反向引物是過量的。

該不對稱PCR包括等位基因特異性PCR，其中該突變等位基因特異性引物相對于通用引物是以較低的濃度(例如低10倍)添加的。以這種方式，此突變等位基因特異性引物在PCR中僅由以極低濃度存在的突變等位基因來充分使用。在一個突變等位基因存在下以及在一些PCR循環之后，該突變等位基因特異性引物被充分使用，并且包括該突變信息的鏈然后被過量生產，因為它被用作用于另一個引物的恒定模板，所述另一個引物對于這兩個等位基因是通用的，并且野生型等位基因的擴增通過使用突變等位基因特異性引物和未標記的阻斷探針而受限。所產生的單鏈PCR產物包含該突變信息。在PCR之后，這些是過量的并且被過量的、不完全互補的探針識別，所以解鏈曲線是在一個較低的溫度下。

解鏈分析跟隨PCR反應并且包括以下步驟：將溫度從低于所感興趣的解鏈溫度的溫度增加至高于所感興趣的解鏈溫度的溫度，并且檢測雙鏈DNA的解鏈溫度。

解鏈分析包括為一種未標記探針的解鏈探針的使用，該探針是一個寡核苷酸，其包含與野生型等位基因序列互補并優選地在突變位置周圍與突變等位基因的序列重疊的序列。解鏈探針(未標記的阻斷探針)然后可以包括與突變等位基因特異性引物的序列重疊的序列。解鏈探針提供了與其結合到野生型等位基因相比不同的解鏈溫度用于其結合到突變等位基因。如在此還例舉，解鏈探針可以是未標記的阻斷探針。未標記的阻斷探針至突變等位基因的解鏈溫度低于野生型等位基因的未標記阻斷探針的解鏈溫度。將未標記的阻斷探針以非常高的濃度加入，并且這主要用于該反應以阻斷野生型序列，其中該突變等位基因特異性引物將不能夠非特異性結合到野生型并給予非特異性PCR產物。此外，該相同的未標記的阻斷探針識別包含突變信息的單鏈以及如上所述的野生型單鏈。其結果是，得到的解鏈曲線如同等位基因在該探針下的特定簽名。

解鏈探針與不對稱PCR產物的互補性第一鏈之間的解鏈溫度的測量可以通過使用熒光檢測技術來進行，其中使用了熒光染料。在一個實施例中，該熒光染料是僅在所測量的樣品中的雙鏈DNA存在下發出熒光的染料。該染料可以是LC-綠加(LC-Green Plus)。通過測量雙鏈DNA和熒光染料LC-綠加的熒光的發射，得到解鏈曲線，這是突變等位基因的特征，因為該突變DNA序列的解鏈溫度低于野生型序列的解鏈溫度。該方法可以包括在PCR反應結束后增加溫度；那時所有的產品都是雙鏈并以100％發射熒光。然后將溫度逐漸升高，并且當溫度達到DNA序列的特征溫度，即Tm，熒光開始減少。Tm是如下溫度，在該溫度下DNA的50％是雙鏈并且50％是單鏈。

使用染料的解鏈分析可以，例如，包括以下步驟：55℃至60℃退火持續10s以及95℃持續1min，其中將該溫度在55℃至60℃的溫度下開始以0.2℃/s的增量(升溫速率)逐漸增加，并且通過檢測染料(數據采集步驟)來測量解鏈溫度。

在PCR反應中有待擴增的突變等位基因DNA靶標可以包括PIK3CA的外顯子9(SEQ NO ID:1)和/或外顯子20(SEQ ID NO:2)或由其組成，并且該突變等位基因特異性引物序列與外顯子9(SEQ NO ID:1)或外顯子20(SEQ NO ID:2)的DNA鏈互補。

解鏈探針可以是未標記的阻斷探針。該未標記的阻斷探針可以具有一個3'-端，與用于擴增的PCR引物相比，該3'-端通過添加磷酸基團修飾。這將阻斷未標記的阻斷探針作為PCR引物用于DNA鏈的合成的用途。任選地，未標記的阻斷探針可被一個或多個非熒光部分修飾，如但不限于非熒光小溝結合劑、生物素、間隔段、接頭、磷酸、堿基類似物、非天然堿、以及類似物。

如上所討論的，可檢測的組分可以包括熒光組分，并且其中解鏈分析則可以包括檢測該熒光組分。熒光組分可以是一種熒光染料，如下組的熒光染料，該組由LC-綠加或SYBR綠I組成，該熒光染料僅在樣品中的雙鏈DNA存在下發出熒光。

在該反應中，將未標記的阻斷探針以比突變等位基因特異性引物高的濃度進行添加，以阻斷野生型等位基因序列的擴增。該未標記的探針優先結合到野生型DNA并且與引物結合競爭。同時，突變等位基因特異性引物的較低濃度導致僅延伸突變等位基因序列。因此，阻斷探針的濃度應更于突變體引物，因為有待結合到過量的野生型等位基因。此外，突變等位基因特異性引物與通用引物之間的不同濃度導致過量產生包括突變信息的鏈以便增加該方法的靈敏度。

該突變可以存在于PIK3CA的外顯子9(SEQ NO ID:1)中，其中該突變等位基因特異性引物包含序列5’-TTTCTCCTGATT-3’(SEQ ID NO:3)或由其組成，其中T指示突變位點并且A指示一個額外的錯配，該錯配抑制野生型等位基因序列的擴增，以便僅增加突變罕見等位基因的擴增并導致加強方法的特異性。該突變等位基因特異性引物的序列可優選地包括或為5’-ACTCCATAGAAAATCTTTCTCCTGATT-3’(SEQ ID NO:4)。

該未標記的阻斷探針可以包含以下項或由其組成：序列5’-CTGATCAGTGA-3’(SEQ ID NO:5)，其中C指示序列與野生型位點互補的精確位置；以及一個PCR阻斷組分，其在PCR反應中阻斷未標記的阻斷探針作為DNA合成的引物。該未標記的阻斷探針的序列可以優選地包括或為5’-CTTTCTCCTGATCAGTGATTTCAGAG-P-3’(SEQ ID NO:6)，其中P是充當PCR阻斷組分的磷酸。

通用引物可與序列5’-GCTCAAAGCAATTTCTACACGAGA-3’(SEQ ID NO:7)具有75％至100％一致性。這意味著，一個通用引物可以與核酸序列5’-GCTCAAAGCAATTTCTACACGAGA-3’(SEQ ID NO:7)具有至少75％、或至少80％、或至少85％或至少90％一致性，如75％-100％、76％-100％、77％-100％、78％-100％、79％-100％、80％-100％、81％-100％、82％-100％、83％-100％、84％-100％、85％-100％、86％-100％、87％-100％、89％-100％、90％-100％、91％-100％、92％-100％、93％-100％、94％-100％、95％-100％、96％-100％、97％-100％、98％-100％、99％-100％或約100％一致性。

該突變還可以存在于PIK3CA的外顯子20(SEQ ID NO:2)中，其中該突變等位基因特異性引物包括序列5’-AATGATGCACG-3’(SEQ ID NO:8)或由其組成，其中G指示突變位點。該突變等位基因特異性引物的序列可以優選地包括或為5’-ATGAAACAAATGAATGATGCACG-3’(SEQ ID NO:9)。

該未標記的阻斷探針可以包含以下項或由其組成：序列5’-TGCACATCATG-3’(SEQ ID NO:10)，其中A指示序列與野生型位點互補的精確位置；以及一個PCR阻斷組分，其在PCR反應中阻斷未標記的阻斷探針作為DNA合成的引物。該未標記的阻斷探針的序列可以優選地包括或為5’-GAATGATGCACATCATGGTGG-P-3’(SEQ ID NO:11)，其中P是充當PCR阻斷組分的磷酸。

然后通用引物可與序列5’-TCTCAGTTATCTTTTCAGTTCAATGC-3’(SEQ ID NO:12)具有75％至100％一致性。這意味著，一個通用引物可以與核酸序列5’-TCTCAGTTATCTTTTCAGTTCAATGC-3’(SEQ ID NO:12)具有至少75％、或至少80％、或至少85％或至少90％一致性，如75％-100％、76％-100％、77％-100％、78％-100％、79％-100％、80％-100％、81％-100％、82％-100％、83％-100％、84％-100％、85％-100％、86％-100％、87％-100％、89％-100％、90％-100％、91％-100％、92％-100％、93％-100％、94％-100％、95％-100％、96％-100％、97％-100％、98％-100％、99％-100％或約100％一致性。

本文件還涉及一種用于以下項的方法

i)診斷受試者中的惡性贅生性疾病，和/或

ii)預測治療受試者中的惡性贅生性疾病的效力，和/或

iii)評價治療受試者中的惡性贅生性疾病的結果，和/或

iv)評價受試者中的惡性贅生性疾病的復發

其中該受試者是患有或懷疑患有惡性贅生性疾病的哺乳動物，

其中所述方法包括根據如在此所述的步驟分析樣品中PIK3CA突變等位基因DNA的存在。

如在此所述的方法可以有利地用于檢測樣品中的PIK3CA突變等位基因DNA的存在，并且

i)診斷受試者中的惡性贅生性疾病，和/或

ii)預測治療受試者中的惡性贅生性疾病的效力，和/或

iii)評價治療受試者中的惡性贅生性疾病的結果，和/或

iv)評價受試者中的惡性贅生性疾病的復發

其中該受試者是患有或懷疑患有惡性贅生性疾病的哺乳動物。

所分析的樣品可以是一個生物樣品，并且所述生物樣品可獲自受試者。有利的是，該受試者是人。

惡性贅生性疾病可以選自下組，該組由以下各項組成：乳腺癌、結腸癌、子宮內膜癌、食道癌、胃癌(gastric cancer)、頭頸癌、肝癌、卵巢癌、甲狀腺癌、皮膚癌、胰腺癌、前列腺癌和胃部癌(stomach cancer)。

有利的是，該惡性贅生性疾病是乳腺癌。

當在受試者中診斷和/或預測惡性贅生性疾病時，該方法包括以下步驟

a)從給定受試者獲得生物樣品

b)如在此所述，進行用于在從所述生物樣品中獲得的DNA樣品中分析PIK3CA突變等位基因DNA的存在的方法

c)在所述DNA樣品中檢測PIK3CA突變等位基因DNA的存在；和

d)將在所述DNA樣品中檢測的PIK3CA突變等位基因DNA的量與陽性對照和/或陰性對照進行比較，從而診斷和/或預測受試者中的惡性贅生性疾病。

另外的實施例是其中陽性對照包括來自攜帶突變的細胞系的細胞。甚至另外的實施例是其中陰性對照包括來自未罹患惡性贅生性疾病的健康受試者的細胞。

當在罹患惡性贅生性疾病的受試者中預測治療結果或預測對治療的反應時，該方法包括以下步驟

a)從給定受試者獲得生物樣品

b)如在此所述，進行用于在從所述生物樣品中獲得的DNA樣品中分析PIK3CA突變等位基因DNA的存在的方法；和

c)在所述DNA樣品中檢測PIK3CA突變等位基因DNA的存在；和

d)將在所述DNA樣品中檢測的PIK3CA突變等位基因DNA的量與陽性和/或陰性對照進行比較，從而預測所述受試者中的惡性贅生性疾病的治療結果，這基于在所述DNA樣本中檢測到的PIK3CA突變等位基因DNA的存在。

當在正在因惡性贅生性疾病接受治療的受試者中評價惡性贅生性疾病的治療效力時，該方法包括以下步驟

a)從正因惡性贅生性疾病接受治療的受試者的中獲得生物樣品

b)如在此所述，進行用于在從所述生物樣品中獲得的DNA樣品中分析PIK3CA突變等位基因DNA的存在的方法；

c)在所述DNA樣品中檢測PIK3CA突變等位基因DNA的存在；和

d)在因惡性贅生性疾病治療所述受試者期間，在一個或多個時間點重復步驟a)至c)，并且其中在所述DNA樣品中PIK3CA突變等位基因DNA的相對存在隨時間的變化指示治療效力。

因此，有效治療的指示是PIK3CA突變等位基因DNA在所述DNA樣品中的漸降存在相對于重復該方法的步驟中分析的先前樣品的相對變化。

任選地，可以根據本領域已知或在此所述的標準評分系統完成所檢測的PIK3CA突變等位基因DNA于所述DNA樣品中的評分。

該樣品可以是可能包含惡性贅生性疾病的任何樣品，優選來自具有惡性贅生性疾病的受試者的生物樣品，并且該受試者將在兩者之間或目前正在治療。

當評價惡性贅生性疾病的復發時，該方法包括以下步驟

a)從先前已經具有惡性贅生性疾病的受試者獲得生物樣品，

b)檢測PIK3CA突變等位基因DNA在獲自所述生物樣品的DNA樣品中的存在，

c)在因惡性贅生性疾病治療所述受試者后的一個或多個時間點重復步驟a)和b)，并且其中在所述DNA樣品中PIK3CA突變等位基因DNA的相對存在隨時間的變化可指示惡性贅生性疾病的復發。

因此，復發的指示是PIK3CA突變等位基因DNA在鑒定惡性贅生性疾病的所述DNA樣品中的漸增量(即，PIK3CA突變等位基因DNA在所述DNA樣品中的存在的隨時間增加)相對于重復該方法的步驟中分析的先前樣品的相對變化。

本發明還涉及一種用于檢測樣品中PIK3CA的外顯子9中的突變的存在的多核苷酸，其至少包括序列5’-TTTCTCCTGATT-3’(SEQ ID NO:3)或由其組成，優選地是包括5’-ACTCCATAGAAAATCTTTCTCCTGATT-3’(SEQ ID NO:4)或由其組成的序列，其中T指示突變位點并且A指示額外的錯配。該多核苷酸可以有利地在如上所述的方法中用作突變等位基因特異性引物，用于檢測PIK3CA的外顯子9中的突變的存在。該多核苷酸可以用作乳腺癌的預后標志物。

本發明還涉及一種用于檢測樣品中PIK3CA的外顯子20中的突變的存在的多核苷酸，該多核苷酸至少包括序列5’-AATGATGCACG-3’(SEQ ID NO:8)或由其組成，優選地是包括5’-ATGAAACAAATGAATGATGCACG-3’(SEQ ID NO:9)或由其組成的序列，其中G指示突變位點。該多核苷酸可以在如在此所述的方法中用作突變等位基因特異性引物，用于檢測PIK3CA的外顯子20中的突變的存在。該多核苷酸可以用作乳腺癌的預后標志物。

本發明還涉及一種用于檢測樣品如CTC、ctDNA或FFPE中的PIK3CA突變等位基因DNA的試劑盒。用于在樣品中檢測PIK3CA中的突變的試劑盒也可以用于

i)檢測生物樣品中的PIK3CA突變等位基因DNA，和/或

i)檢測受試者中的惡性贅生性疾病；或

iii)診斷或預測受試者中的惡性贅生性疾病；或

iv)預測治療受試者中的惡性贅生性疾病的結果；或

v)評價治療受試者中的惡性贅生性疾病的效力；或

vi)評價受試者中的惡性贅生性疾病的復發；

該試劑盒可以包括

-用于檢測樣品中的PIK3CA的外顯子9中的突變的第一多核苷酸，所述第一多核苷酸至少包括序列5’-TTTCTCCTGATT-3’(SEQ ID NO:3)或由其組成，優選地所述第一多核苷酸包括5’-ACTCCATAGAAAATCTTTCTCCTGATT-3’(SEQ ID NO:4)或由其組成，和/或

-用于檢測樣品中的PIK3CA的外顯子20中的突變的第二多核苷酸，所述第二多核苷酸至少包括序列5’-AATGATGCACG-3’(SEQ ID NO:8)或由其組成，優選地所述第二多核苷酸包括5’-ATGAAACAAATGAATGATGCACG-3’(SEQ ID NO:9)或由其組成。第一和/或第二多核苷酸可以在如以上所述的方法中用作突變等位基因特異性引物。

該試劑盒可以進一步包括至少包括以下項或由其組成的第三多核苷酸：序列5’-CTGATCAGTGA-3’(SEQ ID NO:5)和一個PCR阻斷組分，優選地所述第三多核苷酸包括或是5’-CTTTCTCCTGATCAGTGATTTCAGAG-P-3’(SEQ ID NO:6)，其中P是磷酸并且A是額外的錯配；和/或至少包括以下項或由其組成的第四多核苷酸：序列5’-TGCACATCATG-3’(SEQ ID NO:10)和一個PCR阻斷組分，優選地其中所述第四多核苷酸包括或是5’-GAATGATGCACATCATGGTGG-P-3’(SEQ ID NO:11)，其中P是磷酸。該第三和/或第四多核苷酸可以在以上所述的方法中用作未標記的阻斷探針。

該試劑盒可以進一步包括具有與序列5’-GCTCAAAGCAATTTCTACACGAGA-3’(SEQ ID NO:7)具有75％至100％一致性的序列的第五多核苷酸，和/或與序列5’-TCTCAGTTATCTTTTCAGTTCAATGC-3’(SEQ ID NO:12)具有75％至100％一致性的第六多核苷酸。該第五和/或第六多核苷酸可以在以上所述的方法中用作通用引物。

附圖說明

圖1示出了當前研究的實驗流程圖。

圖2A-D描繪了針對外顯子9 1633G>A(A)和外顯子20 3140A>G(B)所開發的PIK3CA突變測定的特異性以及針對外顯子9 1633G>A(C)和外顯子20 3140A>G(D)所開發的PIK3CA突變測定的靈敏度。

圖3A-D顯示在患有可動手術的乳腺癌的患者中針對外顯子9 1633G>A(A)和外顯子20 3140A>G(B)對CTC中的PIK3CA突變的檢測。在臨床確診轉移的患者中針對外顯子9 1633G>A(C)和外顯子20 3140A>G(D)對CTC中的PIK3CA突變的檢測。

圖4描繪了卡普蘭-邁耶(Kaplan-Meier)曲線，其估計患有乳腺癌與臨床確診轉移的患者以月數計的OS，這相對于CTC中的PIK3CA突變狀態。

圖5顯示在臨床確診為轉移性乳腺癌的患者中的無細胞DNA中針對外顯子9 1633G>A(A，B)和外顯子20 3140A>G(C)對PIK3CA突變的檢測。

圖6呈現了該方法的原理

圖7呈現了針對外顯子9和20的核苷酸序列

定義

通常預期本發明中使用的術語符合分子生物學領域的普通技術人員公認的標準定義。如下所列的少數例外已經進一步定義于本發明的范圍內。

如在此所使用的“至少一個/種”意指一個/種或多個/種，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個/種等。

如在此所使用的“檢測(detection或detect或detecting)”包括在參考或不參考對照的情況下的定性和/或定量檢測(測量水平)，并且進一步是指鑒定給定PIK3CA突變等位基因DNA分子的存在、不存在或量。

如在此所使用，術語“核酸序列”、“核酸分子”、“核酸”等是指一種多核苷酸分子(DNA-脫氧核糖核酸，或RNA-核糖核酸)，其包含一串核酸堿基。這些核酸堿基是“A”(腺嘌呤)、“T”(胸腺嘧啶)/“U”(尿嘧啶)，“C”(胞嘧啶)和“G”(鳥嘌呤)。在RNA中，“T”被替換為“U”。DNA或RNA可以是單鏈或雙鏈的。通過“對應于”一種核酸序列(在此表示為DNA序列)的RNA序列，旨在指相同的核酸序列，但其中“T”被“U”替換以得到相應的RNA序列。術語“核酸”可以包括DNA和/或RNA序列兩者，除非具體提及一者或另一者。

如在此與核酸分子(DNA和RNA分子)結合使用，術語“分離的”意指該分子已經從其原始環境中移出。這意指這樣一種核酸分子，當其存在于活的有機體時不是“分離的”。化學鍵斷開和/或通過其他方式將序列從其天然環境分離意指該核酸分子是“分離的”。

如在此所使用的，術語“引物”是指經合成而產生的寡核苷酸，當置于以下條件下時其能作為核酸合成的起始點：其中誘導與核酸鏈互補的引物延伸產物的合成，即在核苷酸和聚合作用劑如DNA聚合酶、反轉錄酶或類似物存在下并在合適的溫度和pH下。引物優選地是用于最大效率的單鏈，但可替代地可以是雙鏈。如果是雙鏈，引物首先經過處理以分開其雙鏈，然后再用于制備延伸產物。引物必須足夠長以在聚合作用劑存在下引發延伸產物的合成。引物的確切長度將取決于許多因素，包括溫度和引物來源。例如，取決于靶序列的復雜性，引物典型地包含15至25個或更多個核苷酸，盡管它可以包含更少的核苷酸。短的引物分子通常需要較冷的溫度以形成與模板足夠穩定的雜交復合物。

術語“突變等位基因特異性引物”是指以下引物：其與突變等位基因序列雜交并能夠在靶序列的變體之間鑒別，因為只有具有這些突變，該引物才在合適的條件下通過核酸聚合酶有效地延伸。具有靶序列的其他變體，延伸是低效或無效的。

術語“正向引物”是指通過以5'到3'方向與變性DNA分析物的一條鏈的3'端結合形成一個延伸產物的引物。

術語“反向引物”是指通過以3'到5'方向與變性DNA分析物的一條鏈的5'端結合形成一個延伸產物的引物。

術語“擴增子”是指一種核酸延伸測定如PCR的擴增產物。

術語“未標記的探針”是指未共價連接于染料并被配置成完全或部分地雜交至靶序列的寡核苷酸。該混合物中存在的染料不能結合未標記探針或與未標記探針解離，尤其是當探針與靶序列雜交和解鏈時。

術語阻斷探針或競爭探針是指以下一種寡核苷酸，其與野生型等位基因序列互補并且為了避免非特異性野生型產物擴增而與突變等位基因特異性引物競爭。

如在此所使用，關于寡核苷酸的術語“熔融溫度”(Tm)被定義為以下溫度，在該溫度下DNA的50％形成穩定的雙螺旋并且其他50％已被分離成單鏈分子。如本領域技術人員已知的，PCR退火溫度典型地比Tm小幾度，其中后者基于反應中的寡核苷酸和鹽濃度來計算。

術語“互補的”或“互補性”參考沃森-克里克(Watson-Crick)堿基配對法則涉及的多核苷酸的反向平行鏈使用。術語“完美互補的”或“100％互補的”是指在反向平行鏈之間所有堿基都具有沃森-克里克配對的互補序列，即，在多核苷酸雙鏈體中任何兩個堿基之間不存在錯配。然而，即使在完美互補不存在下，反向平行鏈之間也形成雙鏈體。術語“部分互補的”或“不完全互補的”是指在反向平行多核苷酸鏈之間少于100％完美的堿基的任何比對(例如，在多核苷酸雙鏈體中存在至少一個錯配或未配對的堿基)。部分互補鏈之間的雙鏈體通常比完美互補鏈之間的雙鏈體更不穩定。

術語“多核苷酸”和“寡核苷酸”可以互換使用。

“寡核苷酸”是有時用于描述更短的多核苷酸的術語。

術語“雜交的”和“雜交”是指在兩個核酸之間導致形成雙鏈體的堿基配對相互作用。不要求兩個核酸在其全長上具有100％的互補性以實現雜交。

如本文件中所使用的，通過“其變體”或“其變體和類似物”，旨在指一個或多個核酸序列，與指定的核酸序列具有的一致性為至少85％或至少90％，如85％-100％、86％-100％、87％-100％、89％-100％、90％-100％、91％-100％、92％-100％、93％-100％、94％-100％、95％-100％、96％-100％、97％-100％、98％-100％、99％-100％或約100％。

PCR(聚合酶鏈式反應)是用于擴增核酸分子的方法。PCR反應是本領域技術人員公知的技術，并涉及在以下條件下使樣品與一對所謂的寡核苷酸引物接觸(一個正向引物和一個反向引物)，所述條件允許在引物與靶(模板)序列之間的雜交，該靶(模板)序列與這些引物具有互補性并且其靶向可能存在于樣品中的序列以便擴增靶序列。

如在此所使用的“診斷”包括疾病性質的鑒定。

如在此所使用的“預后”包括關于疾病的可能結果的預測、關于如由疾病的性質和癥狀所指示的從疾病恢復的希望。

“真陽性”是指在局部或轉移的惡性贅生物中PIK3CA特異性突變的存在。

“假陰性”是指在局部或轉移的惡性贅生物中PIK3CA特異性突變的存在并且本身沒有通過診斷測定法歸類。

“真陰性”是指沒有局部或轉移的惡性贅生物并且本身通過診斷測定法歸類的那些受試者。

“假陽性”是指不具有局部或轉移的惡性贅生物而通過常規診斷測定法歸類為具有局部或轉移的惡性贅生物的那些受試者。

根據上下文，術語“假陽性”也可以是指不具有惡性贅生物而通過診斷測定法歸類為具有惡性贅生物或非惡性疾病的那些受試者。

在此所使用的“靈敏度”(如其應用于診斷測定法的上下文中)是指本身被正確鑒定的所有具有局部或轉移的惡性贅生物的受試者的比例(即，真陽性的數目除以真陽性和假陰性的數目的總和)。

在此所使用的診斷測定法的“特異性”(如其應用于診斷測定法的上下文中)是指本身被正確鑒定的沒有局部和轉移的惡性贅生物的所有受試者的比例(即，真陰性的數目除以真陰性和假陽性的數目的總和)。

術語“贅生物(neoplasm)”或“腫瘤(tumor)”可互換使用，并且是指組織的異常腫塊，其中腫塊的生長超過正常組織的生長，且不與正常組織的生長協調。贅生物或腫瘤可被定義為“良性的”或“惡性的”，其取決于以下特征：細胞分化的程度(包括形態學和功能性)，生長速率，局部侵入以及轉移。“良性”贅生物通常是分化良好的，特征是比惡性贅生物生長緩慢，并且依然位于原初位點。另外，良性贅生物不具有浸潤、侵入或轉移至遠位點的能力。

“惡性”贅生物通常是低分化的(間變)，具有特異性快速生長連同進行性的浸潤、侵入以及外圍組織的破壞。另外，惡性贅生物具有轉移至遠的位點的能力。術語“轉移”是指癌性細胞從原發性(初始)腫瘤擴散或遷移至另一器官或組織，且典型地是通過以下項可識別的：原發性(初始)腫瘤的組織類型的“繼發性腫瘤”或“次級細胞塊”的存在，而不是定位次級(轉移性)腫瘤的器官或組織的“繼發性腫瘤”或“次級細胞塊”的存在。例如已經遷移至骨的肺癌被認為是轉移的肺癌，并且由源自骨組織中生長的上皮肺細胞的癌細胞組成。

“健康”是指具有良好健康的受試者。這樣的受試者表明不存在任何惡性或非惡性的疾病。在本申請的上下文中，“健康個體”只有當他們不存在任何惡性或非惡性疾病才是健康的；“健康個體”可以具有通常不被視為“健康”的其他疾病或病況。

如在此所使用的“受試者”包括人；非人靈長類如黑猩猩和其他猿類和猴類；農場動物如牛、綿羊、豬、山羊和馬；家養哺乳動物如狗和貓；實驗動物，包括嚙齒動物如小鼠、大鼠和豚鼠等。該術語不指示具體的年齡或性別。因此，預期涵蓋成人和新生的受試者以及胎兒，無論雄性或雌性。在優選的實施例中，該受試者是哺乳動物，包括人類和非人類哺乳動物。在最優選的實施例中，該受試者是人。

“血漿(Blood plasma)或(plasma)”是血液的稻草色/淡黃色液體成分，其通常保持全血中的血細胞在懸浮液中。它按體積計構成總血的約55％。它是細胞外液(細胞外的所有體液)的血管內液部分。它主要是水(按體積計93％)，并包含溶解的蛋白質(包括白蛋白、免疫球蛋白)和纖維蛋白原、葡萄糖、凝血因子、電解質(Na⁺、Ca²⁺、Me²⁺、HCO^3-“、CI^-”等)、激素以及二氧化碳。

如在此所使用的“生物樣品”包括多種從患有或不患有惡性贅生物的任何受試者獲得的樣品類型。一個典型的受試者是人。例如，生物樣品包括從懷疑具有惡性贅生物的個體采集的組織或血液流體獲得的樣品。

如在此所用的術語“治療”被定義為通過內科或外科的方式管理患者。該治療改善或減輕醫學病癥或疾病的至少一種癥狀并被要求提供治愈。如在此所使用的術語“治療結果”或“治療的結果”是該治療對患者的物理效應。

如在此所用的術語循環腫瘤細胞(CTC)是已經從原發性腫瘤流出進入脈管并且在血流中循環的細胞。因此CTC構成重要遠處器官中的額外腫瘤(轉移)的后續生長的種子，從而觸發負責絕大多數的癌癥相關死亡的機制。

術語無細胞DNA(cfDNA)是指以下DNA，其從經歷細胞凋亡或其他由微環境脅迫誘導的生理事件的細胞釋放到循環。該cfDNA可以在患有癌癥的患者血液中被檢測到。

術語循環腫瘤DNA(ctDNA)是指以下DNA，其從原發性腫瘤的細胞釋放到循環并提供有關原發性腫瘤或轉移性腫瘤的狀態的信息。

如在此中所使用的，術語PIK3CA是指所謂的“磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸肌醇3-激酶、催化亞基α”基因的法定名稱。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信號傳導途徑牽涉于包括癌癥的人類疾病，并且理解此途徑的復雜性可以為治療性干預提供新途徑。在PI3K的p110α催化亞基中的體細胞突變是非常頻繁的，并且在響應于分子靶向療法中起關鍵作用并常與乳腺癌中的HER-2擴增共同發生。PIK3CA的突變已經在18％-40％的乳腺癌患者中進行了報道，而絕大多數(包括大約90％的病例)聚集在外顯子9與外顯子20中的兩個熱點區域中，外顯子9和外顯子20分別編碼螺旋結構域和激酶結構域。PI3K途徑的異常活化與對HER2定向療法的反應減弱相關，因為與野生型腫瘤相比，用曲妥珠單抗治療的HER2-陽性患者的結果在患有PIK3CA-突變的患者中是顯著更差的。

術語突變等位基因DNA是指根據參照序列在PIK3CA基因的兩個外顯子之間包含至少一個突變的DNA序列。該突變等位基因DNA可能在外顯子9中具有1633G>A的熱點突變或在外顯子20中具有3140A>G的熱點突變。

該突變是構成基因的DNA序列中的永久改變，這樣使得該序列不同于在參照序列中所發現的。突變以大小計變動；它們可以從單一的DNA結構單元(堿基對)影響到一大段包含多個基因的染色體的任何位置。

如在此中所使用的，術語“參照基因組”或“參照序列”是指任何生物體或病毒的任何特定的已知基因組序列(無論是部分的還或完整的)，其可以用于給從受試者識別出的序列作參照。例如，用于人類受試者以及許多其他生物體的參照基因組見于美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)www.ncbi.nlm.nih.gov。“基因組”是指以核酸序列形式表示的生物體或病毒的完整遺傳信息。

術語“野生等位基因鏈”是指編碼特定自然群體中最常見的表型的DNA序列。最初，該野生型被概念化為在一個基因座的標準的“正常”等位基因的產物，與此相反的是通過非標準的“突變體”等位基因產生的產物。

術語“熱點突變”是指在一個染色體區域存在的突變，其對遺傳損傷/變化比平均值序列更敏感。

具體實施方式

本發明提供了用于在例如循環腫瘤細胞或循環腫瘤DNA的一個樣品中進行PIK3CA熱點突變的高通量突變檢測的超靈敏和高度特異的分子方法。PIK3CA突變的重要性與乳腺癌中響應于分子靶向療法相關聯。

材料與方法

患者

作為訓練組，分析了總共78個樣品：ⅰ)63個外周血樣品；37個來自臨床確診轉移的患者并且26個來自健康女性志愿者，用來定義該測定的特異性，以及ii)15個原發性乳腺腫瘤組織(FFPE)。作為獨立組，總共175個外周血樣本獲自118位患有可動手術的乳腺癌的患者以及57位患有臨床確診轉移的患者；此外，針對這些乳腺癌患者中的76位(32位患有轉移并且44位患有可動手術的乳腺癌)對來自原發性腫瘤的FFPE進行了分析。對于這些樣品中的157個，關于CK-19在EpCAM陽性CTC部分中的表達的信息通過先前的研究也是可獲得的。在患有可動手術的乳腺癌的118位患者的獨立組中，9位患者復發和死于疾病進展(中位隨訪：42個月)。另外，患有HER2+腫瘤的患者接收曲妥珠單抗持續12個月，然而患有HR+腫瘤的患者接受內分泌治療(LH/RH類似物加他莫昔芬或芳香酶抑制劑)。根據指引還執行輔助性放射療法。所有的研究參與者簽署了知情同意書以參與該研究，該同意書經協會的倫理和科學委員會(the ethics and scientific committees of the institutions)批準。

CTC的陽性免疫磁性選擇

如先前所述將CTC分離自20mL的外周血[斯特拉蒂A(Strati A)等人.通過RT-qPCR的乳腺癌中的循環腫瘤細胞的基因表達譜.BMC癌癥(BMC Cancer)2011,11:422]。更具體地，在將外周血用20mL PBS(pH＝7.3)稀釋之后，通過使用菲可帕克(Ficoll-Paque)TM PLUS(GE醫療集團(GE Healthcare)，生物科學公司(Bio-Science AB))以670g在室溫下的梯度密度離心持續30min獲得外周血單核細胞(PBMC)。將接觸面細胞(interface cell)除去，用40mL的無菌PBS(pH＝7.3，4℃)以530g持續10min洗滌兩次，并再懸浮于10mL的PBS中。將細胞用臺盼藍染色并在血細胞計數器中計數。免疫磁性Ber-EP4[抗上皮細胞粘附分子(EpCAM)]-包被的捕獲珠粒(Dynabeads Epithelial Enrich，英杰公司(Invitrogen))被用來富集上皮細胞。

自CTC提取DNA

如先前所述的從CTC提取基因組DNA(gDNA)[西莫尼多M(Chimonidou M)等人.循環腫瘤細胞中的腫瘤抑制和轉移抑制基因的DNA甲基化(DNA methylation of tumor suppressor and metastasis suppressor genes in circulating tumor cells).臨床化學(Clin Chem)2011；57:1169-77]。除去Trizol的水相后，通過加入150μL的100％乙醇來沉淀(從中間相)DNA。將樣品通過顛倒進行混合并在室溫下保持2-3min，并且然后將DNA通過離心(2000g，5min，4℃)沉積并在包含0.1mol/L的檸檬酸鈉于10％乙醇(500μL)中的溶液中洗滌兩次。每次洗滌后，將DNA沉淀在室溫下伴隨周期性混合儲存于洗滌液中持續30min并離心(2000g，5min，4℃)。在這些2次洗滌之后，將DNA沉淀懸浮于1mL的75％乙醇中，在室溫下伴隨周期性混合保持10-20min，并離心(2000g，5min，4℃)。然后將分離的gDNA進行空氣干燥持續15min并溶解于50μL的8mmol/L NaOH中。將DNA濃度在Nanodrop ND-1000分光光度計中進行測定。將來自26位雌性健康志愿者的經采集用于特異性研究的外周血通過使用與針對患者的樣品所用的完全相同的方法進行處理。

自血漿提取DNA

根據制造商的說明使用QIAamp循環核酸試劑盒(QIAGEN)從血漿樣品分離無細胞DNA。首先，將EDTA中的外周血樣品在1小時內用于血漿分離，并且將血漿樣品儲存在-70℃直到cfDNA分離。恰好在cfDNA分離之前，將血漿樣品在室溫下解凍，并在4℃以13,400g離心10min以除去殘留的沉淀的細胞組分。總共，將2.00mL的血漿與工作液的1.6mL緩沖液ACL(含有1.0μg載體RNA)和200μl蛋白酶K(18mg ml^-1)混合，并在60℃孵育30min。然后，如在制造商的方案中所述的處理DNA分離。

引物和探針設計

通過使用PrimerPremier 5軟件(第一生物軟件國際公司(Premier Biosoft International))，將所有的寡核苷酸均從頭經由電腦模擬(in-silico)針對PIK3CA外顯子9(SEQ ID NO:1)和外顯子20(SEQ ID NO:2)中的每一個進行設計，并且通過IDT(綜合DNA技術公司(Intergraded DNA Technologies))合成。外顯子9(SEQ ID NO:1)和外顯子20(SEQ ID NO:2)的序列參見圖7。對于每一個外顯子，將一個等位基因特異性引物(與外顯子9的1633G>A突變和外顯子20的3140A>G突變匹配)、一個未標記的競爭性阻斷探針、以及一個用于不對稱擴增的引物根據周和其同事的研究進行設計[周L(Zhou L)等人.通過等位基因特異性PCR、競爭性探針阻斷和解鏈分析的罕見等位基因富集與檢測(Rare allele enrichment and detection by allele-specific PCR,competitive probe blocking,and melting analysis).生物技術(BioTechniques)2011；50:311-8]。對于外顯子9，引物組S1被設計成擴增包含外顯子9的熱點突變的區域(70bp)。反向引物(等位基因特異性引物)被設計成通過匹配派生等位基因的30端來擴增該突變等位基因。未標記的探針和正向引物被設計成與野生型相匹配。阻斷探針與等位基因特異性引物競爭增加的靈敏度。對于外顯子20，引物組S2被設計成擴增包含外顯子20的熱點突變的區域(104bp)。正向引物(等位基因特異性引物)被設計成通過匹配派生等位基因的30端來擴增該突變等位基因。未標記的探針和反向引物被設計成與野生型相匹配。將熱點突變盡可能靠近未標記的阻斷探針的中心來放置。所有引物和探針被留心地設計成避免染色體22上的假基因的擴增，該假基因與PIK3CA的外顯子9具有>95％同源性。所有引物和探針序列在表1中詳細給出。

表1：在此研究中設計并使用的引物和探針序列

PCR和解鏈分析

使用LightScanner 32(愛達荷州技術公司(Idaho Technology)，美國)、采用玻璃毛細管(羅氏應用科學公司(Roche Applied Science)，德國)獲得實時PCR和解鏈曲線。然而，相同結果也可以通過使用LightCycler 2.0(IVD)儀器和LightCycler 480(羅氏診斷(Roche Diagnostics))來獲得。LC-綠加(LC-Green Plus)(愛達荷州技術公司，美國)被用于熒光測量。將從MCF-7(c.1633G>A:E545K；雜合子)和T47D(c.3140A>G:H1047R；雜合子)乳腺癌細胞系中分離的兩個gDNA樣本用作PIK3CA突變對照。每個外顯子的PCR條件和解鏈分析方案詳細描述于表2中。每個外顯子的PCR反應混合物詳細描述于表3中。

表2：每個PIK3CA外顯子的PCR條件和解鏈分析方案

表3：用于檢測外顯子9和外顯子20中的PIK3CA熱點突變的PCR反應混合物

統計分析

CTC中的PIK3CA突變狀態與原發性腫瘤之間的相關性是通過使用卡方檢驗評價的。將科恩(Cohen)氏κ系數(一種用于定性項目的評判間一致性或注釋者間一致性的統計量度)用于評價在CTC中的PIK3CA突變與原發性腫瘤之間以及在CTC中的PIK3CA突變與CK-19mRNA表達之間的一致性，因為其通常被認為是比簡單的百分之一致性計算更準確的量度(由于k考慮到偶然發生的一致性)。通過使用卡普蘭-邁耶(Kaplan-Meier)方法來計算無病間隔(DFI)和總體存活期(OS)曲線并用時序檢驗進行比較。P值<0.05被認為是統計學上顯著的。使用SPSS Windows版本19.0(SPSS，芝加哥，伊利諾州)進行統計分析。

實例1

用于PIK3CA熱點突變的超靈敏和高度特異性方法的開發和驗證

該研究的實驗流程圖概述于圖1中。

最初，用于CTC中的PIK3CA熱點突變(外顯子9和20)的超靈敏和高度特異性方法被開發和驗證。將該測定在封閉管形式中進行并基于等位基因特異性引發、野生型擴增的競爭性探針阻斷、不對稱PCR、以及探針解鏈分析[馬爾茍A(Markou A)，等人.循環腫瘤細胞中的PIK3CA突變狀態可以在患有乳腺癌患者中的疾病復發或進展期間改變(PIK3CA mutational status in circulating tumor cells can change during disease recurrence or progression in patients with breast cancer).臨床癌癥研究(Clin Cancer Res).2014年11月15日；20(22):5823-34]。在該測定設計中，將等位基因特異性PCR的靈敏度和特異性通過不對稱擴增和探針解鏈分析用未標記的競爭性野生型特異性阻斷探針進行增強。該未標記的競爭性探針在60℃的解鏈分析峰能夠指示在這兩個外顯子中的PIK3CA突變的存在。用WT等位基因特異性引物擴增的WT PIK3CA外顯子9的未標記的阻斷探針和DNA模板的導數解鏈曲線的峰，與用突變等位基因特異性引物擴增的未標記的阻斷探針和突變體PIK3CA外顯子9的DNA模板的解鏈曲線的峰在4℃左右在這兩種情況下不同(結果未顯示)。在所有實驗中，靶向突變等位基因，該突變是通過用突變等位基因特異性引物擴增的該未標記的阻斷探針和突變PIK3CA序列的導數解鏈進行檢測的。因此，如果該峰在該較低的溫度60℃下存在的話，則僅檢測到突變。對于該突變體和WT兩者，在通過使用突變等位基因特異性引物存在該WT的非特異性擴增的情況下，均可看見由于PCR產物且可以在較高溫度下被檢測的另一個峰。針對PIK3CA外顯子9和20中的每者，將所有引物和探針從頭經由電腦模擬被留心地設計成避免染色體22上的假基因的擴增，該假基因與PIK3CA的外顯子9具有>95％同源性。

方案優化。在若干實驗中針對兩個外顯子將該PIK3CA突變測定進行了如下廣泛優化，使用作為來自癌癥細胞系(MCF-7和T47D)的陽性和陰性對照gDNA樣品及分離自健康供體的野生型(WT)gDNA，相對于：PC退火溫度，Mg⁺²濃度，引物和未標記的探針濃度，PCR循環數，每個不對稱PCR步驟的持續時間，不對稱PCR與靶DNA量的引物比，以及解鏈分析條件(數據未示出)。

為了開發具有低檢測極限的高度特異性方法以用于檢測CTC中的PIK3CA突變，將該方案和條件最初根據最佳結果進行優化。通過使用不對稱PCR、野生型阻斷探針和探針解鏈分析增強等位基因特異性PCR擴增和檢測。罕見的等位基因富集是最佳的，其中與等位基因特異性引物相比，阻斷探針和通用引物是過量的。觀察到隨著突變等位基因特異性引物的濃度降低，特異性增加而PCR效率降低。不斷增加的特異性通過野生型與PIK3CA DNA之間的ΔCq來體現。不斷降低的PCR效率通過PIK3CA DNA的Cq的增加來證明。雖然，PCR效率受任一引物的濃度的降低的影響，但僅低濃度的突變等位基因特異性引物增加特異性。為了補償較低PCR效率，典型地進行80個循環。

具有阻斷探針的等位基因特異性富集受退火/延伸溫度的影響。當退火/延伸溫度在針對匹配的野生型等位基因的野生型阻斷探針的解鏈溫度(Tm)與錯配的突變等位基因之間時，特異性是最佳的。如果退火溫度低于或等于突變等位基因的Tm，則探針抑制野生型和突變等位基因兩者的擴增，從而限制了靈敏度。如果退火溫度高于或等于野生型等位基因的Tm，則優先阻斷和PCR效率降低限制了靈敏度。

實例2

特異性研究。所開發的方法的測定特異性是以與針對患有乳腺癌的患者所遵循的完全相同的方式，首先通過分析分離自26位健康女性志愿者的gDNA來評價。該開發的方法是高度特異的，因為在任何這些樣品中不存在以下情況：健康女性供體在PIK3CA的兩個外顯子中均具有任何突變。圖2A和B描繪了所開發的PIK3CA突變測定的特異性，并且示出了在未標記阻斷探針存在下在PCR后獲得的特有導數解鏈曲線，所述未標記的阻斷探針檢測外顯子9 1633G>A熱點突變(A)和外顯子20 3140A>G熱點突變(B)。基線是PCR陰性對照。PIK3CA突變是通過用突變等位基因特異性引物擴增的該未標記的阻斷探針和突變PIK3CA序列的導數解鏈進行檢測的。僅當此峰在60℃下存在時檢測到突變。在存在WT的非特異性擴增的情況下，在較高溫度下的另一個峰是由于通過使用突變等位基因特異性引物的PCR產物并且對于該突變體和WT兩者均可見。

如在圖2a中可以看出的，在外顯子9中，將健康供體的gDNA(N18)之一通過擴增-受阻突變系統(ARMS)-PCR特異性引物進行擴增，并在77.5℃得到峰，而不是在60.0℃。這可以由以下事實解釋：即使通過使用PIK3CA熱點突變特異性引物，極低量的以極高濃度存在的野生型序列可以被非特異性地擴增。為了避免這種情況，使用了作為阻滯劑起關鍵作用的未標記探針，因為它是野生型特異的并結合在與突變-特異性引物相同的序列處。在N18的情況下，該WT序列被非特異性地擴增，這就是為什么在77.5℃檢測到解鏈曲線的峰。然而，在針對未標記探針的解鏈曲線上在60.0℃沒有檢測到任何峰，這確切地指示我們正在尋找的特異性突變的存在。這些結果證實了該方法的100％特異性。

實例3

靈敏度研究。將所開發的方法的靈敏度進一步通過將來自細胞系的突變的gDNA與WT的gDNA以50％、25％、12.5％、2.5％、1.25％、0.5％、0.25％、0.125％和0.05％的比例進行混合來評價(參見圖2C，針對外顯子9 1633G>A，熱點突變；以及圖2D，針對外顯子20 3140A>G，熱點突變)。選擇用于稀釋的WT gDNA樣品來匹配突變的gDNA數量、質量和定量循環(Cq)，以使PCR偏差最小化。產生解鏈曲線并且評價區別細胞系稀釋物的解鏈轉變與WT樣品的解鏈轉變的能力。對于外顯子9，有可能清晰地區別對應于0.05％的MCF-7細胞系的稀釋物(圖2C)，而對于外顯子20，它也可以區別0.05％的T47D細胞系稀釋物的比率(圖2D)。解鏈曲線是高度可再現的。

對于這兩個外顯子，PIK3CA突變是通過用突變等位基因特異性引物擴增的該未標記的阻斷探針和突變PIK3CA序列的導數解鏈進行檢測的。僅當此峰在60℃下存在時檢測到突變。在存在WT的非特異性擴增的情況下，在較高溫度下的另一個峰是由于通過使用突變等位基因特異性引物的PCR產物并且對于該突變體和WT兩者均可見。

特別地，為了得到CTC的分子表征的可靠信息，所使用的突變檢測系統的靈敏度、特異性、及穩健性是極其重要的。用于PIK3CA突變的高靈敏度方法已基于HRMA被開發[霍克斯PA(Vorkas PA)，等人.通過新穎和高靈敏度的高分辨率小擴增子解鏈分析方法的PIK3CA熱點突變掃描.分子診斷學雜志(J Mol Diagn)2010；12:697-704]。盡管事實上這種方法比傳統的桑格測序更靈敏(1％)，但當該測定應用于CTC樣品中時，CTC中的突變的檢測失敗了。

實例4

患有臨床確診轉移的乳腺癌患者的EpCAM陽性CTC和原發性組織(FFPE)中的PIK3CA突變的檢測

作為訓練組，將來自患有臨床確診轉移的患者的37份外周血樣品和15份原發性乳腺腫瘤組織(FFPE)針對PIK3CA突變進行了分析。在EpCAM-陽性CTC部分中，針對外顯子9在6/37患者(16.2％)并且針對外顯子20在4/37患者(10.8％)中檢測到PIK3CA突變。總計，在10/37(27.0％)患有轉移性乳腺癌的患者中檢測到PIK3CA突變。在原發性乳腺腫瘤組織中，針對外顯子9在9/15(60.0％)并且針對外顯子20在7/15(46.7％)中檢測到PIK3CA突變。存在六種以下情況，其中在相同的FFPE樣品中均檢測到兩者的熱點突變；總計，在10/15(66.7％)FFPE樣品中檢測到PIK3CA突變。

實例5

獨立組。隨后，在118位患有可動手術的乳腺癌的患者和57位患有臨床確診轉移的患者的獨立組中評價該測定。對這些患有乳腺癌的患者中的76位，來自原發性腫瘤的FFPE也是可獲得的。

可動手術的乳腺癌患者的CTC中的PIK3CA突變的檢測。

在該獨立組中，來自118位患有可動手術的乳腺癌的患者的EpCAM-陽性CTC部分在原發性癌癥之后已被除去，并且在輔助化療之前已經開始進行了分析。針對外顯子9 1633G>A(A)、熱點突變(圖3A)，在3/118(2.5％)中并且針對外顯子20 3140A>G、熱點突變(圖3b)，在21/118(17.8％)中檢測到PIK3CA突變。存在以下一種情況，其中兩者熱點突變均在CTC樣本中被檢測到。總計，在24/118(20.3％)的可動手術的乳腺癌患者中檢測到PIK3CA突變。基線是PCR陰性對照。

患有臨床確診轉移的乳腺癌患者的CTC中的PIK3CA突變的檢測。

在該獨立組中，將來自57位患有轉移性乳腺癌的患者的EpCAM-陽性CTC部分進行了分析。自這些57位患者中，24位具有骨轉移，3位在肝中，2位在腦中，9位在肺中，3位在骨和肝兩者中，并且6位在肺和骨中，以及2位在多于兩個不同位點中。在EpCAM-陽性CTC部分中，在外顯子9 1633G>A熱點突變的8/57(14.0％)中(圖3C)以及在外顯子20 3140A>G熱點突變的12/57(21.1％)中(圖3D)檢測到PIK3CA突變。總計，在該組患者中的20/57(35.1％)中檢測到PIK3CA突變。在圖3C和3D中的解鏈曲線中在60℃的峰分別指示外顯子9和外顯子20突變的存在。在此背景下，如果在60℃未檢測到峰，那么該樣品被認為是所檢測突變的野生型。基線是PCR陰性對照。

相應的原發性腫瘤中的PIK3CA突變的檢測。

在該獨立組中，將在CTC和相應的原發性腫瘤中的PIK3CA突變狀態在76位患有乳腺癌的患者(32位患有臨床確診轉移且44位患有可動手術的乳腺癌)中進行比較，關于這些患者相應的FFPE也是可獲得的(表4)。

表4.獨立組：CTC和相應的原發性腫瘤(FFPE)中的PIK3CA突變狀態

外顯子9，1633G>A。關于所有患者，在38/76(50％)的原發性腫瘤樣品中以及在76位中的6位(7.9％)相應的EpCAM-陽性CTC部分樣品中觀察到外顯子1633G>A熱點突變。對于在其原發性腫瘤中攜帶這種PIK3CA熱點突變的4位患者，相同的突變也在CTC中被檢測。在34位患者中，此突變在原發性腫瘤中被鑒定，而在EpCAM-陽性CTC部分中未被鑒定，然而發現36位患者在原發性腫瘤和CTC兩者中針對此突變均是陰性的。然而，在兩種情況下，此熱點突變在EpCAM-陽性CTC部分中被鑒定，而在相應的原發性腫瘤中未被鑒定。在患有可動手術的乳腺癌的患者中，1633G>A在21/44(47.7％)的FFPE中以及在1/44(2.3％)相應的CTC樣本中被觀察到；在其原發性腫瘤中攜帶這種PIK3CA熱點突變的患者中沒有一位在CTC中具有相同的突變。在21位患者中，此突變在原發性腫瘤中被鑒定，而在CTC中未被鑒定，然而發現22位患者在原發性腫瘤和CTC兩者中針對此突變均是陰性的。然而，在一種情況下，此熱點突變在CTC部分中被鑒定，而在相應的原發性腫瘤中未被鑒定。在具有轉移的患者中，1633G>A在17/32(53.1％)的FFPE中以及在5/32(15.6％)相應的CTC中被觀察到。對于在其原發性腫瘤中攜帶這種PIK3CA熱點突變的4位患者，相同的突變也在CTC中被檢測。在13位患者中，此突變在原發性腫瘤中被鑒定，而在CTC中未被鑒定，然而發現14位患者在原發性腫瘤和CTC兩者中針對此突變均是陰性的。然而，在一種情況下，此熱點突變在CTC部分中被鑒定，而在相應的原發性腫瘤中未被鑒定。

外顯子20，3140A>G。關于所有患者，在13/76(17.1％)的FFPE中以及在14/76(18.4％)相應的CTC樣品中觀察到外顯子20 3140A>G熱點突變。對于在其原發性腫瘤中攜帶這種PIK3CA熱點突變的4/13患者，相同的突變也在EpCAM-陽性CTC部分中被檢測。在9位患者中，此突變在原發性腫瘤中被鑒定，而在CTC中未被鑒定，然而發現53位患者在原發性腫瘤和CTC兩者中針對此突變均是陰性的。值得注意的是，在10位患者中，此熱點突變僅在EpCAM-陽性CTC部分中被檢測，而在相應的原發性腫瘤中未檢測到。在患有可動手術的乳腺癌的患者的組中，3140A>G在5/44(11.4％)的FFPE中以及在10/44(22.7％)相應的CTC中被觀察到。對于在其原發性腫瘤中攜帶這種PIK3CA熱點突變的2/5患者，相同的突變也在CTC中被檢測。在3位患者中，此突變在原發性腫瘤中被鑒定，而在CTC中未被鑒定，然而發現31位患者在原發性腫瘤和CTC兩者中針對此突變均是陰性的。然而，在8位患者中，此熱點突變僅在CTC中被檢測，而在相應的FFPE中未檢測到。在具有轉移的患者的組中，3140A>G在8/32(25.0％)的原發性腫瘤樣品中以及在4/32(12.5％)相應的CTC中被觀察到。對于在其原發性腫瘤中攜帶這種PIK3CA熱點突變的2/8患者，相同的突變也在CTC中被檢測。在6位患者中，此突變在原發性腫瘤中被鑒定，而在CTC中未被鑒定，然而發現22位患者在原發性腫瘤和CTC兩者中針對此突變均是陰性的。然而，在2位患者中，此熱點突變僅在CTC中被檢測，而在相應的原發性腫瘤中未檢測到。

在原發性腫瘤和相應的CTC兩者中的這些熱點PIK3CA突變的存在之間沒有一致性，因為這是在統計學上針對可動手術的和經驗證轉移的乳腺癌患者或針對所有患者一起來分開評價的(見表4)。

這些發現表明，CTC中的PIK3CA突變狀態可以在患有乳腺癌的患者的疾病復發或進展期間變化。當在76位患者的亞組中將CTC和相應的原發性腫瘤中的PIK3CA突變狀態進行比較時，可以觀察到相同的突變均在少數樣品中的原發性腫瘤和CTC兩者中存在。在大多數患者中，該突變在原發性腫瘤中被鑒定，而在CTC中未被鑒定，然而許多患者在原發性腫瘤和CTC兩者中針對此突變均是陰性的。然而，有以下12個病例，其中熱點突變在CTC中被鑒定，而在相應的原發性腫瘤中未被鑒定；在兩位患者中，1633G>A在CTC中被觀察，但在相應的FFPE中未觀察到，然而在10位患者中，3140A>G在CTC中被觀察，但在相應的原發性腫瘤中未觀察到。已經報道了反映CTC的異質性的類似結果。

實例6

CTC中的PIK3CA突變狀態，相對于CK-19mRNA表達。

在該獨立組中，針對這些患者中的157位(57位具有臨床轉移且100位患有早期乳腺癌；表5)進一步評價了CTC中的PIK3CA突變狀態是否與CK-19mRNA表達相關。在可動手術的和轉移性乳腺癌中，外周血中的CK-19mRNA-陽性細胞的檢測是針對隱藏的腫瘤細胞的最靈敏的生物標志物，

表5.獨立組：CTC中的PIK3CA突變與CK-19表達之間的比較

在可動手術的乳腺癌中，僅3/100的樣品針對PIK3CA突變和CK-19mRNA表達兩者均是陽性的(都在外顯子20中)。有33/100樣品針對CK-19為陽性的(在PIK3CA中沒有攜帶突變)，然而值得高度注意的是將PIK3CA熱點突變在17位患者的CTC中進行鑒定，所述患者針對CK-19mRNA表達是陰性的。在患有臨床確診轉移的患者中，11/57(19.3％)的樣品針對PIK3CA突變和CK-19表達兩者均是陽性的，6位在外顯子9中并且5位在外顯子20中。有14/57(24.6％)的樣品針對CK-19是陽性的(在PIK3CA中沒有攜帶這些熱點突變)。值得高度注意的是將PIK3CA熱點突變在9位患者的CTC中進行鑒定，所述患者針對CK-19mRNA表達是陰性的。如果未檢測到PIK3CA突變，則這26個樣品(17個來自患有可動手術的乳腺癌的患者并且9個來自患有臨床確診轉移的患者)將會被表征為CTC陰性的，所述樣品被發現針對CTC中的PIK3CA突變為陽性的，但針對CK-19mRNA表達均為陰性的。關于這些熱點PIK3CA突變和CK-19mRNA表達在CTC中的存在，沒有一致性(見表2)。

本研究的重要觀察是針對CK-19mRNA表達為陰性的患者(攜帶CTC中的PIK3CA熱點突變)的顯著數目(17/118于可動手術的乳腺癌組中和9/57于轉移驗證組中)。如果未檢測到PIK3CA突變，則這些患者將會被表征為CTC陰性的。CTC的分子表征已表明CTC是高度異質的。這可能，至少部分歸因于上皮-間質轉化以及間質-上皮轉化。在此背景下，未預期所有CK-19陽性的CTC將是PIK3CA突變陽性的，或所有我們的樣本(其為CK-19陰性的)將不會于CTC中攜帶PIK3CA突變。CK-19實時PCR測定是高特異性和靈敏的，并且它已經在先前的研究中展示了其臨床意義[斯塔托波羅A(Stathopoulou A)，瓦拉傳科利斯I(Vlachonikolis I)，馬弗蒂斯D(Mavroudis D)，佩拉基M(Perraki M)，古勞斯西絲C(Kouroussis C)，阿波斯拖拉基S(Apostolaki S)，等人.患有可動手術的乳腺癌的患者的外周血中的細胞角蛋白-19-陽性細胞的分子檢測：其預后意義的評價.臨床腫瘤學雜志(J Clin Oncol)2002；20:3404-12.]。然而，總是有數個患者不復發(即使他們是CK-19陽性的)，或會復發(即使他們是CK-19陰性的)，并且甚至當使用FDA批準的CellSearchTM系統時已顯示相同的情況，清楚表明一種標志物不是萬能的并且不足以驗證我們樣本中的惡性CTC群體的存在。

實例7

CTC中的PIK3CA突變狀態在患有經驗證轉移的患者中的臨床意義。

進一步評價CTC中的PIK3CA突變狀態與相對較小組的患有臨床確診轉移的患者的臨床結果之間的關系。通過使用患者的術后存活進行的卡普蘭-邁耶(Kaplan-Meier)存活分析證明了于CTC上攜帶PIK3CA熱點突變的患者(n＝20)比那些未攜帶者(n＝37)具有顯著較短的OS(P＝0.047，時序檢驗；參見圖4)。

一個驚人的發現也是CTC中的PIK3CA突變的存在與轉移性患者的較差存活相關聯。在任何類型的癌癥中，這是首次提出CTC中的基因突變的存在與患者存活相關。使具有PI3K信號傳導途徑中的激活突變的癌癥患者與檢測PI3K抑制劑的第一期方案匹配具有改善的應答率和存活[啼四魔薄利多AM(Tsimberidou AM)，等人.在I期臨床試驗方案中的個體化用藥：MD安德森癌癥中心的倡議(Personalized medicine in a phase I clinical trials program:the MD Anderson Cancer Center initiative).臨床癌癥研究(Clin Cancer Res)2012；18:6373-83]。關于這一點，我們的發現(即PIK3CA突變可以排他地在CTC中存在，而不存在于原發性腫瘤中)可對患者有利，如最近在一試點前瞻性研究中所示的，在所述前瞻性研究中赫賽汀的給予基于CK-19mRNA陽性的CTC的存在[喬治奧利亞斯V(Georgoulias V)，等人.曲妥珠單抗降低患有呈現耐受化療的CK-19mRNA陽性循環腫瘤細胞的早期乳腺癌患者的臨床復發發生率：一項隨機II期研究的結果(Trastuzumab decreases the incidence of clinical relapses in patients with early breast cancer presenting chemotherapy-resistant CK-19mRNA-positive circulating tumor cells:results of a randomized phase II study).腫瘤學年鑒((Ann Oncol)2012；23:1744-50]。在PI3K/AKT信號傳導途徑中的突變(其經常解除對腫瘤細胞的管制)最近已經在乳腺癌干細胞中被確定，認為所述突變在乳腺癌的起始、進展和臨床反應中具有中心作用[多諾萬CA(Donovan CA)，等人.乳腺癌腋淋巴結轉移與干細胞突變的相關性(Correlation of breast cancer axillary lymph node metastases with stem cell mutations).美國醫學會雜志外科學(JAMA Surg)2013；148:873-8]。

實例8

在具有經驗證轉移的乳腺癌患者的ctDNA中的PIK3CA突變的檢測。

使用所開發的方法來檢測分離自具有經驗證轉移的乳腺癌患者血漿的ctDNA中的熱點PIK3CA突變。首先，從血漿中提取的所有ctDNA樣品均針對其DNA質量被檢查以在用來評價熱點突變的外顯子9的完全相同的PIK3CA基因區域中驗證野生型的DNA質量、引物特異性。將ctDNA樣品中的PIK3CA基因的突變狀態精確地如先前所述的開發的方法進行檢測(圖5)。在ctDNA樣品中，將PIK3CA突變于4/24(16％)針對外顯子9(圖5A，5B)和6/24(25％)針對外顯子20(圖5C)中進行檢測。在圖5A、5B和5C中的解鏈曲線中在60℃的峰分別指示外顯子9和外顯子20突變的存在。在此背景下，如果在60℃未檢測到峰，那么該樣品被認為是所檢測突變的野生型。

在本研究中證明該測定可以檢測分離自癌癥患者的血漿的ctDNA中的PIK3CA突變。該測定靈敏度是非常低的(0.05％)并且特異性是非常高的；該測定可以在高量的野生型等位基因的存在下檢測極罕見的PIK3CA突變等位基因。總的來說，在分離自血漿樣品的ctDNA中，24個樣品中有4個在外顯子9中對1633G>A突變是陽性的并且24個樣品中有6個對3140A>G突變是陽性的。循環腫瘤DNA似乎是非常有效的并且是生物標記物的有利來源以用于實時確定腫瘤的突變狀態；然而，在這種情況下，需要高度靈敏的、穩健的和特異性的方法。本文證據證明該測定提供一個有用的工具，用于檢測分離自癌癥患者的血漿的ctDNA中的PIK3CA突變。

序列表

序列表

<110> 制藥輔助有限公司（Pharmassist Ltd）

<120> 測定樣品中的PIK3CA突變狀態的方法

<150> US62/034,231

<151> 2014-08-07

<160> 12

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 125

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

agtaacagac tagctagaga caatgaatta agggaaaatg acaaagaaca gctcaaagca 60

atttctacac gagatcctct ctctgaaatc actaagcagg agaaagattt tctatggagt 120

cacag 125

<210> 2

<211> 619

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

gtttcaggag atgtgttaca aggcttatct agctattcga cagcatgcca atctcttcat 60

aaatcttttc tcaatgatgc ttggctctgg aatgccagaa ctacaatctt ttgatgacat 120

tgcatacatt cgaaagaccc tagccttaga taaaactgag caagaggctt tggagtattt 180

catgaaacaa atgaatgatg cacgtcatgg tggctggaca acaaaaatgg attggatctt 240

ccacacaatt aaacagcatg cattgaactg aaaagataac tgagaaaatg aaagctcact 300

ctggattcca cactgcactg ttaataactc tcagcaggca aagaccgatt gcataggaat 360

tgcacaatcc atgaacagca ttagaattta cagcaagaac agaaataaaa tactatataa 420

tttaaataat gtaaacgcaa acagggtttg atagcactta aactagttca tttcaaaatt 480

aagctttaga ataatgcgca atttcatgtt atgccttaag tccaaaaagg taaactttga 540

agattgtttg tatctttttt taaaaaacaa aacaaaacaa aaatccccaa aatatataga 600

aatgatggag aaggaaaaa 619

<210> 3

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR的引物

<400> 3

tttctcctga tt 12

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (引物)

<400> 4

actccataga aaatctttct cctgatt 27

<210> 5

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (探針)

<400> 5

ctgatcagtg a 11

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (探針)

<400> 6

ctttctcctg atcagtgatt tcagag 26

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (引物)

<400> 7

gctcaaagca atttctacac gaga 24

<210> 8

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (引物)

<400> 8

aatgatgcac g 11

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (引物)

<400> 9

atgaaacaaa tgaatgatgc acg 23

<210> 10

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (探針)

<400> 10

tgcacatcat g 11

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (探針)

<400> 11

gaatgatgca catcatggtg g 21

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (引物)

<400> 12

tctcagttat cttttcagtt caatgc 26