一種定點切割rna的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種定點切割RNA的方法，屬于RNA切割技術領域。
【背景技術】
[0002]核糖核酸，簡稱RNA，存在于一切細胞的細胞質和細胞核中，也存在于大多數已知的植物病毒和部分動物病毒以及一些噬菌體中。它是由核苷酸通過Y -5r -磷酸二酯鍵連接而成的多聚體。不同種類的RNA鏈長不同，它們參與蛋白質的生物合成，傳遞遺傳信息，調控生命活動，行使著各式各樣的生物功能，具有重要的生命意義。RNA可因剪切等其它生物化學作用被破壞，其生物功能就會降低或喪失；RNA的定點剪切也可以用于制備所需小分子的RNA。因此，RNA的特異性剪切在分子生物學，生物化學和醫學領域有著廣泛的應用。例如，在RNA序列上的特定位點進行切割，可研究切割后產物同原始RNA的功能的區另IJ，從而進一步解析RNA序列信息，對分子生物學的發展和生命活動的研究具有重要的意義。因此，生命科學的研究和分子生物學的發展必須依賴于RNA特異性剪切技術。目前為止RNA的特異性剪切主要依賴以下三種技術:Ribozyme、DNAzyme及金屬離子配合物剪切RNA。但這三種技術方案中Ribozyme所用的試劑成本較高！DNAzyme只能切割特殊的堿基序列，應用范圍小；而金屬離子配合物剪切RNA對剪切環境的要求較高。因此，為解決以上問題，亟待研發一種新的定點切割RNA的方法。
【發明內容】
[0003](一 )要解決的技術問題
[0004]為解決上述問題，本發明提出了一種定點切割RNA的方法，試劑成本低，合成方法簡便，應用范圍廣。
[0005]( 二)技術方案
[0006]本發明的定點切割RNA的方法，所述方法包括如下步驟:
[0007]步驟一:設計與目的RNA互補的DNA序列，并且根據實際應用需要在特定位置對其進行偶氮苯修飾；
[0008]步驟二:按照步驟一設計要求，合成具有偶氮苯修飾的DNA序列；
[0009]步驟三:引入RNase H，并使其在偶氮苯修飾的DNA序列的引導下，在指定區域或特異位點切割RNA。
[0010]進一步地，所述步驟一具體如下:設計同底物RNA互補的DNA序列，根據底物RNA分子的大小和需要特異性剪切的位置來確定互補DNA的長短和需要進行偶氮苯修飾的堿基；同時根據需要，進行不同程度的偶氮苯修飾，剪切的位點由偶氮苯分子參入DNA序列的位置和數量來決定。
[0011]進一步地，所述步驟二具體如下:按照步驟一設計的DNA序列，在DNA合成儀上合成所需要的偶氮苯修飾DNA序列，在需要的參入偶氮苯分子的位置使用負載有偶氮苯的連接臂分子單體，將偶氮苯分子引入到堿基之間。
[0012]進一步地，所述步驟三具體如下:在步驟二合成修飾DNA結束以后，可以用合成的修飾序列引導RNase H對底物RNA進行特異性剪切。
[0013]作為優選的實施方案，所述連接臂分子單體為D-蘇氨醇、L-蘇氨醇、1，3-丙二醇、甘油酸中的一種。
[0014](三)有益效果
[0015]與現有技術相比，本發明的定點切割RNA的方法，本方法所使用的偶氮苯修飾DNA序列和RNase H在催化體系和保存條件下更加穩定，不易受到核糖核酸酶的作用而發生降解。并且本方法所使用的試劑成本更加低廉，反應不需要高濃度的Mg2+，對催化環境改變的耐受性更強；偶氮苯修飾的DNA序列對底物RNA的切割沒有堿基偏好性，應用范圍廣；本發明中所使用的偶氮苯修飾DNA序列，合成方法更為簡潔，在需要參入偶氮苯分子的位置，只要使用一種負載有偶氮苯的連接臂分子便可以達到目的，并且可以使用多種連接臂引入偶氮苯，且不影響切割的特異性和效果，合成方法比氧甲基化修飾的DNA序列有更多的選擇；本方法所使用的試劑穩定性更高，并且設計和合成過程簡單，價格低廉，并且切割不受序列的限制，任何RNA序列都可以用本方法切割；RNase H本身為蛋白質，其對體系溫度、pH和離子強度改變的耐受性更強；同時催化能力更高，短時間之內對底物的降解就可以達到90%以上。此外，商業化的RNase H和偶氮苯修飾的DNA在標準條件下均可以保存I?2年的時間，可使用的次數多。
【附圖說明】
[0016]圖1是本發明的偶氮苯修飾的結構示意圖；
[0017]圖2是本發明的單一位點的RNA剪切的結構示意圖；
[0018]圖3是本發明的長鏈RNA上某一特定區域的切割的結構示意圖；
[0019]圖4是本發明的RNase H特異切割RNA原理圖；
[0020]圖5是本發明的在單一位點切割RNA的實例結果圖；
[0021]圖6是本發明的長鏈RNA上某一特定區域的切割RNA的實例結果圖。
【具體實施方式】
[0022]—種定點切割RNA的方法，所述方法包括如下步驟:
[0023]步驟一:設計與目的RNA互補的DNA序列，并且根據實際應用需要在特定位置對其進行偶氮苯修飾；其中，如圖1A所示為用于修飾DNA的偶氮苯分子，如圖1B所示為參入堿基后的形式，圖1C代表圖1A的偶氮苯；
[0024]步驟二:按照步驟一設計要求，合成具有偶氮苯修飾的DNA序列；
[0025]步驟三:引入RNase H，并使其在偶氮苯修飾的DNA序列的引導下，在指定區域或特異位點切割RNA。
[0026]實施例1:
[0027]如圖2和圖4所示的一種定點切割RNA的方法，所述方法具體包括如下步驟:
[0028]所述步驟一具體如下:針對特定的底物RNA序列(5 ^ -FAM-AAAAAGUAAAUAUUGGCGUAGCAGCACGU-3')，設計同底物 RNA 互補的 DNA 序列(3' -ACCGCAXTCXGTX-5'，“X”代表偶氮苯修飾)，根據底物RNA分子的大小和需要特異性剪切的位置來確定互補DNA的長短和需要進行偶氮苯修飾的堿基；同時根據需要，進行不同程度的偶氮苯修飾，剪切的位點由偶氮苯分子參入DNA序列的位置和數量來決定，具體偶氮苯修飾位置和個數由圖5A所示；偶氮苯修飾DNA序列對單一位點的RNA進行剪切，所使用的DNA序列短，偶氮苯修飾個數少，有利于節約成本，并且短序列切割位點單一，主要用于體外轉錄后RNA的單一位點切割。
[0029]所述步驟二具體如下:按照步驟一設計的DNA序列(3' -ACCGCAXTCXGTX-5')，在DNA合成儀上合成所需要的偶氮苯修飾DNA序列，在需要參入偶氮苯分子的位置使用負載有偶氮苯的連接臂分子單體，將偶氮苯分子引入到堿基之間。
[0030]所述步驟三具體如下:在步驟二合成修飾DNA結束以后，可以用合成的修飾序列引導RNase H對底物RNA進行特異性剪切；RNase H會結合到DNA序列的:V端同RNA形成的雙鏈部位，在設計的特異位點進行剪切；一次剪切反應結束后，被切斷的底物RNA同偶氮苯修飾DNA和RNase H分離，DNA序列和RNase H又可以結合到新的RNA分子上，催化下次切割反應。具體操作步驟如下:使用1yL IXRNase H buffer反應體系，其中含有20URNA酶抑制劑、1.0 μ M底物RNA和0.05 μ M偶氮苯修飾DNA ;將上述體系在渦旋振蕩機上混合均勻，再加入2.0U RNase H，用移液槍吹打混勻，37°C溫育40min ;待反應結束后，將體系置于65°C，1min溫育，滅活RNase H。
[0031]實施結果如圖5所示。
[0032]實施例2:
[0033]如圖3和圖4所示的一種定點切割RNA的方法，所述方法具體包括如下步驟:
[0034]所述步驟一具體如下:針對特定的底物RNA序列(5 ^ -FAM-AAAAAGUAAAUAUUGGCGUAGCAGCACGU-3r )，設計同底物RNA互補的DNA序列，根據底物RNA分子的大小和需要特異性剪切的位置來確定互補DNA的長短和需要進行偶氮苯修飾的堿基；同時根據需要，進行不同程度的偶氮苯修飾，剪切的位點由偶氮苯分子參入DNA序列的位置和數量來決定，所設計DNA序列為W -TAXTAXACCGCAXTCXGT-5丨，其中，“X”代表偶氮苯修飾；DNA序列在特異性剪切位點兩端都有偶氮苯修飾，對長鏈RNA上某一特定區域的切割，這種設計可以提高修飾DNA序列抗核酸酶降解的能力，使用較長的修飾序列，可以增加對長鏈RNA剪切的特異性。
[0035]所述步驟二具體如下:按照步驟一設計的DNA(3' -TAXTAXACCGCAXTCXGT-5r )序列，在DNA合成儀上合成所需要的偶氮苯修飾DNA序列，在需要的參入偶氮苯分子的位置使用負載有偶氮苯的連接臂分子單體，將偶氮苯分子引入到堿基之間。
[0036]所述步驟三具體如下:在步驟二合成修飾DNA結束以后，可以用合成的修飾序列引導RNase H對底物RNA進行特異性剪切；RNase H會結合到DNA序列的:V端同RNA形成的雙鏈部位，在設計的特異位點進行剪切；一次剪切反應結束后，被切斷的底物RNA同偶氮苯修飾DNA和RNase H分離，DNA序列和RNase H又可以結合到新的RNA分子上，催化下次切割反應。具體操作步驟如下:使用1yL IXRNase H buffer反應體系，其中含有20URNA酶抑制劑、1.0 μ M底物RNA和0.05 μ M偶氮苯修飾DNA ;將上述體系在渦旋振蕩機上混合均勻，再加入2.0U RNase H，用移液槍吹打混勻，37°C溫育40min ;待反應結束后，將體系置于65°C，1min溫育，滅活RNase H。
[0037]實施結果如圖6所示。
[0038]該步驟的反應機理和過程與實施例1中步驟三的反應機理及過程相同，只是由于設計原因，該序列會引導RNase H在RNA上的指定區域發生剪切，生成兩種特異性切割的產物。
[0039]其中，所述連接臂分子單體為D-蘇氨醇、L-蘇氨醇、1，3_丙二醇、甘油酸中的一種。
[0040]由于偶氮苯分子在紫外光和可見光條件下產生不同的構象，本發明切割RNA的效率可以通過光照進行調控。
[0041]上面所述的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，并非對本發明的構思和范圍進行限定。在不脫離本發明設計構思的前提下，本領域普通人員對本發明的技術方案做出的各種變型和改進，均應落入到本發明的保護范圍，本發明請求保護的技術內容，已經全部記載在權利要求書中。
【主權項】
1.一種定點切割RNA的方法，其特征在于:所述方法包括如下步驟: 步驟一:設計與目的RNA互補的DNA序列，并且根據實際應用需要在特定位置對其進行偶氮苯修飾； 步驟二:按照步驟一設計要求，合成具有偶氮苯修飾的DNA序列； 步驟三:引入RNase H，并使其在偶氮苯修飾的DNA序列的引導下，在指定區域或特異位點切割RNA。2.根據定點切割RNA的方法，其特征在于:所述步驟一具體如下:設計同底物RNA互補的DNA序列，根據底物RNA分子的大小和需要特異性剪切的位置來確定互補DNA的長短和需要進行偶氮苯修飾的堿基；同時根據需要，進行不同程度的偶氮苯修飾，剪切的位點由偶氮苯分子參入DNA序列的位置和數量來決定。3.根據定點切割RNA的方法，其特征在于:所述步驟二具體如下:按照步驟一設計的DNA序列，在DNA合成儀上合成所需要的偶氮苯修飾DNA序列，在需要的參入偶氮苯分子的位置使用負載有偶氮苯的連接臂分子單體，將偶氮苯分子引入到堿基之間。4.根據定點切割RNA的方法，其特征在于:所述步驟三具體如下:在步驟二合成修飾DNA結束以后，可以用合成的修飾序列引導RNase H對底物RNA進行特異性剪切。5.根據定點切割RNA的方法，其特征在于:所述連接臂分子單體為D-蘇氨醇、L-蘇氨醇、1，3-丙二醇、甘油酸中的一種。
【專利摘要】本發明公開了一種定點切割RNA的方法，所述方法包括如下步驟：步驟一：設計與目的RNA互補的DNA序列，并且根據實際應用需要在特定位置對其進行偶氮苯修飾；步驟二：按照步驟一設計要求，合成具有偶氮苯修飾的DNA序列；步驟三：引入RNase H，并使其在偶氮苯修飾的DNA序列的引導下，在指定區域或特異位點切割RNA。本發明的定點切割RNA的方法，試劑成本低，合成方法簡便，應用范圍廣。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號】CN105713896
【申請號】CN201510098161
【發明人】王星宇, 王鵬飛, 賈秀雙
【申請人】常州易順生物技術有限公司