用于在核酸測定中改善解鏈分辨和多重性的探針的制作方法

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技術領域：
本發明一般性涉及分子生物學領域。更特別地，其涉及核酸的檢測。
背景技術：
：聚合酶鏈式反應(PCR)是不采用活的生物體對DNA進行酶促復制的分子生物學技術。PCR通常用于醫學和生物研究實驗室以承擔多種任務，例如遺傳疾病的檢測、基因指紋的鑒定、感染性疾病的診斷、基因克隆、親子鑒定和DNA計算。由于其無可比擬的復制和精確能力，PCR被分子生物學家認為是核酸檢測的首選方法。通常在PCR反應的終點(end-point)或者平臺期進行DNA檢測，這使得難以對起始模板進行定量。實時PCR或動態PCR通過記錄反應過程中的擴增子濃度，從而提高了終點PCR分析的能力。最通常通過與被擴增的靶標有關的熒光信號的改變來記錄擴增子濃度。實時PCR相對于終點檢測的優勢還在于，由于其在封閉的系統中進行，因此限制了污染。其它優勢包括更高的靈敏度、動態范圍、速度和需要較少的過程。在實時PCR檢測方法中已經采用了幾種測定化學。這些測定化學包括采用雙鏈DNA結合染料、雙標記的寡核苷酸，例如發夾引物和發夾探針。然而，目前實時PCR的一個缺陷在于其受限的多重性(multiplexing)能力。目前的實時PCR技術采用在溶液中游離的報告熒光染料。在多重反應中，該設計必須在每個測定中采用光譜不同的熒光染料。例如，設計來檢測4個靶序列的多重反應將需要能夠通過光譜不同來區分4個不同的、游離漂浮的熒光染料的儀器，這還不包括對照。這些要求不僅限制了實際的多重能力，而且增加了成本，其原因在于這樣的設備通常需要多個發射源、檢測器和濾器。目前的實時PCR技術的多重能力為大約1-6重(plex)。技術實現要素：本發明涉及用于擴增和檢測DNA的系統和方法。特別地，本發明的實施方案提供了大大提高用于檢測經擴增靶序列的可檢測探針的多重能力的系統和方法。在第一實施方案中，提供了用于檢測靶核酸存在的方法，其包括：(a)使樣品與可切割探針接觸，所述探針從5’至3’包含(i)包含標記物的第一序列區；(ii)第二序列區；(iii)為第二序列區的反向互補序列(reversecomplement)的序列；和(iv)包含與靶核酸第一鏈上的第一區互補的一個或更多個核糖核苷酸堿基的序列；(b)使所述可切割探針與內切核糖核酸酶接觸，從而切割與靶核酸雜交的探針以形成截短的可切割探針；(c)使所述截短的可切割探針與其自身雜交以形成發夾探針；(d)延伸所述發夾探針；以及(e)通過檢測標記物的信號改變來檢測所述靶核酸。在某些方面，第一序列區(i)中的標記是報告基團-淬滅基團對，并且第一序列區上發夾探針的延伸改變報告基團和淬滅基團之間的距離；或用報告基團-淬滅基團對的第一成員標記的至少一個非天然核苷酸和第一序列區上發夾探針的延伸導致用報告基團-淬滅基團對的第二成員標記的互補非天然核苷酸的引入。在某些方面，所述為第二序列區的反向互補序列的序列(iii)的全部、一部分可與靶核酸第一鏈上的第一區互補或序列(iii)不與靶核酸第一鏈上的第一區互補。在一些實施方案中，所述方法還包括對發夾探針進行解鏈分析(meltanalysis)。在一個實施方案中，提供了用于檢測靶核酸存在的方法，其包括：(a)使樣品與可切割探針接觸，所述探針從5’至3’包含(i)包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標記的至少一個非天然核苷酸的第一序列區；(ii)第二序列區；(iii)為第二序列區的反向互補序列的序列；和(iv)包含與靶核酸第一鏈上的第一區互補的一個或更多個核糖核苷酸堿基的序列；(b)使所述可切割探針與內切核糖核酸酶接觸，從而切割與靶核酸雜交的探針以形成截短的可切割探針；(c)使所述截短的可切割探針與其自身雜交以形成發夾探針；(d)在能夠與第一序列區的至少一個非天然核苷酸堿基配對的用報告基團-淬滅基團對的第二成員標記的非天然核苷酸的存在下延伸所述發夾探針；以及(e)通過檢測可切割探針和發夾探針上標記物的信號改變來檢測所述靶核酸。在某些方面，所述為第二序列區的反向互補序列的序列(iii)的一部分可以與靶核酸第一鏈上的第一區互補。在一些實施方案中，所述方法還包括對發夾探針進行解鏈分析。在另一個實施方案中，提供了用于檢測靶核酸存在的方法，其包括：(a)使樣品與可切割探針接觸，所述探針從5’至3’包含(i)用報告基團-淬滅基團對標記的第一序列區；(ii)第二序列區；(iii)為第二序列區的反向互補序列的序列；和(iv)包含與靶核酸第一鏈上的第一區互補的一個或更多個核糖核苷酸堿基的序列；(b)使所述可切割探針與內切核糖核酸酶接觸，從而切割與靶核酸雜交的可切割探針以形成截短的探針；(c)使所述所述截短的探針與其自身雜交以形成發夾探針；(d)將所述發夾探針延伸到第一序列區上，以使得報告基團和淬滅基團之間的距離增加；以及(e)通過檢測報告基團的信號改變來檢測所述靶核酸。在某些實施方案中，所述報告基團-淬滅基團對的成員之一在可切割探針的5’端。在一些實施方案中，所述報告基團-淬滅基團對的成員之一在第一序列區的5’端，而報告基團-淬滅基團對的另一個成員在第一序列區的3’端。在某些實施方案中，所述報告基團是熒光染料。在某些方面，所述為第二序列區的反向互補序列的序列(iii)的全部、一部分可以與靶核酸第一鏈上的第一區互補或序列(iii)不與靶核酸第一鏈上的第一區互補。在一些實施方案中，所述方法還包括對發夾探針進行解鏈分析。在某些方面，所述可切割探針還可以包含(v)在第二序列區和為第二序列區的反向互補序列的序列之間的一個或更多個核苷酸的環序列(loopsequence)。在一些方面，所述環序列的長度可以是4-20、6-15或10-15個核苷酸。在一些方面，所述環序列可以包含至少3-5個連續的A核苷酸。在一些實施方案中，所述環序列包含一個或更多個聚合酶延伸阻斷部分。在某些方面，所述環序列可以包含一個或更多個核苷酸和一個或更多個延伸阻斷部分的組合。聚合酶延伸阻斷部分可以用作所述環序列的一部分或全部。延伸阻斷部分的實例包括碳間隔區(spacer)。碳間隔區可以包括長度可以為3至36個碳原子的間隔區。內部寡核苷酸碳間隔區的常見實例包括長度為3、9和18個碳原子的間隔區。碳間隔區可用于阻止可切割探針形成非特異性雙鏈PCR產物。碳間隔區也可以用于調節發夾探針的解鏈溫度(melttemperature，Tm)。其他聚合酶延伸阻斷部分可包含非天然核苷酸、核糖核苷酸或任何其他非核苷酸化學部分。在某些方面，所述第二序列區的長度可以是6-20個核苷酸。在某些方面，所述第二序列區互補序列的長度可以是6-20個核苷酸。在某些方面，所述第一序列區的長度可以是4-20個核苷酸。在某些方面，所述與靶核酸第一鏈上的第一區互補的序列的長度可以是6-50、10-50或6-30個核苷酸。在某些方面，所述可切割探針的一個或更多個核糖核苷酸堿基可以正好位于為第二序列區的反向互補序列的序列(本文也稱為第二序列區互補序列)的3’。在某些方面，所述可切割探針的一個或更多個核糖核苷酸堿基可以位于距離與靶核酸第一鏈上的第一區互補的序列的3’端至少4個堿基。如上所述，所述為第二序列區的反向互補序列的序列的全部、一部分可以與靶核酸第一鏈上的第一區互補或該序列不與靶核酸第一鏈上的第一區互補。在某些方面，所述可切割探針可以包含這樣的序列，所述序列包含與靶核酸序列的第一鏈上第一區互補的1至5個核糖核苷酸堿基。在一些方面，所述可切割探針可以包含這樣的序列，所述序列包含與靶核酸序列第一鏈上的第一區互補的3至5個核糖核苷酸堿基。在某些方面，所述可切割探針可以包含非堿基配對修飾，其可以位于核糖堿基(ribobase)的3’和/或5’，并位于該探針的序列內，否則所述序列將與靶核酸第一鏈上的第一區互補。這些修飾可包括不與靶序列堿基配對的天然或非天然核苷酸，或可包括碳間隔區或其他非核苷酸化學部分。將非堿基配對修飾置于核糖核苷酸的上游或下游但在探針的區域內(否則其將與靶序列互補)可以提高可切割探針的特異性。非堿基配對部分可以位于核糖核苷酸上游或下游的2至20個核苷酸之間。在某些實施方案中，所述非堿基配對部分位于核糖核苷酸上游或下游1、2、3、4或5個核苷酸或其中任何范圍的核苷酸。在某些方面，所述用報告基團-淬滅基團對的第一成員標記的至少一個非天然核苷酸可以位于可切割探針的5’端。在某些方面，所述可切割探針可以在3’端包含延伸阻斷修飾。在某些方面，所述可切割探針的第二序列區可以包含至少50％的G/C含量。在某些方面，所述可切割探針的第二序列區的長度可以是6-15個核苷酸。在某些方面，所述可切割探針的第二序列區可包含一個或更多個非天然堿基。在某些方面，在內切核糖核酸酶或5’-核酸酶切割后，所述截短的可切割探針和靶核酸的解鏈點(meltpoint)可低于55℃。在某些方面，所述報告基團-淬滅基團對的第一成員可以是報告基團。在某些方面，用于本實施方案中的報告基團可以是熒光團。因此，在一些情況下，信號改變可以是熒光信號降低。在某些方面，所述檢測標記物的信號改變可以包括隨著樣品的溫度改變檢測來自報告基團的信號改變(或變化速率)，例如信號的不淬滅(unquenching)。在一些方面，所述檢測報告基團的信號改變可以包括當樣品的溫度升高到發夾探針的解鏈點以上(或降低到發夾探針的解鏈點以下)時檢測報告基團的信號改變。在某些方面，所述可切割探針可以連接至固體支持物。實施方案的某些方面涉及使用至少一個非天然核苷酸(iv)。在一些方面，所述非天然核苷酸是異堿基(isobase)，例如異鳥嘌呤(isoG)或異胞嘧啶(isoC)。在某些方面，至少一個非天然核苷酸或淬滅基團標記的非天然核苷酸可以是isoG，并且另一個可以是isoC。在另一方面，所述方法可包括(a)使所述樣品與第二(或另外的)可切割探針接觸，所述探針從5’至3’包含(i)包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標記的至少一個非天然核苷酸的第一序列區；(ii)第二序列區；(iii)為第二序列區的反向互補序列的序列；和(iv)包含與第二(或另外的)靶核酸第一鏈上的第一區互補的一個或更多個核糖核苷酸堿基的序列；(b)使所述可切割探針與內切核糖核酸酶接觸，從而切割與靶核酸雜交的探針以形成截短的可切割探針；(c)使所述截短的可切割探針與其自身雜交以形成發夾探針；(d)在能夠與第一序列區的至少一個非天然核苷酸堿基配對的用報告基團-淬滅基團對的第二成員標記的非天然核苷酸的存在下延伸所述發夾探針；以及(e)通過檢測可切割探針和發夾探針上標記物的信號改變來檢測第二(或另外的)靶核酸。例如，檢測第一和/或第二靶核酸的存在可以依次或基本上同時進行。在另一方面，所述第一和第二探針可以包含可區分的報告基團。在另一方面，所述第一和第二探針可以包含相同的報告基團，并且在一些情況下，所述第一和第二探針包含具有可區分的解鏈點的發夾(例如，解鏈點彼此相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或其中可導出的任何范圍)。在另一方面，所述方法是多重方法(multiplexmethod)，并且包括(a)使樣品與第三、第四、第五或第六可切割探針接觸，所述探針從5’至3’包含(i)包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標記的至少一個非天然核苷酸的第一序列區；(ii)第二序列區；(iii)為第二序列區的反向互補序列的序列；和(iv)包含與第三、第四、第五或第六靶核酸第一鏈上的第一區互補的一個或更多個核糖核苷酸堿基的序列；(b)使所述可切割探針與內切核糖核酸酶接觸，從而切割與靶核酸雜交的探針以形成截短的可切割探針；(c)使所述截短的可切割探針與其自身雜交以形成發夾探針；(d)在能夠與第一序列區的至少一個非天然核苷酸堿基配對的用報告基團-淬滅基團對的第二成員標記的非天然核苷酸的存在下延伸所述發夾探針；以及(e)通過檢測可切割探針和發夾探針上標記物的信號改變來檢測第三、第四，第五或第六靶核酸。例如，檢測第一和/或第二靶核酸的存在可以依次或基本上同時進行。在另一方面，所述第一和第二探針可以包含可區分的報告基團。在另一方面，所述第一和第二探針可以包含相同的報告基團，并且在一些情況下，由所述第一和第二探針形成的發夾探針可以具有可區分的解鏈點(例如，解鏈點彼此相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或其中可導出的任何范圍)。在一個方面，由第一、第二、第三、第四、第五和/或第六探針形成的發夾探針各自可包含可區分的標記物或可區分的解鏈點。在另一個實施方案中，所述方法可包括(a)使所述樣品與第二(或另外的)可切割探針接觸，所述探針從5’至3’包含(i)包含報告基團-淬滅基團對的第一序列區；(ii)第二序列區；(iii)為第二序列區的反向互補序列的序列；和(iv)包含與第二(或另外的)靶核酸第一鏈上的第一區互補的一個或更多個核糖核苷酸堿基的序列；(b)使所述可切割探針與內切核糖核酸酶接觸，從而切割與靶核酸雜交的探針以形成截短的可切割探針；(c)使所述截短的可切割探針與其自身雜交以形成發夾探針；(d)將所述發夾探針在第一序列區上延伸；以及(e)通過檢測報告基團的信號改變來檢測第二(或另外的)靶核酸。例如，檢測第一和/或第二靶核酸的存在可以依次或基本上同時進行。在另一方面，所述第一和第二探針可以包含可區分的報告基團。在另一方面，所述第一和第二探針可以包含相同的報告基團，并且在一些情況下，所述第一和第二探針包含具有可區分的解鏈點的發夾(例如，解鏈點彼此相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或其中可導出的任何范圍)。在又一方面，所述方法是多重方法，并且包括(a)使所述樣品與第三、第四、第五或第六可切割探針接觸，所述探針從5’至3’包含(i)包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標記的至少一個非天然核苷酸的第一序列區；(ii)第二序列區；(iii)為第二序列區的反向互補序列的序列；和(iv)包含與第三、第四、第五或第六靶核酸第一鏈上的第一區互補的一個或更多個核糖核苷酸堿基的序列；(b)使所述可切割探針與內切核糖核酸酶接觸，從而切割與靶核酸雜交的探針以形成截短的可切割探針；(c)使所述截短的可切割探針與其自身雜交以形成發夾探針；(d)在能夠與第一序列區的至少一個非天然核苷酸堿基配對的用報告基團-淬滅基團對的第二成員標記的非天然核苷酸的存在下延伸所述發夾探針；以及(e)通過檢測可切割探針和發夾探針上標記物的信號改變來檢測第三、第四、第五或第六靶核酸。例如，檢測第一和/或第二靶核酸的存在可以依次或基本上同時進行。在另一方面，所述第一和第二探針可以包含可區分的報告基團。在另一方面，所述第一和第二探針可以包含相同的報告基團，并且在一些情況下，由所述第一和第二探針形成的發夾探針可以包含可區分的解鏈點(例如，解鏈點彼此相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或其中可導出的任何范圍)。在一個方面，由第一、第二、第三、第四、第五和/或第六探針形成的發夾探針各自可包含可區分的標記物或具有可區分的解鏈點。因此，在一些其他方面，根據實施方案的多重方法可包括使用至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多種不同探針(或其中可導出的任何范圍)，其中每種探針具有(1)可區分的解鏈點或包含(2)可區分的標記物，以使得來自每種不同探針的信號可以被單獨辨別。在一個方面，所述第一、第二、第三、第四、第五和/或第六可切割探針各自可以包含相同的第一序列區，第二序列區和/或第二序列區與為第二序列區的反向互補序列的序列之間的相同環序列。在某些實施方案中，所述環區可以包含一個或更多個聚合酶延伸阻斷部分。在另一個實施方案中，提供了組合物，其包含至少第一可切割探針，所述探針從5’至3’包含(i)包含標記物的第一序列區；(ii)第二序列區；(iii)為第二序列區的反向互補序列的序列；和(iv)包含與靶核酸第一鏈上的第一區互補的一個或更多個核糖核苷酸堿基的序列。在某些方面，所述組合物還可包含報告基團標記的或淬滅基團標記的非天然核苷酸。在某些實施方案中，所述第一序列區(i)中的標記物是報告基團-淬滅基團對或用報告基團-淬滅基團對的第一成員標記的至少一個非天然核苷酸。在一個實施方案中，提供了組合物，其包含至少第一可切割探針，所述探針從5’至3’包含(i)包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標記的至少一個非天然核苷酸的第一序列區；(ii)第二序列區；(iii)為第二序列區的反向互補序列的序列；和(iv)包含與靶核酸第一鏈上的第一區互補的一個或更多個核糖核苷酸堿基的序列。在某些方面，所述組合物還可包含報告基團標記的或淬滅基團標記的非天然核苷酸。在一個實施方案中，提供了組合物，其包含可切割探針，所述探針從5’至3’包含(i)用熒光團-淬滅基團對標記的第一序列區；(ii)第二序列區；(iii)為第二序列區的反向互補序列的序列；和(iv)包含與靶核酸第一鏈上的第一區互補的一個或更多個核糖核苷酸堿基的序列。在某些方面，所述組合物還可以包含聚合酶、內切核糖核酸酶、參照探針或游離核苷酸。在某些方面，所述可切割探針還可以包含(v)在第二序列區和為第二序列區的反向互補序列的序列之間的一個或更多個核苷酸的環序列。在一些方面，環序列的長度可以是4-20、6-15或10-15個核苷酸。在一些方面，環序列可以包含至少3-5個連續的A核苷酸。在一些實施方案中，所述環序列包含一個或更多個聚合酶延伸阻斷部分。在某些方面，所述環序列可以包含一個或更多個核苷酸和一個或更多個延伸阻斷部分的組合。聚合酶延伸阻斷部分可以用作環序列的一部分或全部。延伸阻斷部分的實例包括碳間隔區。碳間隔區可以包括長度可以為3至36個碳原子的間隔區。內部寡核苷酸碳間隔區的常見實例包括長度為3、9和18個碳原子的間隔區。碳間隔區可用于防止可切割探針形成非特異性雙鏈PCR產物。碳間隔區也可以用于調節發夾探針的解鏈溫度(Tm)。其他聚合酶延伸阻斷部分可包含非天然核苷酸、核糖核苷酸或任何其他非核苷酸化學部分。在另一方面，所述組合物還可包含如上所述的第二(或另外的)可切割探針，其中不同探針可基于具有不同報告基團和/或不同解鏈點而可區分。例如，第二(或另外的)探針可以從5’到3’包含(i)包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標記的至少一個非天然核苷酸的第一序列區；(ii)第二序列區；(iii)為第二序列區的反向互補序列的序列；和(iv)包含與第二(或另外的)靶核酸第一鏈上的第一區互補的一個或更多個核糖核苷酸堿基的序列。在某些方面，所述第一和第二探針可以包含可區分的報告基團和/或形成具有可區分的解鏈點的發夾。在某些方面，所述可切割探針還可以包含(v)如上所述的環序列。在一些方面，所述組合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多種探針。在一些方面，實施方案的方法還可以包括進行多個聚合酶鏈式反應循環。在一些方面，檢測標記物的信號改變包括在進行多個聚合酶鏈式反應循環之前、期間或之后檢測信號。在另一方面，檢測標記物的信號改變包括僅在進行多個聚合酶鏈式反應循環之后檢測信號。在該方面，方法還可以包括將所檢測到的標記物之信號與預定比相比較，所述預定比為標記物的信號與非雜交探針上標記物之參照信號的比。在一些方面，實施方案的方法還可以包括定量樣品中靶核酸的量。例如，定量樣品中靶核酸的量可以包括：使用標準曲線；確定所述靶核酸的相對量；使用終點定量；或通過將所述信號相對于背景可檢測時的PCR循環數與存在的靶標的量相關聯來確定所述靶核酸的量。在另一個實施方案中，提供了包含一種或更多種本文公開的組合物的試劑盒。例如，在一個實施方案中，提供了試劑盒，其包含：(a)第一可切割探針，所述探針從5’至3’包含(i)包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標記的至少一個非天然核苷酸的第一序列區；(ii)第二序列區；(iii)為第二序列區的反向互補序列的序列；和(iv)包含與靶核酸第一鏈上的第一區互補的一個或更多個核糖核苷酸堿基的序列；和(b)報告基團標記的非天然核苷酸；淬滅基團標記的非天然核苷酸；或內切核糖核酸酶。在另一方面，所述試劑盒包含至少兩種、三種、四種、五種或六種探針。在一些實施方案中，所述探針還可以包含(v)如上所述的環序列。在某些方面，所述探針可以包含可區分的報告基團或形成具有可區分的解鏈點的發夾。在一些方面，所述試劑盒還可以包含聚合酶、參照探針、游離核苷酸或試劑盒的使用說明書。在另一個實施方案中，提供了用于檢測靶核酸存在的方法，其包括：(a)使樣品與第一探針組接觸，所述探針組包含可切割探針和捕獲探針，所述可切割探針從5’至3’包含(i)包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標記的至少一個非天然核苷酸的序列區；(ii)捕獲序列；和(iii)包含與靶核酸第一鏈上的第一區互補的一個或更多個核糖核苷酸堿基的序列；所述捕獲探針從5’至3’包含(i)與來自可切割探針的序列區相同的序列區，其包含與來自可切割探針的至少一個非天然核苷酸相同的至少一個未標記的非天然核苷酸；和(ii)與可切割探針的捕獲序列互補的序列；(b)使所述可切割探針與內切核糖核酸酶接觸，從而切割與靶核酸雜交的探針以形成截短的可切割探針；(c)使所述截短的可切割探針與捕獲探針雜交；(d)在能夠與捕獲探針中的至少一個未標記的非天然核苷酸堿基配對的用報告基團-淬滅基團對的第二成員標記的非天然核苷酸的存在下延伸所述截短的可切割探針以形成延伸的可切割探針；(e)使所述延伸的可切割探針與其自身雜交以形成發夾探針；以及(f)通過檢測可切割探針和發夾探針上標記物的信號改變來檢測靶核酸。在另一方面，方法可以包括(a)使樣品與第二探針組接觸，所述探針組包含可切割探針和捕獲探針，所述可切割探針從5’至3’包含(i)包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標記的至少一個非天然核苷酸的序列區；(ii)捕獲序列；和(iii)與第二靶核酸第一鏈上的第一區互補的包含一個或更多個核糖核苷酸堿基的序列；所述捕獲探針從5’至3’包含(i)與來自可切割探針的序列區相同的序列區，其包含與來自可切割探針的至少一個非天然核苷酸相同的至少一個未標記的非天然核苷酸；和(ii)與可切割探針的捕獲序列互補的序列；(b)使所述可切割探針與內切核糖核酸酶接觸，從而切割與第二靶核酸雜交的探針以形成截短的可切割探針；(c)使所述截短的可切割探針與捕獲探針雜交；(d)在能夠與捕獲探針中的至少一個未標記的非天然核苷酸堿基配對的淬滅基團標記的非天然核苷酸的存在下延伸所述截短的可切割探針以形成延伸的可切割探針；(e)使延伸的可切割探針與其自身雜交以形成發夾探針；以及(f)通過檢測可切割探針和發夾探針上標記物的信號改變來檢測第二靶核酸。在某些方面，可切割探針可以包含這樣的序列，所述序列包含與靶核酸序列第一鏈上的第一區互補的1至5個核糖核苷酸堿基的。在一些方面，可切割探針可以包含這樣的序列，所述序列包含與靶核酸序列的第一鏈上第一區互補的3至5個核糖核苷酸堿基。在另一方面，所述方法是多重方法，并且包括(a)使所述樣品與第三、第四、第五或第六探針組接觸，所述探針組包含可切割探針和捕獲探針，所述可切割探針從5’至3’包含(i)包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標記的至少一個非天然核苷酸的序列區；(ii)捕獲序列；和(iii)包含與第三、第四、第五或第六靶核酸第一鏈上的第一區域互補的一個或更多個核糖核苷酸堿基的序列；所述捕獲探針從5’至3’包含(i)與來自可切割探針的序列區相同的序列區，其包含與來自可切割探針的所述至少一個非天然核苷酸相同的至少一個未標記的非天然核苷酸；和(ii)與可切割探針的捕獲序列互補的序列；(b)使所述可切割探針與內切核糖核酸酶接觸，從而切割與第三、第四、第五或第六靶核酸雜交的探針以形成截短的可切割探針；(c)使所述截短的可切割探針與捕獲探針雜交；(d)在能夠與捕獲探針中的至少一個未標記的非天然核苷酸堿基配對的淬滅基團標記的非天然核苷酸的存在下延伸所述截短的可切割探針以形成延伸的可切割探針；(e)使所述延伸的可切割探針與其自身雜交以形成發夾探針；以及(f)通過檢測可切割探針和發夾探針上標記物的信號改變來檢測第三、第四、第五或第六靶核酸。例如，檢測第一和/或第二靶核酸的存在可以依次或基本上同時進行。在另一方面，所述第一和第二探針組可以包含可區分的報告基團。在另一方面，所述第一和第二探針組可以包含相同的報告基團，并且在一些情況下，由所述第一和第二探針形成的發夾探針可以包含可區分的解鏈點(例如，解鏈點彼此相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或其中可導出的任何范圍)。在一個方面，由第一、第二、第三、第四、第五和/或第六探針組形成的發夾探針各自可包含可區分的標記物或具有可區分的解鏈點。因此，在一些其他方面，根據一些實施方案的多重方法可以包括使用至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多個不同的探針組，其中每種探針具有(1)可區分的解鏈點或包含(2)可區分的標記物，以使得來自每種不同探針的信號可以被單獨辨別。在某些方面，可切割探針的第二序列區可包含一個或更多個非天然堿基。在某些方面，在內切核糖核酸酶切割后，截短的可切割探針和靶核酸的解鏈點可低于55℃。在某些方面，所述報告基團-淬滅基團對的第一成員可以是報告基團，例如熒光團。在一些方面，所述信號改變可以是熒光信號降低。在某些方面，所述檢測標記物的信號改變可以包括隨著樣品的溫度改變檢測報告基團的信號改變。在一些方面，所述檢測報告基團的信號改變可以包括當樣品的溫度升高到高于發夾探針的解鏈點時檢測報告基團的信號改變。在某些方面，所述可切割探針和/或捕獲探針可以連接至固體支持物。在另一個實施方案中，提供了組合物，其包含第一探針組，所述探針組包含可切割探針和捕獲探針，所述可切割探針從5’至3’包含(i)包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標記的至少一個非天然核苷酸的序列區；(ii)捕獲序列；和(iii)包含與靶核酸第一鏈上的第一區互補的一個或更多個核糖核苷酸堿基的序列；所述捕獲探針從5’至3’包含(i)與來自可切割探針的序列區相同的序列區，其包含與來自可切割探針的所述至少一個非天然核苷酸相同的至少一個未標記的非天然核苷酸；和(ii)與可切割探針的捕獲序列互補的序列。在某些方面，所述組合物還可以包含報告基團標記的或淬滅基團標記的非天然核苷酸。在某些方面，所述組合物可以包含聚合酶、參照探針或游離核苷酸。在另一方面，所述組合物還可包含第二探針組，所述探針組包含可切割探針和捕獲探針，所述可切割探針從5’至3’包含(i)包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標記的至少一個非天然核苷酸的序列區；(ii)捕獲序列；和(iii)包含與第二靶核酸第一鏈上的第一區互補的一個或更多個核糖核苷酸堿基的序列；所述捕獲探針從5’到3’包含(i)與來自可切割探針的序列區相同的序列區，其包含與來自可切割探針的至少一個非天然核苷酸相同的至少一個未標記的非天然核苷酸；和(ii)與可切割探針的捕獲序列互補的序列。在某些方面，所述第一和第二探針組可以包含可區分的報告基團和/或形成具有可區分的解鏈點的發夾。在一些方面，所述組合物包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多個探針組。在另一個實施方案中，提供了試劑盒，其包含(a)第一探針組，所述探針組包含可切割探針和捕獲探針，所述可切割探針從5’至3’包含(i)包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標記的至少一個非天然核苷酸的序列區；和(iii)包含與靶核酸第一鏈上的第一區互補的一個或更多個核糖核苷酸堿基的序列；所述捕獲探針從5’到3’包含(i)與來自可切割探針的序列區相同的序列區，其包含與來自可切割探針的至少一個非天然核苷酸相同的至少一個未標記的非天然核苷酸；和(ii)與可切割探針的捕獲序列互補的序列；以及(b)報告基團標記的非天然核苷酸；淬滅基團標記的非天然核苷酸；或內切核糖核酸酶。在另一方面，所述試劑盒包含至少四組探針。在某些方面，所述探針組可以包含可區分的報告基團或形成具有可區分的解鏈點的發夾。在一些方面，所述試劑盒還可以包含聚合酶、參照探針、游離核苷酸、參照樣品或試劑盒的使用說明書。在又一個實施方案中，提供了用于檢測靶核酸存在的方法，其包括：(a)使樣品與第一探針組接觸，所述探針組包含可切割探針和捕獲探針，所述可切割探針從5’至3’包含(i)包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標記的至少一個非天然核苷酸的序列區；(ii)捕獲序列；和(iii)包含與靶核酸第一鏈上的第一區互補的一個或更多個核糖核苷酸堿基的序列；所述捕獲探針從5’到3’包含(i)與來自可切割探針的序列區的一部分相同的序列區和(ii)與可切割探針的捕獲序列互補的序列；(b)使所述可切割探針與內切核糖核酸酶接觸，從而切割與靶核酸雜交的可切割探針以形成截短的可切割探針；(c)使所述截短的可切割探針與捕獲探針雜交；(d)延伸所述截短的可切割探針以形成延伸的探針；(e)使所述延伸的可切割探針與其自身雜交以形成發夾探針；(f)在能夠與可切割探針的5’的至少一個標記的非天然核苷酸堿基配對的用報告基團-淬滅基團對的第二成員標記的非天然核苷酸的存在下進一步延伸所述發夾探針；以及(g)通過檢測來自可切割探針和發夾探針上標記物的信號改變來檢測靶核酸。在另一方面，所述方法可以包括(a)使所述樣品與第二探針組接觸，所述探針組包含可切割探針和捕獲探針，所述可切割探針從5’至3’包含(i)包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標記的至少一個非天然核苷酸的序列區；(ii)捕獲序列；和(iii)包含與第二靶核酸第一鏈上的第一區互補的一個或更多個核糖核苷酸堿基的序列；所述捕獲探針從5’到3’包含(i)與來自可切割探針的序列區的一部分相同的序列區和(ii)與可切割探針的捕獲序列互補的序列；(b)使所述可切割探針與內切核糖核酸酶接觸，從而切割與靶核酸雜交的可切割探針以形成截短的可切割探針；(c)使所述截短的可切割探針與捕獲探針雜交；(d)延伸所述截短的可切割探針以形成延伸的探針；(e)使所述經延伸的可切割探針與其自身雜交以形成發夾探針；(f)在能夠與可切割探針的5’的至少一個標記的非天然核苷酸堿基配對的報告基團-淬滅基團對的用第二成員標記的非天然核苷酸的存在下進一步延伸所述發夾探針；以及(g)通過檢測可切割探針和發夾探針上標記物的信號改變來檢測第二靶核酸。在某些方面，所述可切割探針可以包含這樣的序列，所述序列包含與靶核酸序列的第一鏈上的第一區互補的1至5個核糖核苷酸堿基。在一些方面，所述可切割探針可以包含這樣的序列，所述序列包含與靶核酸序列的第一鏈上的第一區互補的3至5個核糖核苷酸堿基。在另一方面，所述方法是多重方法，并且包括(a)使所述樣品與第三、第四、第五或第六探針組接觸，所述探針組包含可切割探針和捕獲探針，所述可切割探針從5’至3’包含(i)包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標記的至少一個非天然核苷酸的序列區；(ii)捕獲序列；和(iii)包含與第三、第四、第五或第六靶核酸第一鏈上的第一區互補的一個或更多個核糖核苷酸堿基的序列；所述捕獲探針從5’到3’包含(i)與來自可切割探針的序列區的一部分相同的序列區和(ii)與可切割探針的捕獲序列互補的序列；(b)使所述可切割探針與內切核糖核酸酶接觸，從而切割與靶核酸雜交的可切割探針以形成截短的可切割探針；(c)使所述截短的可切割探針與捕獲探針雜交；(d)延伸所述截短的可切割探針以形成延伸的探針；(e)使所述延伸的可切割探針與其自身雜交以形成發夾探針；(f)在能夠與可切割探針的5’的至少一個標記的非天然核苷酸堿基配對的用報告基團-淬滅基團對的第二成員標記的非天然核苷酸的存在下進一步延伸所述發夾探針；以及(g)通過檢測所述可切割探針和發夾探針上標記物的信號改變來檢測第三、第四、第五或第六靶核酸。例如，檢測第一、第二和/或另外的靶核酸的存在可以依次或基本上同時進行。在另一方面，所述第一、第二和/或另外的探針組可以包含可區分的報告基團。在另一方面，所述第一、第二和/或另外的探針組可以包含相同的報告基團，并且在一些情況下，由所述第一和第二探針形成的發夾探針可具有可區分的解鏈點(例如，解鏈點彼此相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或其中可導出的任何范圍)。在一個方面，由第一、第二、第三、第四、第五和/或第六探針組形成的發夾探針各自可包含可區分的標記物或可區分的解鏈點。因此，在一些另外的方面，根據實施方案的多重方法可以包括使用至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多個不同的探針組，其中每種探針包含(1)可區分的解鏈點或(2)可區分的標記物，以使得來自每種不同探針的信號可以被單獨辨別。在某些方面，所述可切割探針的第二序列區可包含一個或更多個非天然堿基。在某些方面，在內切核糖核酸酶切割后，所述截短的可切割探針和靶核酸的解鏈點可低于55℃。在某些方面，所述報告基團-淬滅基團對的第一成員可以是報告基團，例如熒光團。在一些方面，所述信號改變可以是熒光信號降低。在某些方面，所述檢測標記物的信號改變可以包括隨著樣品的溫度改變檢測報告基團的信號改變。在一些方面，所述檢測報告基團的信號改變可以包括當樣品的溫度升高到高于發夾探針的解鏈點時檢測報告基團的信號改變。在某些方面，所述可切割探針和/或捕獲探針可以連接至固體支持物。在另一個實施方案中，提供了組合物，其包含第一探針組，所述探針組包含可切割探針和捕獲探針，所述可切割探針從5’至3’包含(i)包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標記的至少一個非天然核苷酸的序列區；(ii)捕獲序列；和(iii)包含與靶核酸第一鏈上的第一區互補的一個或更多個核糖核苷酸堿基的序列；所述捕獲探針從5’到3’包含(i)與來自可切割探針的序列區的一部分相同的序列區和(ii)與可切割探針的捕獲序列互補的序列。在某些方面，所述組合物還可以包含報告基團標記的或淬滅基團標記的非天然核苷酸。在某些方面，所述組合物可以包含聚合酶、參照探針或游離核苷酸。在另一方面，組合物還可以包含第二探針組，所述探針組包含可切割探針和捕獲探針，所述可切割探針從5’至3’包含(i)包含周報告基團-淬滅基團對的第一成員標記的至少一個非天然核苷酸的序列區；(ii)捕獲序列；和(iii)包含與第二靶核酸第一鏈上的第一區互補的一個或更多個核糖核苷酸堿基的序列；所述捕獲探針從5’到3’包含(i)與來自可切割探針的序列區的一部分相同的序列區和(ii)與可切割探針的捕獲序列互補的序列。在某些方面，所述第一和第二探針組可以包含可區分的報告基團和/或形成具有可區分的解鏈點的發夾。在一些方面，所述組合物包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多個探針組。在另一個實施方案中，提供了試劑盒，其包含(a)第一探針組，所述探針組包含可切割探針和捕獲探針，所述可切割探針從5’至3’包含(i)包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標記的至少一個非天然核苷酸的序列區；(ii)捕獲序列；和(iii)包含與靶核酸第一鏈上的第一區互補的一個或更多個核糖核苷酸堿基的序列；所述捕獲探針從5’到3’包含(i)與來自可切割探針的序列區的一部分相同的序列區和(ii)與可切割探針的捕獲序列互補的序列；以及(b)報告基團標記的非天然核苷酸；淬滅基團標記的非天然核苷酸；或內切核糖核酸酶。在另一方面，所述試劑盒包含至少四組探針。在某些方面，所述探針組可以包含可區分的報告基團或形成具有可區分解鏈點的發夾。在一些方面，所述試劑盒還可以包含聚合酶、參照探針、游離核苷酸、參照樣品或試劑盒的使用說明書。在另一個實施方案中，提供了用于檢測靶核酸存在的方法，其包括：(a)使樣品與第一可切割探針接觸，所述探針從5’至3’包含(i)包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標記的至少一個非天然核苷酸的第一序列區；(ii)第二序列區；(iii)為第二序列區的反向互補序列的序列；和(iv)與靶核酸第一鏈上的第一區互補的序列；(b)使可切割探針和上游引物與靶核酸雜交，并使用具有5’核酸酶活性的聚合酶進行延伸；(c)延伸核酸序列，直到可切割發夾探針與具有核酸酶活性的聚合酶接觸，從而切割與靶核酸雜交的探針以形成截短的可切割探針；(d)使所述截短的可切割探針與其自身雜交以形成發夾探針；(e)在能夠與第一序列區的至少一個非天然核苷酸堿基配對的用報告基團-淬滅基團對的第二成員標記的非天然核苷酸的存在下延伸所述發夾探針；以及(f)通過檢測所述發夾探針上標記物的信號改變來檢測所述靶核酸。在某些方面，所述為第二序列區的反向互補序列的序列(iii)的一部分可以與靶核酸第一鏈上的第一區互補。在某些實施方案中，所述方法還可以包括對發夾探針進行解鏈分析。在另一個實施方案中，提供了用于檢測靶核酸存在的方法，其包括：(a)使樣品與第一可切割發夾探針接觸，所述探針從5’至3’包含(i)用報告基團-淬滅基團對標記的第一序列區；(ii)第二序列區；(iii)為第二序列區的反向互補序列的序列；和(iv)與靶核酸第一鏈上的第一區互補的序列；(b)使可切割探針和上游引物與靶核酸雜交，并使用具有5’核酸酶活性的聚合酶進行延伸；(c)延伸核酸序列，直到可切割發夾探針與具有核酸酶活性的聚合酶接觸，從而切割與靶核酸雜交的探針以形成截短的可切割探針；(d)使所述截短的探針與其自身雜交以形成經切割的發夾探針；(e)將經切割的發夾探針在其自身上延伸，以使得熒光團和淬滅基團物理分離；(f)通過檢測延伸的發夾探針的信號改變來檢測所述靶核酸。實施方案的某些方面涉及采用至少一個非天然核苷酸。在一些方面，非天然核苷酸為異堿基(isobase)，例如異鳥嘌呤(isoG)或異胞嘧啶(isoC)。在該方面，淬滅基團標記的非天然核苷酸為同源isoC(或isoG)。在另一些方面，第一和/或第二引物的至少一個在靶特異性序列中包含至少一個非天然核苷酸。例如，在某些方面，靶特異性序列中的非天然核苷酸調節序列特異性退火，由此增強了核苷酸的序列特異性擴增的引物-模板雜交(參見例如PCT公開WO2011/052078，通過引用并入本文)。本文公開的可切割探針的切割和延伸可以在等溫條件下進行，其中切割和延伸可切割探針，同時反應條件保持在基本上恒定的溫度。可以實現信號的等溫放大，這是因為經切割探針的兩個片段與靶的解鏈溫度比切割之前探針與靶的解鏈溫度更低。這導致兩個片段與靶解離，允許另一個探針雜交和切割。這個過程自我重復，允許多個探針在恒定溫度下從單個靶切割和延伸。該特征與涉及通過解鏈分析的封閉管多重檢測的其他方法相比是獨特的，后者依賴于5’-核酸酶活性以獲得獨特的解鏈特征，不能等溫地擴增靶標或擴增子的信號。或者，本文公開的可切割探針的切割和延伸可以在非等溫條件下進行，例如在PCR的循環溫度條件下進行。在一些方面，實施方案的方法還可以包括進行擴增步驟以擴增靶序列。可切割探針的切割和延伸可以在擴增過程期間或之后進行。例如，擴增可以是等溫擴增或者一個或更多個聚合酶鏈式反應循環。等溫擴增技術包括例如鏈置換擴增(stranddisplacementamplification，SDA)、環介導的擴增(loop-mediatedamplification，LAMP)、滾環擴增(rollingcircleamplification，RCA)和解旋酶依賴性擴增(helicase-dependentamplification，HAD)(參見例如Yan等，2014)。在一些方面，檢測標記物的信號改變包括在進行等溫擴增或多個聚合酶鏈式反應循環之前、期間或之后檢測信號。在另一方面，檢測標記物的信號改變包括僅在進行等溫擴增或多個聚合酶鏈式反應循環之后檢測信號。在該方面，所述方法還可以包括將所檢測到的標記物之信號與預定比相比較，所述預定比為所述標記物的信號與非雜交探針上標記物的參照信號的比。在一些方面，實施方案的方法還可以包括定量樣品中靶核酸的量。例如，定量樣品中靶核酸的量可以包括：使用數字PCR；使用標準曲線；確定核酸靶的相對量；使用終點定量；或通過將所述信號相對于背景可檢測時的PCR循環數與存在的靶標量相關聯來確定所述靶核酸的量。在本方法的多個方面，檢測報告基團的信號改變可以包括隨著樣品的溫度改變檢測信號改變(或變化率)，例如信號不淬滅。在一個方面，樣品的溫度可以升高到樣品中一種或更多種引物的發夾的解鏈點以上(或降低到其以下)。在存在兩個或更多個引物組的情況下，改變樣品的溫度可以包括將樣品的溫度從低于第一引物組的第一引物和第二引物組的第一引物兩者的溫度升高到高于兩個發夾的解鏈點的溫度。在多個方面，實施方案的探針可以包含相同的報告基團并且包含具有可區分的解鏈點的發夾(例如，解鏈點彼此相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃的，或其中可導出的任何范圍)。在進一步的多個方面，根據實施方案的多重方法可包括使用至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多個不同探針組，其中每個探針或探針組包含(1)具有可區分的解鏈點的發夾或(2)可區分的報告基團，以使得來自每個不同探針或探針組的信號可以單獨辨別。在另一個實施方案中，提供了包含實施方案的一個或更多個探針或探針組的試劑盒。在另一方面，試劑盒還包含具有外切核酸酶活性的聚合酶、內切核糖核酸酶(例如，RNA酶H)、參照探針、游離核苷酸、游離非天然核苷酸、參照樣品和/或試劑盒的使用說明書。如本文中使用的，固體支持物可以為具有磁性的珠和/或具有使其停留在溶液中二維表面上之密度的珠。顆粒可以通過磁力、重力或離子力或通過化學鍵或本領域技術人員已知的任何其他方式中的一種或另一種停留在二維表面上。顆粒可以由玻璃、聚苯乙烯、乳膠、金屬、量子點、聚合物、硅石、金屬氧化物、陶瓷或任意其它適于結合核酸的物質，或者然后可以連接至核酸的化學物質或蛋白質組成。所述顆粒可以為桿狀或球形或盤形，或包括其他任意形狀。所述顆粒還可以通過其形狀或大小或物理位置而區分開來。由于具有組合物可使得所述顆粒在光譜上不同，所述組合物包含染料或包含多個比或多個濃度的一種或多種染料或熒光染料，或者通過條形碼或全息圖像或其它印跡形式的顆粒編碼可以將所述顆粒區分開。當顆粒為磁性顆粒時，可以通過施加磁場將它們吸引至室表面。同樣地，通過去除磁場，可以將磁性顆粒從室表面分散開來。磁性顆粒優選為順磁或超順磁。在沒有磁場時，順磁和超順磁顆粒具有可忽略的磁性，但是施加磁場誘導顆粒中的磁域對齊，從而導致顆粒被吸引至場源。當去除所述場時，磁域恢復至隨機方向，從而顆粒間無磁性吸引或排斥。在超順磁性的情況下，磁域幾乎立即恢復至域的隨機方向，而順磁材料在去除磁場之后的一段時間內將仍保持域對齊。當顆粒具有足夠的密度時，通過重力可以將它們吸引至室的底面，并通過攪拌室(例如通過渦旋、超聲或流體運動)，從室的底面分散開來。室的攪拌還可以用于在方法和系統中進一步幫助顆粒分散，在所述方法和系統中，顆粒通過其它力被吸引至室表面，例如磁力或離子力、或吸力、或真空過濾、或親和力、或親水性或疏水性，或其任意組合。標記物或標簽試劑是一種分子，其有利于檢測其所連接的分子(例如核酸序列)。已知有大量的報告基團分子可以用于標記核酸。直接的報告基團分子包括熒光團、生色團和放射團(radiophore)。熒光團的非限制性實例包括例如紅色熒光方酸菁染料(squarinedye)(例如2，4-雙[1，3，3-三甲基-2-二氫亞吲哚基甲基]環丁烯二-1，3-二氧戊環(2，4-Bis[1，3,3-trimethyl-2-indolinylidenemethyl]cyclobutenediylium-1,3-dio-xolate))、紅外染料(例如2,4雙[3，3-二甲基-2-(1H-苯基[e]二氫亞吲哚基甲基)]環丁烯二-1，3-二氧戊環(2，4Bis[3，3-dimethyl-2-(1H-benz[e]indolinylidenemethyl)]cyclobutenediylium-1，3-dioxolate))或橙色熒光方酸菁染料(例如2，4-雙[3，5-二甲基-2-吡咯基]環丁烯二-1,3-二氧戊環(2，4-Bis[3，5-dimethyl-2-pyrrolyl]cyclobutenediylium-1,3-diololate))。熒光團的另一些非限制性實例包括：量子點，AlexaFluorTM染料，AMCA，BODIPYTM630/650，BODIPYTM650/665，BODIPYTM-FL，BODIPYTM-R6G，BODIPYTM-TMR，BODIpYTM-TRX，CascadeBlueTM，CyDyeTM，包括但不限于Cy2TM、Cy3TM和Cy5TM，DNA嵌入染料，6-FAMTM，熒光素，HEXTM，6-JOE，OregonGreenTM488，OregonGreenTM500，OregonGreenTM514，PacificBlueTM，REG，藻膽蛋白(phycobilliprotein)包括但不限于藻紅蛋白和別藻藍蛋白，RhodamineGreenTM，RhodamineRedTM，ROXTM，TAMRATM，TETTM，四甲基羅丹明，或TexasRedTM。信號放大試劑，例如tyramide(PerkinElmer)，可以用于增強熒光信號。間接報告基團分子包括生物素，其必須結合另一分子(例如鏈霉親和素-藻紅蛋白)以進行檢測。也可以采用標志物對，例如熒光共振能量轉移對或染料-淬滅基團對。標記的擴增產物可以被直接或間接標記。可以通過例如采用標記的引物，標記的dNTP、標記的核酸嵌入劑或上述組合實現直接標記。可以通過例如將標記的探針與擴增產物雜交實現間接標記。本文公開的方法還可以包括對樣品中的靶核酸的初始量進行定量。所述定量可以包括例如通過在對數坐標上相對于循環數對熒光作圖，來在實時PCR的指數期內確定存在的DNA相對濃度。之后，可通過將結果與標準曲線比較來確定DNA的量，通過對已知量DNA的連續稀釋進行實時PCR生成所述標準曲線。另外，實時PCR可以與逆轉錄聚合酶鏈式反應組合以對樣品中的RNA(包括低豐度RNA)進行定量。或者可通過數字PCR實現定量。靶核酸序列可以是任何感興趣的序列。包含靶核酸序列的樣品可以是包含核酸的任何樣品。在本發明的某些方面，樣品是例如正在篩選一種或更多種遺傳突變或多態性的存在或不存在的對象。在本發明的另一方面，樣品可以來自正在測試病原體的存在或不存在的對象。當樣品從對象獲得時，其可以通過本領域技術人員已知的方法獲得，例如抽吸、活檢、擦拭、靜脈穿刺、脊髓穿刺、糞便樣品或尿樣品。在本發明的一些方面，樣品是環境樣品，例如水、土壤或空氣樣品。在本發明的另一些方面，樣品來自植物、細菌、病毒、真菌、原生動物或后生動物。每個擴增循環具有三個階段：變性階段、引物退火階段和引物延伸階段。可以重復擴增循環直至產生所需量的擴增產物。通常，擴增循環重復大約10至40次。對于實時PCR，擴增產物的檢測通常在每個擴增循環之后進行。但是在本發明的某些方面，可以在每2個，3個，4個或5個擴增循環之后檢測擴增產物。還可以進行檢測以使得分析或檢測少至2個或更多個擴增循環。擴增循環可以與擴增檢測在相同的室內進行，在此情況下，該室需要包含加熱元件，從而可以在擴增循環的變性階段、引物退火階段和引物延伸階段對室內的溫度進行調節。加熱元件通常受處理器控制。然而，擴增循環可以與擴增檢測在不同室內進行，在此情況下，“擴增”室需要包含加熱元件，而“檢測”或“成像”室不需要具有加熱元件。當擴增和檢測發生在不同室內時，擴增反應的流體可以通過例如泵或活塞在所述室間轉移。所述泵或活塞可以受處理器控制。或者，流體可以經手動(例如使用移液器)在所述室間轉移。擴增可以在反應混合物中進行，所述反應混合物包含至少一個具有非天然核苷酸的非天然核苷酸。所述反應混合物的至少一個非天然核苷酸可以與第一和/或第二引物組之引物中存在的至少一個非天然核苷酸堿基配對。任選地，所述非天然核苷酸與可以包括熒光團和淬滅基團的標記物偶聯。所述淬滅基團可以使所述第一和/或第二引物組之引物中存在的熒光團淬滅。檢測可以包括對群中的一個或更多個多核苷酸進行擴增。例如，在至少一個非天然核苷酸存在下，檢測可以包括對群中的一個或更多個多核苷酸擴增。所述非天然核苷酸可以具有非天然核苷酸(例如isoC和isoG)，其可任選地能夠與寡核苷酸混合物的非天然核苷酸(例如，變性寡核苷酸中存在的非天然核苷酸)堿基配對。所述非天然核苷酸可以與標記物偶聯。適當的標記物包括熒光團和淬滅基團。所述方法可以用來在擴增期間或實時持續檢測靶標。所述方法可以定量使用。實施方案的某些方面涉及內切核糖核酸酶和當探針與DNA靶序列雜交時使用這種酶特異性切割具有核糖核苷酸(RNA)位置的探針。在一些方面，內切核糖核酸酶是RNA酶H，例如RNA酶HII。在某些具體方面，內切核糖核酸酶是熱穩定酶或嗜熱的熱啟動酶(例如，熱穩定的RNA酶HII和嗜熱的熱啟動RNA酶HII)。可以在一個或更多個非天然核苷酸和/或在至少一個與非天然核苷酸偶聯之淬滅基團的存在下進行擴增。在一些實施方案中，與所述至少一個淬滅基團偶聯的非天然核苷酸可以為isoCTP或isoGTP。在一些方法中，第一和第二標記物可以不同。在一些方法中，第一和第二淬滅基團可以不同，并且能夠淬滅兩種不同的熒光團。在另一些方法中，第一和第二淬滅基團可以相同，并且能夠淬滅兩種不同的熒光團。本文所述的方法可以包括確定擴增子(例如至少一個經擴增的HIV核酸和擴增的對照核酸之擴增的核酸)的解鏈溫度。所述方法可以包括確定核酸復合物的解鏈溫度，所述核酸復合物包括與靶核酸(其可以包括擴增的靶核酸)雜交的經標記的探針。將所述擴增子或核酸復合物暴露于溫度梯度并觀察標記物的信號，由此可以確定所述解鏈溫度。任選地，可以通過(a)在溫度梯度下將擴增子與嵌入劑反應和(b)觀察嵌入劑的可檢測信號，來確定所述解鏈溫度。可以通過(1)將探針與靶核酸雜交以形成核酸復合物，其中所述探針和所述靶核酸中的至少一個包含標記物；(2)將所述核酸復合物暴露于溫度梯度；和(3)觀測所述標記物的信號，來確定核酸復合物的解鏈溫度。可以在任意適當條件下在任意適當反應室中實施所述方法。例如，可以在不打開反應室的情況下，在所述反應室中實施所述方法。所述反應室可以為反應室陣列的一部分。在一些實施方案中，所述方法的步驟可以在不同反應室中分別進行。本文公開的方法可以在液滴中進行。同樣，本文公開的組合物可以設置在液滴內。例如，可以使用滴液將本文公開的可切割探針分成用于PCR或等溫擴增的許多分開反應。因此，在某些實施方案中，本文公開的方法在液滴中區室化以進行定量數字PCR反應或其他定量數字擴增反應。如Vogelstein等，1999，第9236-9241頁中所述，數字PCR方法可有助于分布靶核酸，以使得絕大多數反應包含一個或零個靶核酸分子。在某些稀釋度下，擴增陽性反應的數目等于最初存在的模板分子的數目。在一些實施方案中，所述方法能夠檢測樣品(例如體積大約為25微升的樣品)中不超過大約100拷貝的靶核酸。在另一些實施方案中，所述方法能夠檢測樣品(例如體積大約為25微升的樣品)中不超過大約500拷貝、1000拷貝、5000拷貝或10000拷貝。在另一些實施方案中，采用實時檢測，在不超過大約150個、不超過大約100個、不超過大約90個、不超過大約80個、不超過大約70個、不超過大約60個、不超過大約50個、不超過大約40個、或者不超過大約30個的PCR循環內，所述方法能夠檢測樣品(例如體積大約為25微升的樣品)中不超過大約100拷貝的靶核酸。如本文說明書中使用的沒有數字限定的表述可以意指一個/種或更多個/種。如本文權利要求中使用的，當與詞語“包含/包括”聯合使用時，沒有數字限定的表述可以意指一個/種或多于一個/種。權利要求中使用術語“或”用來意指“和/或”，除非明確表示其僅僅為替代或所述替代是互斥的，盡管本公開內容支持僅指替代以及“和/或”的定義。本文中使用的“另一個/種”可以意指至少第二個/種或更多個/種。貫穿該申請，術語“約/大約”用來表示這樣的值，所述值包括裝置、用于確定該值的方法的固有誤差變化，或存在于研究對象之間的差異。通過以下詳細描述，本發明的其它目的、特征和優勢將變得明顯。然而，應當理解的是，說明本發明一些優選實施方案的詳細描述和特定實施例僅通過舉例說明的方式給出，因此根據所述詳細描述，在本發明精神和范圍內的多種變化和修改對于本領域技術人員來說將變得明顯。附圖說明以下附圖形成本說明書的一部分，并且被包括以進一步證明本發明的某些方面。通過結合本文給出的具體實施方案的詳細描述參考這些附圖中的一個或更多個，可以更好地理解本發明。圖1A-B-是示出實施方案的探針系統的非限制性示例性示意圖。圖1A，可切割探針包含在其5’端的報告基團標記的isoG核苷酸(“isoG＊”)、第一序列區(“標簽A(TagA)”)、第二序列區(“標簽B”)、環序列、為標簽B的反向互補序列的序列區(“標簽B互補序列”)；和與靶擴增子互補的序列(表示為“A”)。可切割探針還包含“A”序列中的一個或更多個核糖核苷酸(由實心正方形指示)，并且可包含阻斷在3’端上延伸的修飾(表示為“P”)。在靶擴增子的存在下，可切割探針與擴增子雜交，并在核糖核苷酸位置被RNA酶H切割。切割后，探針可通過標簽B和標簽B互補序列與其自身雜交，形成發夾。探針的延伸將合成與標簽A序列互補的序列，并且將引入淬滅基團標記的isoC(“isoCQ”)。得到的發夾探針淬滅標記的isoG的熒光。圖1B.可以將探針設計為具有獨特的解鏈溫度(Tm)，例如通過調節序列區的序列和長度。因此，可以對具有不同解鏈溫度(因此在不同溫度下不淬滅)的差異探針進行解鏈分析。圖2-具有可變莖、環、Tm和ΔG的實施方案的非限制性示例性探針構建體。如圖1所詳述的設計探針。示出了每個探針的序列(從上到下列出的SEQIDNO：1-11)。標簽A序列是粗體并且莖由3個區段構成：序列特異性(B，下劃線的核苷酸)、通用序列(C，斜體的核苷酸)和以熒光團標記的異堿基結尾的可延伸的通用序列(A，黑體字體核苷酸)。圖3-實施方案的非限制性示例性靶特異性探針設計(從上到下列出的SEQIDNO：12-21)。莖的三個區段如圖2所示。圖4-圖示出了用于評估圖2所示構建體的發夾折疊的溫度梯度。圖5-圖示出了隨著退火溫度逐步降低，RTx-5構建體的作為時間之函數的熒光淬滅(參見例如圖4)。達到71℃的溫度步驟時觀察到完全淬滅。圖6-圖示出了隨著退火溫度逐步降低，RTx-10構建體的作為時間之函數的熒光淬滅(參見例如圖4)。達到62℃的溫度步驟時觀察到完全淬滅。圖7-圖示出了隨著退火溫度逐步降低，RTx-11構建體的作為時間之函數的熒光淬滅(參見例如圖4)。達到41℃的溫度步驟時觀察到完全淬滅。圖8A-8C-圖示出了在50℃、62℃和68℃下從構建體RTx-1和RTx-2獲得的擴增(上圖)和解鏈曲線(下圖)。圖9A-9C-圖示出了在50℃、62℃和68℃從構建體RTx-7和RTx-8獲得的擴增(上圖)和解鏈曲線(下圖)。圖10A-10C-圖示出了在50℃、62℃和68℃從構建體RTx-9、RTx-10和RTx-11獲得的擴增(上圖)和解鏈曲線(下圖)。圖11A-11D-圖示出了全長探針FL-RTx-2-20(A)、FL-RTx-2-12AT1(B)、FL-RTx-2c(C)和FL-RTx-2-12-AT-4(D)的擴增(上圖)和解鏈(下圖)曲線。對照：水＝細實線，臨床陰性試樣＝虛線。測試探針結果以粗實線示出。圖12-是示出實施方案的探針系統的非限制性示例性示意圖。報告基團探針(reporterprobe)包含在其5’端的報告基團標記的isoC核苷酸(“isoC＊”)、第一序列區(“區1”)、包含isoG和/或isoC位的序列(“isoprimer”)；和與擴增子互補的序列(表示為“A”)。與擴增子互補的序列還包含至少一個核糖核苷酸位置。在靶擴增子存在下，報告基團探針與擴增子雜交，并在核糖核苷酸位置被RNA酶H切割。切割后，報告基團探針可與捕獲寡核苷酸(“captureoligonucleotide或captureoligo”)雜交，捕獲寡核苷酸包含與isoprimer和任選的A序列部分互補的捕獲區段，然后是鏡像標簽區(mirrortagregion)和3’未標記的isoC。報告基團探針的延伸將合成與捕獲寡核苷酸上的鏡像區1互補的序列，并且將引入淬滅基團標記的isoG(“isoGQ”)。延伸的報告基團探針現在包含區1和區1互補序列，其允許探針形成發夾，從而淬滅標記的isoC的熒光。可以將探針設計為具有獨特的解鏈溫度(Tm)，例如通過調節第一序列區的序列和長度。因此，可以對具有不同解鏈溫度(因此在不同溫度下不淬滅)的差異探針進行解鏈分析。圖13-在解鏈分析期間獲得的數據的反向導數(invertedderivative)的圖。圖14-使用相同熒光團的多重探針的解鏈譜數據。圖15-示出了實施方案的探針系統的非限制性示例性示意圖，其中探針包含熒光團(“F”)和淬滅基團(“Q”)二者，以及核糖切割(“R”)位點。在核糖切割位點切割后，延伸導致熒光團和淬滅基團的分離，以使得可以觀察到信號中可檢測的變化。圖16-示出了實施方案的探針系統的非限制性示例性示意圖，其中探針包含熒光團(“F”)和淬滅基團(“Q”)兩者。5’核酸酶切割，隨后延伸導致熒光團和淬滅基團的分離，使得可以觀察到信號的可檢測變化。圖17-示出了實施方案的探針系統的非限制性示例性示意圖，其中探針包含位于第二序列區和為第二序列區的反向互補序列的序列(B和B′)之間的一個或更多個核苷酸的環序列，其中環序列與靶核酸的序列互補。說明性實施方案的描述解鏈分析檢測利用解鏈或退火峰以區分擴增子的身份，但是這些解鏈峰在相同溫度附近解鏈的擴增子中并不容易被區分，并且易于受到靶標的天然序列組成的影響。通過產生具有唯一解鏈譜的發夾序列，可以在單色通道中實現多重性，由此使得能夠用多色通道實現甚至更多的多重性。公開了用于檢測樣品中的核酸的方法和試劑盒。通常，所述方法包括檢測信號，例如從熒光團發射的信號。還公開了可以用于檢測靶核酸的寡核苷酸，特別是探針。實施方案的特定方法中采用可延伸探針以通過產生每個熒光團的多個解鏈曲線來促進多重性。在一些情況下，探針由發夾結構構成，所述發夾結構具有在3’端的序列特異性尾部和在以熒光團標記的異堿基結束的5’端的可延伸通用序列。與其他基于探針的化學物質不同，序列特異性區段用于靶標識別和發夾的釋放用于檢測。在一些方面，發夾的釋放基于隨著探針的序列特異性尾部與模板雜交而產生的RNA/DNA雜交體的切割。因此，序列特異性區段沒有或僅少數(例如3-4個)堿基引入發夾結構中，發夾結構主要由靶獨立序列構成。改變發夾的可延伸區段的長度產生具有多種尺寸的發夾，從而允許每個熒光團產生多個解鏈曲線。I.定義本文中使用的“核酸”意指DNA或RNA，單鏈或雙鏈及其任意化學修飾。修飾包括但不限于提供其它化學基團的那些，其整合另外的電荷、極性、氫鍵、靜電相互作用以及對核酸配體堿基或整個核酸配體的流動性(fluxionality)。這樣的修飾包括但不限于，2’位的糖修飾，5位的嘧啶修飾，8位的嘌呤修飾，環外胺處的修飾，4-硫代尿苷的替換，5-溴或5-碘代-尿嘧啶的替換，骨架修飾，甲基化和不常見的堿基配對組合，例如異堿基。因此，本文所述的核酸不僅包括標準堿基腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鳥嘌呤(G)，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)，還包括非標準的或非天然的核苷酸。例如在U.S.專利No.5,432,272，5,965,364，6,001,983，6,037,120和6,140,496中描述了形成氫鍵堿基配對的非標準或非天然核苷酸，通過引用將這些專利全部并入本文。“非標準核苷酸”或“非天然核苷酸”意指除了A、G、C、T或U之外的堿基，其易于整合至寡核苷酸中并且能夠通過氫鍵或疏水、熵或范德華相互作用與互補的非標準或非天然核苷酸堿基配對以形成堿基對。一些實例包括US專利No.6,037,120中舉例說明的iso-C/iso-G，K/X，K/P，H/J和M/N的堿基對組合，所述文獻通過引用并入本文。這些非標準或非天然核苷酸對的氫鍵類似于天然堿基的那些，其中配對的非標準或非天然核苷酸的氫鍵受體和氫鍵供體之間形成兩個或三個氫鍵。天然堿基與這些非標準或非天然核苷酸的一個區別在于氫鍵受體和氫鍵供體的數目和位置。例如，胞嘧啶可以被認為是供體/受體/受體堿基，而鳥嘌呤是互補的受體/供體/供體堿基。Iso-C是受體/受體/供體堿基，而iso-G為互補的供體/供體/受體堿基，如US專利No.6,037,120中所舉例說明的，所述文獻通過引用并入本文。用于寡核苷酸的其他非天然核苷酸包括例如以下中討論的萘、菲和芘衍生物：Ren等，1996和McMinn等，1999，兩者都通過引用并入本文。這些堿基不利用氫鍵來穩定，而是依靠疏水或范德華相互作用形成堿基對。本文使用的術語“樣品”以其最寬的含義使用。樣品可以包括身體組織或體液，所述體液包括但不限于血液(或者血液級分，例如血漿或血清)、淋巴、粘液、眼淚、尿和唾液。樣品可以包括細胞、染色體、細胞器或病毒的提取物。樣品可以包含DNA(例如基因組DNA)，RNA(例如mRNA)，和/或cDNA，可以擴增任意它們以提供擴增的核酸。樣品可以包含溶液中的核酸或者結合至基底(例如微陣列的一部分)。樣品可以包括從環境地點(例如，水體，土壤等)獲得的材料，或者從傳染物(fomite)(即用來使病原體從一個宿主轉移至另一個宿主的無生命物體)獲得的材料。術語“核酸源”是指含有核酸(RNA或DNA)的任何樣品。特別優選的靶核酸源是生物樣品，包括但不限于，血液、血漿、血清、唾液、腦脊液、胸腔液、乳汁、淋巴、痰和精液。本文中使用的術語“檢測限(limitofdetection)”是指可以被檢測和定量的分析物(例如核酸)的最低水平或最低量。檢測限可以表示為摩爾值(例如，2.0nM的檢測限)，按克的測量值(例如特定反應條件下的2.0微克的檢測限)，拷貝數(例如1×105拷貝數的檢測限)，或其它本領域已知的表達方式。本文中使用的關于核酸分子的術語“分離的”是指從生物體和生物材料(例如血液、細胞、血清、血漿、唾液、尿、糞便、痰、鼻咽吸出物等)分離的核酸分子，其存在于核酸分子的天然來源中。當通過重組技術產生時，分離的核酸分子(例如cDNA分子)可以基本不含有其它細胞材料或者培養基，或者當化學合成時，所述分離的核酸分子基本不含有化學前體或其它化學物質。在一些實施方案中，還可以分離或純化編碼多肽/蛋白質的核酸分子。核酸分離的方法是本領域公知的，可以包括總核酸分離/純化方法、RNA特異性分離/純化方法、或DNA特異性分離/純化方法。本文中使用的術語“微陣列”是指多個多核苷酸、多肽或其它化學化合物在基底上的排列。術語“元件”和“陣列元件”是指在微陣列上具有唯一和確定位置的多核苷酸、多肽或其它化學化合物。本文中使用的寡核苷酸理解為具有骨架上之堿基序列的分子，所述骨架主要由具有確定間隔的相同單體單元構成。所述堿基在所述骨架上以這樣的方式排列，使其可以與核酸鍵合，所述核酸具有與所述寡核苷酸的堿基互補的堿基序列。最常見的寡核苷酸具有糖磷酸單元骨架。由2’位置不具有羥基的“dNTP”構成的寡脫氧核糖核苷酸和由2’位置具有羥基的“NTP”構成的寡核糖核苷酸之間可有差別。寡核苷酸還可以包括衍生物，其中羥基的氫被有機基團(例如烯丙基)取代。寡核苷酸為包含至少兩個核苷酸的核酸。用在本文公開方法中的寡核苷酸通常包含至少大約10個核苷酸，更通常至少大約15個核苷酸。用于本文公開的方法的優選寡核苷酸包含大約10-25個核苷酸。寡核苷酸可以被設計作為“引物”。“引物”是短核酸，通常為ssDNA寡核苷酸，其可以通過互補堿基配對來與靶多核苷酸退火。然后，可沿著靶DNA或RNA鏈通過聚合酶(例如DNA聚合酶)延伸所述引物。引物對可以用于擴增(和鑒定)核酸序列(例如通過聚合酶鏈式反應(PCR))。寡核苷酸可以被設計作為“探針”。“探針”是指用于檢測相同、等位或相關核酸序列的寡核苷酸、其互補序列或其片段。探針可以包含已經連接至可檢測標記物或報告基團分子的寡核苷酸。典型的標記物包括熒光染料、淬滅基團、放射性同位素、配體、閃爍劑、化學發光劑和酶。可以將寡核苷酸設計為對樣品中的靶核酸序列具有特異性。例如，可以將寡核苷酸設計為包括靶核酸的“反義”核酸序列。本文中使用的術語“反義”是指能夠與特定靶核酸序列的“有義”(編碼)鏈進行堿基配對的任意組成。反義核酸序列可以與靶核酸序列“互補”。本文中使用的“互補性”描述了通過堿基配對而退火的兩個單鏈核酸序列之間的關系。例如，5′-AGT-3′與其互補序列3′-TCA-5′配對。在一些實施方案中，可以將引物或探針設計為包含不同位置處的錯配。本文中使用的“錯配”意指不包括標準Watson-Crick堿基對的核苷酸對，或者沒有優先形成氫鍵的核苷酸對。所述錯配可以包含被靶標中特定堿基替換的非天然或非標準核苷酸或者天然核苷酸。例如，探針或引物序列5′-AGT-3′與靶序列3′-ACA-5′具有單個錯配。所述探針或引物的5’“A”與靶標的3’“A”錯配。類似地，靶序列5′-AGA-3′與探針或引物序列3′-(iC)CT-5′具有單個錯配。此處，iso-C替換了天然“T”。然而，序列3′-(iC)CT-5′與序列5′-(iG)GA-3′沒有錯配。還可以將寡核苷酸設計為簡并寡核苷酸。本文中使用的“簡并寡核苷酸”意在包括含有不同序列混合物的寡核苷酸群、寡核苷酸庫(pool)或多個寡核苷酸，其中序列差異發生在所述群的每個寡核苷酸的特定位置上。多種替換可以包括任意天然或非天然核苷酸，并且可以包括任意數目的在任意給定位置上不同的可能核苷酸。例如，上述簡并寡核苷酸可以替代地包括R＝iC或iG，或者R＝A或G或T或C或iC或iG。本文中描述的寡核苷酸通常能夠與具有互補堿基序列的寡核苷酸形成氫鍵。這些堿基可包括天然堿基，例如A、G、C、T和U，以及人工的、非標準或非天然核苷酸，例如iso-胞嘧啶和iso-鳥嘌呤。如本文中描述的，當與第二序列的連續堿基(從3′至5′讀)比較時，第一序列的連續堿基(從5′至3′讀)遵循Watson-Crick的堿基配對規則時，寡核苷酸的第一序列被描述為與寡核苷酸的第二序列100％互補。寡核苷酸可以包括核苷酸替換。例如，人工堿基可以用于代替天然堿基，以使得所述人工堿基顯示與天然堿基類似的特異性相互作用。對靶核酸具有特異性的寡核苷酸還可以對與所述靶核酸序列具有“同源性”的核酸序列具有特異性。本文中使用的“同源性”是指兩個或更多個多核苷酸序列或者兩個或更多個多肽序列之間的序列相似性或(可互換地)序列同一性。用于多核苷酸序列的術語“百分比同一性”和“％同一性”是指采用標準算法(例如BLAST)時比對的至少兩個多核苷酸序列之間殘基匹配的百分比。對靶核酸具有特異性的寡核苷酸將在適當條件下與靶核酸“雜交”。本文中使用的“雜交”或“與......雜交”是指在限定的雜交條件下，寡核苷酸單鏈經堿基配對與互補鏈退火的過程。“特異性雜交”是指兩個核酸序列共有高度互補性。在允許退火的條件下形成特異性雜交復合物，并在任意后續洗滌步驟之后保持雜交。允許核酸序列退火的條件可以由本領域普通技術人員常規地確定，并且可以在例如大約6×SCC存在下于65℃下進行。可以部分參照進行洗滌步驟的溫度表示雜交的嚴格性。在確定的離子強度和pH下，通常選定的溫度比特異性序列的熱解鏈點(Tm)低大約5℃至20℃。Tm是指50％靶序列與完全匹配的探針雜交的溫度(在確定的離子強度和pH下)。計算Tm的等式例如最鄰近參數(nearest-neighborparameter)，并且核酸雜交的條件是本領域已知的。本文中使用的“靶標”或“靶核酸”是指含有至少與寡核苷酸部分互補之序列的核酸分子，所述寡核苷酸例如為探針或引物。“靶”序列可以包括基因或基因組的一部分。本文中使用的“核酸”、“核苷酸序列”或“核酸序列”是指核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸或其任意片段，以及天然存在或合成的分子。這些術語還指基因組或合成來源的DNA或RNA，其可以為單鏈或雙鏈，并且可以表示有義或反義鏈，或者任何DNA樣或RNA樣材料。提及DNA序列的“RNA等同物”由與參照DNA序列相同的核苷酸線性序列構成，不同之處在于含氮堿基胸腺嘧啶全部被尿嘧啶取代以及糖骨架由核糖而不是脫氧核糖構成。RNA可以用于本文所述的方法中，和/或可以通過在本文所述方法中采用的逆轉錄轉化為cDNA。本文中使用的“擴增”是指產生核酸序列的另外的拷貝。通常采用本領域已知的聚合酶鏈式反應(PCR)進行擴增。術語“擴增反應系統”是指使核酸靶序列的拷貝增加的任意體外裝置。術語“擴增反應混合物”是指包含用于擴增靶核酸之多種試劑的水溶液。這些試劑可以包括酶(例如熱穩定聚合酶)、緩沖水溶液、鹽、擴增引物、靶核酸、核苷三磷酸，以及任選地，至少一個標記的探針和/或任選地，至少一個用于確定經擴增靶核酸的解鏈溫度的試劑(例如在雙鏈核酸存在下表現出熒光改變的熒光嵌入劑)。本文描述的擴增方法可以包括“實時監測”或“持續監測”。這些術語是指，在PCR循環期間監測多次，優選在溫度轉變期，并且更優選在每個溫度轉變時獲得至少一個數據點。術語“均勻檢測測定(homogeneousdetectionassay)”用來描述包括偶聯的擴增和檢測的測定，其可以包括“實時監測”或“持續監測”。核酸擴增可以包括核酸或這些核酸之亞區域的擴增。例如，擴增可以包括通過選擇適當引物序列和采用PCR對30至50、50至100或100至300堿基長的核酸部分進行擴增。在另一些方面，可以采用等溫擴增技術(即，不需要熱循環)實現擴增。例如，等溫核酸擴增的方法，例如U.S.專利6,410,278和US專利公開20080182312中提供的環介導等溫擴增(loopmediatedisothermalamplification，LAMP)，每個所述文獻通過引用整體并入本文。所公開的方法可以包括對樣品中至少一個或更多個核酸進行擴增。在所公開的方法中，采用實時方法對擴增進行監測。擴增混合物可以包含天然核苷酸(包括A、C、G、T和U)和非天然或非標準核苷酸(例如，包括iC和iG)。DNA和RNA寡核苷酸分別包括通過磷酸二酯鍵偶聯的脫氧核糖或核糖。每個脫氧核糖或核糖包含與糖偶聯的堿基。天然存在的DNA和RNA中整合的堿基為腺苷(A)、鳥苷(G)、胸苷(T)、胞苷(C)和尿苷(U)。這五個堿基是“天然堿基”。根據Watson和Crick闡述的堿基配對規則，所述天然堿基雜交以形成嘌呤-嘧啶堿基對，其中G與C配對，A與T或U配對。這些配對規則有利于寡核苷酸與互補寡核苷酸的特異性雜交。每個堿基對的兩個堿基之間產生兩個或三個氫鍵有利于天然堿基形成堿基對。每個堿基包含兩個或三個氫鍵供體和氫鍵接受者。通過一個堿基上的至少一個氫鍵供體與另一堿基上的氫鍵接受者的相互作用來各自形成堿基對的氫鍵。氫鍵供體包括例如，具有至少一個連接的氫的雜原子(例如，氧或氮)。氫鍵接受者包括例如具有孤對電子的雜原子(例如，氧或氮)。本文中使用的天然或非天然核苷酸可以通過非氫鍵合位點的替換而衍生，以形成經修飾的天然或非天然核苷酸。例如，通過將反應官能基團(例如，巰基、肼、醇、胺等)偶聯至核苷酸的非氫鍵合原子，可將天然核苷酸衍生以連接至支持物。另一些可能的取代物包括例如，生物素、洋地黃毒苷、熒光基團、烷基(例如甲基或乙基)等。根據本文所公開方法的非天然核苷酸的用途可延伸超出了對樣品中存在之核酸序列的檢測和定量。例如，通過催化與核酸相關的反應的多種酶，可以識別非天然核苷酸。雖然聚合酶需要互補核苷酸以繼續聚合并延伸寡核苷酸鏈，但是其它酶并不要求互補核苷酸。如果非天然核苷酸存在于模板中并且反應混合物中不存在其互補非天然核苷酸，則當嘗試將延長的引物延伸通過所述非天然核苷酸時，聚合酶通常會停止(或者，在一些情況下，當給予足夠量的時間時，會錯整合堿基)。然而，催化與核酸相關的反應的另一些酶，例如連接酶、激酶、核酸酶、聚合酶、拓撲異構酶、解旋酶等，可以催化涉及非天然核苷酸的反應。非天然核苷酸的這些特征可以被利用，并落在本文公開的方法和試劑盒的范圍內。本文所公開的包括非天然核苷酸的核苷酸可以偶聯標記物(例如淬滅基團或熒光團)。可以采用本領域已知的方法進行偶聯。本文方法中的寡核苷酸可以作為引物。在一些實施方案中，所述寡核苷酸被標記。例如，用發射可檢測信號的報告基團(例如熒光團)標記寡核苷酸。寡核苷酸可以包括至少一個非天然核苷酸。例如，寡核苷酸可以包含具有不是A、C、G、T或U堿基的至少一個核苷酸(例如，iC或iG)。當寡核苷酸用作例如用于PCR的引物時，擴增混合物可以包括至少一個標記有淬滅基團(例如Dabcyl)的核苷酸。所述經標記的核苷酸可以包含至少一個非天然或非標準核苷酸。例如，所述經標記的核苷酸可以包含具有不是A、C、G、T或U的堿基的至少一個核苷酸(例如，iC或iG)。在一些實施方案中，可以將寡核苷酸設計為不形成分子內結構(例如發夾)。在另一些實施方案中，可以將寡核苷酸設計為形成分子內結構(例如發夾)。例如，可以將寡核苷酸設計為形成發夾結構，這在所述寡核苷酸與靶核酸雜交之后，以及任選地，在采用所述寡核苷酸作為引物對靶核酸進行擴增之后發生改變。寡核苷酸可以用熒光團標記，當所述寡核苷酸作為引物整合至擴增的產物中時，所述熒光團表現出淬滅。在另一些實施方案中，在寡核苷酸作為引物整合至擴增的產物中之后，所述寡核苷酸可以發射可檢測信號(例如，固有地，或通過熒光誘導或熒光去淬滅(dequenching))。這樣的引物是本領域已知的(例如，LightCycler引物、AmplifluorTM引物、ScorpionTM引物和LuxTM引物)。當嵌入雙鏈核酸時，用于標記寡核苷酸的熒光團可以發射信號。因此，在寡核苷酸作為引物擴增核酸后，熒光團可以發射信號。用于所公開方法的寡核苷酸可以適合作為引物以擴增樣品中的至少一個核酸，以及作為探針以檢測樣品中的至少一個核酸。在一些實施方案中，用至少一個熒光染料標記寡核苷酸，其可以產生可檢測信號。所述熒光染料可以作為熒光供體以進行熒光共振能量轉移(fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET)。當寡核苷酸用于擴增靶核酸時，所述可檢測信號可被淬滅。例如，擴增混合物可以包含用熒光團發射的可檢測信號的淬滅基團標記的核苷酸。任選地，寡核苷酸可以標記有第二熒光染料或可作為熒光接受者的淬滅基團染料(例如用于FRET)。當寡核苷酸標記有第一熒光染料和第二熒光染料時，可以檢測所述第一熒光染料、第二熒光染料或者兩者的信號。可以在一定的溫度梯度下檢測信號(例如為了確定擴增子、包含與靶核酸雜交之探針的復合物、發夾或T探針復合物的解鏈溫度)。可以用任意適當數目的寡核苷酸進行所公開的方法。當采用多個寡核苷酸(例如2個或更多個寡核苷酸)時，不同的寡核苷酸可以用能夠產生可檢測信號的不同熒光染料標記。在一些實施方案中，寡核苷酸標記有兩種不同熒光染料中的至少一種。在另一些實施方案中，寡核苷酸標記有三種不同熒光染料中的至少一種。在一些實施方案中，每種不同熒光染料發射的信號可以與用來標記寡核苷酸的其它任意不同熒光染料發射的信號區分。例如，不同熒光染料可具有最大發射波長，所有最大發射波長相互之間相差至少大約5nm(優選至少大約10nm)。在一些實施方案中，每個不同熒光染料被不同波長能量激發。例如，不同熒光染料可具有最大吸收波長，所有最大吸收波長相互之間相差至少大約5nm(優選至少大約10nm)。當采用熒光染料確定所述方法中核酸的解鏈溫度時，熒光染料可發射的信號可以與用來標記寡核苷酸的其它任意不同熒光染料發射的信號區分。例如，用于確定核酸解鏈溫度的熒光染料具有的最大發射波長可與用來標記寡核苷酸的其它任意熒光染料的最大發射波長相差至少大約5nm(優選至少大約10nm)。在一些實施方案中，用于確定核酸解鏈溫度的熒光染料可以被不同于用來標記寡核苷酸的其它任意不同熒光染料之波長能量的波長能量激發。例如，用于確定核酸解鏈溫度的熒光染料的最大吸收波長可與用來標記寡核苷酸的任意熒光染料的最大吸收波長相差至少大約5nm(優選至少大約10nm)。所述方法可以包括確定樣品中至少一個核酸(例如，擴增子或包含與靶核酸雜交之探針的核酸復合物)的解鏈溫度，其可以用于鑒定核酸。確定解鏈溫度可以包括將擴增子或核酸復合物暴露于溫度梯度，并觀察熒光團的可檢測信號。任選地，當所述方法的寡核苷酸標記有第一熒光染料時，確定檢測的核酸的解鏈溫度可以包括觀察與第一熒光染料不同的第二熒光染料的信號。在一些實施方案中，用于確定檢測的核酸之解鏈溫度的第二熒光染料是嵌入劑。適當的嵌入劑可以包括但不限于，SYBRTMGreen1染料、SYBR染料、PicoGreen、SYTO染料、SYTOX染料、溴化乙錠、乙錠同源二聚體-1、乙錠同源二聚體-2、乙錠衍生物、吖啶、吖啶橙、吖啶衍生物、乙錠-吖啶異源二聚體、單疊氮乙錠(ethidiummonoazide)、碘化丙啶、花青素單體、7-氨基放線菌素D、YOYO-1、TOTO-1、YOYO-3、TOTO-3、POPO-1、BOBO-1、POPO-3、BOBO-3、LOLO-1、JOJO-1、花青素二聚體、YO-PRO-1、TO-PRO-1、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5、PO-PRO-1、BO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-3、LO-PRO-1、JO-PRO-1、及其混合物。在一些合適的實施方案中，所選擇的嵌入劑為SYBRTMGreen1染料。在所公開的方法中，每個經擴增的靶核酸或報告基團探針-模板對具有不同的解鏈溫度。例如，每個經擴增的靶核酸或報告基團探針-模板對的解鏈溫度可與其它任意經擴增靶核酸或報告基團探針-模板對的解鏈溫度相差1-10℃，例如至少大約1℃，更優選至少大約2℃，或甚至更優選至少大約4℃。本文中使用的“標記物”或“報告基團分子”是用于標記核酸的化學或生化部分。“標記物”和“報告基團分子”包括熒光劑、化學發光劑、生色劑、淬滅劑、放射性核素、酶、底物、輔因子、閃爍劑、抑制劑、磁性顆粒和其它本領域已知的部分。“標記物”或“報告基團分子”能夠產生可測量的信號，并且可以與寡核苷酸共價或非共價連接。本文中使用的“熒光染料”或“熒光團”為可以被光激發而發射熒光的化學基團。一些合適的熒光團可以被光激發而發射磷光。染料可以包括能夠將熒光供體染料的熒光信號淬滅的接受者染料。可以用于所公開方法中的染料包括但不限于，熒光團，例如紅色熒光方酸菁染料(例如2，4-雙[1，3，3-三甲基-2-二氫亞吲哚基甲基]環丁烯二-1，3-二氧戊環)、紅外染料(例如2，4雙[3，3-二甲基-2-(1H-苯基[e]二氫亞吲哚基甲基)]環丁烯二-1，3-二氧戊環)或橙色熒光方酸菁染料(例如2，4-雙[3，5-二甲基-2-吡咯基]環丁烯二-1，3-二氧戊環)。熒光團的另一些非限制性實例包括：量子點，AlexaFluorTM染料，AMCA，BODIPYTM630/650，BODIPYTM650/665，BODIPYTM-FL，BODIPYTM-R6G，BODIPYTM-TMR，BODIPYTM-TRX，CascadeBlueTM，CyDyeTM(包括但不限于Cy2TM、Cy3TM和Cy5TM)，DNA嵌入染料，6-FAMTM，熒光素，HEXTM，6-JOE，OregonGreenTM488，OregonGreenTM500，OregonGreenTM514，PacificBlueTM，REG，藻膽蛋白包括但不限于藻紅蛋白和別藻藍蛋白，RhodamineGreenTM，RhodamineRedTM，ROXTM，TAMRATM，TETTM，四甲基羅丹明，或TexasRedTM。熒光染料或熒光團可以包括經修飾以有利于綴合至另一反應分子的衍生物。因此，熒光染料或熒光團可以包括胺反應衍生物，例如熒光團的異硫氰酸鹽衍生物和/或琥珀酰亞胺酯衍生物。所公開方法的寡核苷酸和核苷酸可以用淬滅基團標記。淬滅可包括動態淬滅(例如通過FRET)，靜態淬滅或兩者。適當的淬滅基團包括Dabcyl。適當的淬滅基團還包括暗淬滅基團，其可以包括以商品名″BHQ″銷售(例如，BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3，BiosearchTechnologies，Novato，CA)的黑洞淬滅基團。暗淬滅基團還可以包括以商品名″QXLTM″銷售(Anaspec，SanJose，CA)的淬滅基團。暗淬滅基團還可以包括包含2，4-二硝基苯基的DNP型非熒光團。本文公開的方法和組合物可用于區室化反應。用于區室化反應的一種方法是使用液滴，其是被第二流體或者被第二流體和一個或更多個表面完全包圍的第一流體的分離體積。在分子診斷和生命科學研究領域中，這通常是兩種不混溶的液體。本文公開的多個實施方案采用在非水連續相中包含多個水性液滴的油包水乳液。水滴的全部或子集可以包含感目的分析物。通常通過在一種或更多種表面活性劑的存在下將兩種不混溶相(例如水和油)組合而形成乳液。乳液的基本類型是水包油(o/w)、油包水(w/o)和雙連續的(bi-continuous)。在基于液滴的生物測定中，乳液通常是油包水乳液，其中測定試劑(例如，PCR引物，鹽，酶等)包含在水相中。“油”相可以是單一油或不同油的混合物。任何合適的非水流體可以形成本文公開的乳液的非水連續相。在一些實施方案中，非水連續相包含礦物油、硅油或氟化油(例如，FC-40[Sigma-Aldrich])。可以通過多種技術使液滴成像。為了便于成像，可以使包含液滴的組合物分散在表面上，以使得液滴基本上以單層設置在表面上。成像表面可以例如在載玻片上或在室(例如玻璃或石英室)中。可以使用成像系統檢測液滴，以及液滴內的標記的分析物或反應產物(例如，發夾探針)。例如，檢測可以包括對從標記的發夾探針發射的熒光波長和/或熒光強度成像。在液滴還包含編碼的顆粒(例如編碼的微球)的實施方案中，成像可以包括對編碼的顆粒采集解碼圖像并進行測定成像以檢測液滴中的探針。解碼圖像和測定圖像的比較通過使用熒光團的組合允許更大的多重能力。本發明的方法還可以包括將來自直接或間接標記的擴增產物的信號與樣品中的DNA或RNA的濃度相關聯。可適于與本文公開的方法和組合物一起使用的成像系統的實例描述于美國專利No.8,296,088和美國專利公開2012/0288897中，其通過引用并入本文。如上所述，聚合酶鏈式反應(PCR)是可以在液滴內進行的反應的實例。特別地，液滴可用于數字PCR(dPCR)技術。dPCR包括分隔樣品，使得包含在樣品中的獨立核酸分子位于許多分開的區域中，例如微孔板的獨立孔中，在乳液的分散相中，或核酸結合表面的陣列中。每個分區(例如，液滴)將含有0個或大于0個分子，分別提供陰性反應或陽性反應。與常規PCR不同，dPCR不依賴于擴增循環的數目來確定樣品中靶核酸的初始量。因此，dPCR消除了對指數數據的的依賴以量化靶核酸并提供絕對定量。珠乳液PCR(其克隆性擴增乳液中珠上的核酸)是dPCR技術的一個實例，其中反應分隔在液滴中。參見例如美國專利No.8,048,627和7,842,457，其通過引用并入本文。當如下面更詳細討論的在乳液中進行dPCR時，乳液應該是熱穩定的，以允許其經受熱循環條件。存在在乳液中進行dPCR的多種方法。例如，在一種方法中，將DNA樣品稀釋至適當濃度，與PCR試劑(引物，dNTP等)混合，并如上所述包封在乳液中的液滴中，得到多個離散的反應樣品。對液滴進行PCR熱循環，并通過如上所述的熒光(或其他合適的報告基團)成像檢測擴增子。在本發明可切割探針實施方案的上下文中，通過探針的熒光(或其他合適的報告基團)檢測擴增子。液滴的熱循環可以通過本領域已知的任何合適的技術進行。例如，液滴可以在管或室中熱循環，而不是可以被加熱和冷卻。在一些實施方案中，所述方法使用持續流擴增來擴增核酸模板。已經報道了連續流擴增的多種方法。例如，美國專利No.7,927,797(其通過引用并入本文)描述了與連續流動PCR結合使用的油包水乳液。也可以在液滴中進行等溫反應(例如，滾環擴增、全基因組擴增、NASBA或鏈置換擴增)。該系統還可用于監測液滴，同時提高或降低溫度以獲得每個液滴的解鏈譜，這將允許多重檢測和定量。探針本身可以在液滴內使用以等溫信號放大以使得不需要其他形式的擴增(例如PCR或其他等溫擴增反應)來檢測液滴內低拷貝數的靶標。II.實施例包括以下實施例以證明本發明的一些優選實施方案。本領域技術人員應當理解，以下實施例中公開的技術代表由發明人發現的在本發明的實踐中良好地起作用的技術，因此可以被認為構成其實踐的一些優選模式。然而，根據本公開內容的教導，本領域技術人員應當理解，在不脫離本發明的精神和范圍的情況下，可以對所公開的具體實施方案進行許多改變，并且仍然獲得相同或相似的結果。實施例1.多探針系統用于分子測定的溶液相多重策略依賴于多個熒光團的使用并結合多個熒光解鏈曲線的產生以檢測＞10種靶標。本文公開的多個實施方案提供基于實時探針的化學，其允許通過利用可延伸發夾探針以產生每個通道的多個解鏈曲線來實現更高的多重性能力。在圖1A中示出了用于該系統的探針的一個實例。在該實例中，可切割探針包含在其5’端的報告基團標記的isoG核苷酸(“isoG＊”)、第一序列區(“標簽A”)、第二序列區(“標簽B”)、環序列、與標簽B反向互補的序列區(“標簽B互補序列”)；和與靶擴增子互補的序列(表示為“A”)。可切割探針還包含“A”序列中的一個或更多個核糖核苷酸(由實心正方形指示)，并且可包含阻斷3’端上的延伸的修飾(表示為“P”)。在靶擴增子存在下，可切割探針與擴增子雜交，并在核糖核苷酸位置被RNA酶H2(其識別并切割退火的RNA/DNA雜交體中的核糖核苷酸)切割。切割后，探針可以通過標簽B和標簽B互補序列與其自身雜交以形成發夾。探針的延伸將合成與標簽A序列互補的序列，并且將引入淬滅基團標記的isoC(“isoCQ”)。得到的發夾探針淬滅標記的isoG的熒光。可以將探針設計為具有獨特的解鏈溫度(Tm)，例如通過調節第一和第二序列區的序列和長度。因此，可以改變標簽A和標簽B莖結構的組成和長度以在發夾探針的任何所需的解鏈溫度下分解(resolve)(參見圖1B)。材料和方法探針設計參數設計可切割探針的多種構建體而不具有靶序列特異性尾部(切割后)，以確定可延伸發夾的最佳設計參數。序列特異性尾部的靶向Tm比反應溫度(約58℃)高10℃。將發夾構建體設計為具有＞60℃的Tm，以允許RNA/DNA雜交體切割后形成單分子結構。設計這些構建體以確定對切割后發夾的環大小(堿基數)、莖大小、吉布斯自由能和Tm的要求。示出了構建的特異性探針的實例(圖2)。對于這些概念驗證實驗，使用在環的每一側以兩個胞嘧啶“夾子”結束的多腺嘌呤殘基的環(在斜體字體之間的序列)。1.探針的折疊溫度梯度用于通過在95℃至41℃的溫度范圍內監測發夾的熒光強度的降低來評估這些構建體的折疊譜。將圖2的構建體添加到含有BTP-KCIpH9.1緩沖液、2.5mMdNTP、2.5mMMgCl2、1mMDabcyl-isoG和TitaniumTaq酶(Clontech)的反應混合物中。在95℃的初始變性步驟之后，以3℃的增量將反應溫度從95℃降低至41℃，每個間隔保持10秒。觀察每種構建體的完全淬滅時的溫度，記錄為發夾的折疊溫度。2.發夾環形成的效率：探針的折疊、延伸和淬滅通過測量每種構建體在3個溫度下的淬滅速率來評價發夾形成的效率。將圖2的構建體添加到含有BTP-KClpH9.1緩沖液、2.5mMdNTP、1mMisoG-dabcyl-和TitaniumTaq酶(Clontech)的反應混合物中。在95℃的2分鐘的活化步驟后，將反應在50℃、62℃和68℃下孵育30分鐘，以允許發夾折疊、延伸和引入isoG-dabcyl。隨后是60℃30秒并遞增地增加至95℃的解鏈曲線循環方案。通過當實現淬滅時產生的Ct值確定反應的效率。3.利用全長探針的單重RT-PCR首先在單重RT-PCR反應中評價使用多探針RTx探針用于擴增反應中的檢測的可行性。基于在(圖2-3)中評估的發夾設計產生全長探針(具有序列特異性尾部)的多種設計。序列特異性區段的靶Tm比反應的退火溫度高約10℃。引物(表1)和探針的序列基于乙型流感病毒的基質基因(matrixgene)。從流感B毒株B/Malaysia/2506/04(Zeptometrix)提取的核酸用作一步RT-PCR反應中的模板。具體地，將PCR引物(正向180nM，反向60nM)和探針(120nM)加入到含有BTP-KClpH9.1緩沖液、2.5mMdNTP、2.5mMMgCl2、1mMDabcyl-isoG、TitaniumTaq酶(Clontech)和MMLV(Promega)和RNA酶H(IDT)的反應混合物中。以下循環條件用于擴增和解鏈曲線分析：50℃，5分鐘；95℃10分鐘；95℃10秒，58℃20秒，45個循環，隨后是解鏈程序：60℃30秒和95℃1秒，以40℃的冷卻步驟結束。表1：PCR引物引物名稱序列Tm(℃)乙型流感正向-短GAAGCATTTGAAATAGCAGAAGG(SEQIDNO：22)61乙型流感反向-短CACAGAGCGTTCCTAGTTTTACT(SEQIDNO：23)62.8結果發夾環的解鏈譜產生圖2發夾探針的解鏈譜，以確定各種構建體的折疊溫度。這通過監測95℃至41℃的溫度梯度中熒光強度的下降來測量(圖4)。示出了三種示例性構建體RTx-5、RTx-10和RTx-11的淬滅譜的圖分別在圖5-7中示出。所有研究的結果示于下表2中。發現發夾構建體RTx-1、2、3、5、6、7和8到71℃溫度步驟時完全淬滅，對應的所計算的延伸發夾的Tm為約71℃(IDT)。發夾構建體RTx-4、9和10到62℃時淬滅，發夾RTx-11在41℃淬滅。表2：多種發夾探針的折疊溫度的總結當比較莖環Tm、ΔG值、環大小和莖大小時，數據表明影響發夾形成的主要因素是莖中的堿基數。次要因素可能是與發夾的折疊相關的吉布斯自由能，因為具有正確折疊Tm的構建體的ΔG低于Tm為62℃和41℃的構建體。發夾環形成的效率擴增將來自圖2的發夾結構用于測定在各溫度下發夾形成的效率。結果證實了上述觀察結果。對于探針RT-x1、2、7和8，反應速率非常快(圖8和圖9)。對于探針RTx-9和10觀察到更慢的反應速率，Ct值為5至10，并且對于RTx11、30-35記錄了完全淬滅的最高Ct值(圖10)。這些發夾需要更低的溫度來形成和延伸，這轉化成需要更長的時間來進行折疊。解鏈曲線分析發夾構建體RTx1、2、3和4的解鏈曲線分析顯示升高的溫度導致更尖銳的解鏈曲線(圖8)。這伴隨著記錄的Tm的輕微偏移。構建體RT-x5和6在62℃下同樣同樣產生了更尖銳解鏈曲線，并且沒有觀察到Tm的偏移。構建體RTx-7和8的解鏈曲線和Tm偏離對于其他發夾觀察到的趨勢(圖9)。構建體RTx9、10和11產生寬的和重疊的解鏈曲線(圖10)，對應于上文產生的數據。利用全長探針的單重RT-PCR基于在圖2和圖3的發夾構建體上產生的數據創建全長探針設計。靶向的最小莖大小為8個堿基，環為12-20個殘基，發夾環的Tm為55℃-66.4℃。檢測所有探針產生在34-35Ct范圍內的Ct值(圖11A-11D)。大多數探針的解鏈曲線表明存在一種物質，主要是延伸的發夾。對于一些探針檢測到次高(minor，high)Tm峰。除FL-RTx-2-12AT1和FL-RTx-2-12AT2之外，對于所有探針記錄到相同的熒光強度。這些探針的計算的發夾環Tm非常接近反應溫度(58℃)。降低反應溫度可以改善形成的發夾分子的數目并提供更好的檢測。特異性包括兩個陰性對照(圖11A-11D)。包含模板陰性對照(水)的目的是檢測由于全長探針被RNA酶H2切割而非特異性形成的發夾。只有探針FL-RTx-2-12-AT-4(圖11D)顯示了背景非特異性解鏈曲線，與可能表明探針非特異性切割的發夾的大小相同。使用的第二陰性對照是從無癥狀患者收集的臨床陰性試樣。目的是評價在無關模板存在下探針的特異性。沒有探針顯示與模板的任何非特異性相互作用。實施例2.另外的發夾探針檢測系統發夾探針檢測系統的另一個實例示出于圖12中。報告基團探針包含在其5’端的報告基團標記的isoC核苷酸(“isoC＊”)、第一序列區(“區1”)、包含isoG和/或isoC位的序列(“isoprimer”)；和與擴增子互補的序列(表示為“A”)。與擴增子互補的序列還包含至少一個核糖核苷酸位置。在靶擴增子存在下，報告基團探針與擴增子雜交，并在核糖核苷酸位置被RNA酶H切割。切割后，報告基團探針可與捕獲寡核苷酸(“捕獲oligo”)雜交，捕獲寡核苷酸包含與isoprimer和任選的“A”序列部分互補的捕獲區段，然后是鏡像區1和3’未標記的isoC。報告基團探針的延伸將合成與捕獲寡核苷酸上的鏡像標簽互補的序列，并且將引入淬滅基團標記的isoG(“isoGQ”)。延伸的報告基團探針現在包含標簽和標簽互補序列，其允許探針形成發夾，從而淬滅標記的isoC的熒光。可以將探針設計為具有獨特的解鏈溫度(Tm)，例如通過調節第一序列區的序列和長度。因此，可以對具有不同解鏈溫度(因此在不同溫度下不淬滅)的差異探針進行解鏈分析。圖12的測定系統也可以進一步修改，以使得捕獲探針不需要異堿基。在該系統中，報告基團探針包含在其5’端的報告基團標記的isoC核苷酸(“isoC＊”)、第一序列區(“區1”)、包含isoG和/或isoC位的序列(“isoprimer”)；和與擴增子互補的序列(表示為“A”)。與擴增子互補的序列還包含至少一個核糖核苷酸位置。在靶擴增子存在下，報告基團探針與擴增子雜交，并在核糖核苷酸位置被RNA酶H切割。切割后，報告基團探針可與捕獲寡核苷酸雜交，捕獲寡核苷酸包含與isoprimer和任選的“A”序列部分互補的捕獲區段，然后是鏡像區1(其與區1序列的一部分相同)。報告基團探針的延伸將合成與捕獲寡核苷酸上的鏡像區域1互補的序列。然后可切割探針通過區1序列和與同鏡像區1互補之序列的堿基配對可形成發夾。發夾序列進一步延伸并且將引入淬滅基團標記的isoG(“isoGQ”)。可以將探針設計為具有獨特的解鏈溫度(Tm)，例如通過調節第一序列區的序列和長度。因此，可以對具有不同解鏈溫度(因此在不同溫度下不淬滅)的差異探針進行解鏈分析。圖15示出了另一個實施方案，其中探針包含熒光團(F)和淬滅基團(Q)兩者。當單鏈時第一序列區的構象使得熒光團與淬滅基團接近，導致熒光團信號的可檢測淬滅。在靶標存在下，探針與靶標雜交，并在核糖核苷酸位置被核糖核酸酶切割。在該特定實施方案中，第二序列區互補序列、核糖核苷酸和核糖核苷酸的靶特異性區域3’與靶標互補。在探針切割后，經切割探針的第二序列區和第二序列區互補序列彼此雜交以形成發夾結構。經切割探針的3’端延伸到第一序列區上產生具有將熒光團置于距淬滅基團更遠距離的構象的雙鏈分子，以使得可觀察到信號的可檢測改變。圖16示出了另一個實施方案，其中探針包含熒光團(F)和淬滅基團(Q)兩者。當單鏈時第一序列區的構象使得熒光團與淬滅基團接近，導致熒光團信號的可檢測淬滅。在靶標存在下，探針與靶標雜交，并被延伸上游引物的聚合酶的5’核酸酶活性切割。在該特定實施方案中，第二序列區互補序列不與靶標互補。在探針切割后，經切割探針的第二序列區和第二序列區互補序列彼此雜交以形成發夾結構。經切割探針的3’端延伸到第一序列區上產生具有將熒光團置于距淬滅基團更遠距離的構象的雙鏈分子，以使得可觀察到信號的可檢測改變。圖17示出了一個實施方案，其中探針包含報告基團-淬滅基團對的成員之一，在該特定情況下，其為熒光團(F)。此外，探針包含第一序列區、第二序列區、環區、第二序列區互補序列、一個或更多個核糖核苷酸和核糖核苷酸的靶標特異性區3’。在該特定實施方案中，環區、第二序列區互補序列、核糖核苷酸和核糖核苷酸的靶標特異性區3’與靶標互補。實施例3.在逆轉錄PCR中使用具有延伸阻斷劑(blocker)的發夾探針將正向引物(FwdPrimer)和反向引物(RevPrimer)與ATG0015探針或T-FL-RTx2c探針在孔中組合，所述探針的不同之處僅在于ATG00015探針在環區中含有3個碳間隔區(iSpC3)，而T-FL-RTx2c沒有。將這些與PCR主混合物合并，熱循環，隨后進行解鏈分析。ATG0015：/56-FAM//iMe-isodC/ATATCAGTCATTTGCCCAAAA(SEQIDNO：24)/iSpC3/AAACCGCAAATGACrCATGAGACAGTATAGTAGCGCTGA(SEQIDNO：25)/3SpC3/T-FL-RTx2c：/56-FAM//iMc-isodC/ATATCAGTCATTTGCCCAAAAAAAACCGCAAATGACrCATGAGACAGTATAGTAGCGCTGA(SEQIDNO：15)/3SpC3/正向引物-GAAGCATTTGAAATAGCAGAAGG(SEQIDNO：22)反向引物-CACAGAGCGTTCCTAGTTTTACT(SEQIDNO：23)在沒有模板的情況下進行逆轉錄PCR以監測解鏈分析期間將造成信號改變的非特異性相互作用。產生以下PCR主混合物用于25μL反應，并在ABIFast7500實時熱循環儀上運行。熱譜包括50℃保持5分鐘，95℃保持2分20秒，以下的44個循環：95℃10秒和57℃23秒。解鏈分析包括從60℃升溫至95℃，并且每0.5℃讀數。表3：PCR主混合物試劑工作濃度無核酸酶的水10XISOlution1x100mMMgCl22.5mM1MKCl0.05M乙型流感正向引物0.12M乙型流感反向引物0.06M探針0.06MRNA酶H2熱啟動1mU無甘油的TitaniumTaq1xMMLV逆轉錄酶0.75圖13示出了在解鏈分析期間獲得的數據的反向導數。對于在環區中缺少3碳間隔區的T-FL-RTx2c探針，存在77℃的非特異性解鏈峰。不希望受理論束縛，認為在50℃的低溫逆轉錄酶步驟期間，在這種情況下的反向引物與環區下游的探針雜交，這允許引物延伸通過環并且引入標記的異堿基對面的淬滅基團。這種雜交還導致核糖堿基被切割，允許探針也沿著引物延伸。在PCR反應期間擴增雙鏈產物。延伸阻斷劑防止引物在環區上的非特異性延伸，其不僅防止淬滅基團/熒光團對的形成，而且防止在PCR的58℃退火步驟期間具有足夠Tm的雙鏈產物被擴增。實施例4.使用單一染料的多重性該研究證明了使用具有相同熒光團但在各經延伸發夾探針的Tm不同的多個發夾探針的能力。在相同的PCR管中，對甲型流感、乙型流感或腺病毒特異的具有相同的熒光團(FAM)的三種不同探針一起測試。將含有甲型流感、乙型流感或腺病毒的經提取病毒培養物的陽性對照樣品置于含有多重PCR反應組分的單獨的PCR管中。這些靶標以每個反應1000個拷貝進行測試。可切割的探針序列示于表4中。表4：探針序列產生下列PCR主混合物(表5)用于25μL反應，并在LifeTechnologiesQuantStudio實時PCR熱循環儀上運行。熱譜包括50℃保持5分鐘，95℃保持2分20秒，以下的44個循環：95℃10秒和57℃23秒。解鏈分析包括從60℃升溫至95℃，并且每0.5℃讀數。表5：PCR主混合物圖14示出了使用相同的多重PCR反應混合物的6個單獨反應(以1000個拷貝/反應的三種靶標各自1個陽性，3個無模板對照(NTC)樣品)的解鏈譜數據。從圖14可以看到，甲型流感、乙型流感和腺病毒特異性可切割探針在相同的熒光通道中各自產生不同的解鏈譜。因此，在該實施例中，當使用相同的熒光標記物時，通過解鏈譜區分了三種不同的病毒。***根據本公開內容的教導，可以進行和執行本文公開和要求保護的所有方法而無需過度實驗。雖然已經根據一些優選實施方案描述了本發明的組合物和方法，但是對于本領域技術人員明顯的是，可以將變化應用于本文所述方法以及本文所述方法的步驟或步驟的順序中而不脫離本發明的概念、精神和范圍。更具體地，明顯的是，化學和生理學相關的某些試劑可以代替本文所述的試劑，同時將實現相同或相似的結果。對于本領域技術人員明顯的所有這些類似的替代和修改均被認為在由所附權利要求限定的本發明的精神、范圍和概念內。參考文獻以下參考文獻通過引用具體地并入本文，達到提供示例性程序或對本文所闡述的那些程序進行細節補充的程度。美國專利No.4942,124；4284,412；4,989,977；4,498,766；5,478,722；4,857,451；4,774,189；4,767,206；4,714,682；5,160,974；4,661,913；5,654,413；5,656,493；5,716,784；5,736,330；5,837,832；5,837,860；5,981,180；5,994,056；5,736,330；5,981,180；6,057,107；6,030,787；6,046,807；6,057,107；6,103,463；6,139,800；6,174,670；6,268,222；6,322,971；6,366,354；6,410,278；6,411,904；6,449,562；6,514,295；6,524,793；6,528,165；6,592,822；6,939,720；6,977,161；7,226,737；7,645,868；和7,955,802美國專利申請No.2005/0191625；2008/0182312；和2009/0148849McMinn等，J.Am.Chem.Soc.，121：11585，1999.Ren等，J.Am.Chem.Soc.，118：1671，1996.Vogelstein等，P.C.R.Digital，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96：9236-9241，1996.Yan等，“IsothermalAmplifiedDetectionofDNA和RNA”Mol.GioSyst.10：970-1003，2014.序列表<110>LUMINEXCORPORATION<120>用于在核酸測定中改善解鏈分辨和多重性的探針<130>LUMN.P0129WO<150>US62/035,783<151>2014-08-11<160>31<170>PatentInversion3.5<210>1<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探針<400>1atatcagtcattgcccaaaccgcaatgac29<210>2<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探針<400>2atatcagtcattgcccaaaaaaaaccgcaatgac34<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探針<400>3atatcagtcttgcccaaaccgcaagac27<210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探針<400>4atatcagtcttgcccaaaaaaaaccgcaagac32<210>5<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探針<400>5atatcagtcaattgcccaaaccgcaattgac31<210>6<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探針<400>6atatcagtcaattgcccaaaaaaaaccgcaattgac36<210>7<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探針<400>7atatcagtcaagtgccaaacccacttgac29<210>8<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探針<400>8atatcagtcaagtgccaaaaaaaacccacttgac34<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探針<400>9atatcaggtcagccaaaccctgacc25<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探針<400>10atatcagtctgcccaaaccgcagac25<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探針<400>11atatcagtcgcccaaaccgcgac23<210>12<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探針<220><221>modified_base<222>(42)..(42)<223>胞嘧啶核糖核苷（ribocytosine）<400>12atatcagtcattgcccaaaaaaaaaaaaaaaaccgcaatgaccatgagacagtatagtag60cgctga66<210>13<211>58<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探針<220><221>modified_base<222>(35)..(35)<223>胞嘧啶核糖核苷<400>13atatcagtcattgcccaaaaaaaaccgcaatgaccatgagacagtatagtagcgctga58<210>14<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探針<220><221>modified_base<222>(37)..(37)<223>胞嘧啶核糖核苷<400>14atatcagtcatgtgcccaaaaaaaaccgcacatgaccatgagacagtatagtagcgctga60<210>15<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探針<220><221>modified_base<222>(37)..(37)<223>胞嘧啶核糖核苷<400>15atatcagtca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