從動物肺臟中分離硫酸乙酰肝素的方法
【專利摘要】本發明公開了一種從動物肺臟中分離硫酸乙酰肝素的方法，屬于生物制藥【技術領域】，以動物肺臟為原料，選用水解酶對動物肺臟的鹽水提取物進行組合酶降解，隨后在酶解液中加入氧化劑和活性炭進行氧化吸附脫色，然后采用丙酮對氧化后的溶液分級沉淀，并脫水干燥制得硫酸乙酰肝素粗品，然后對粗品硫酸乙酰肝素的水溶液依次采用膜分離和陰離子交換層析，將硫酸乙酰肝素與硫酸皮膚素、硫酸軟骨素、肝素等雜質分離，再使用5000-7000Da的超濾膜對洗脫液進行超濾濃縮，最后使用凝膠過濾層析脫鹽并凍干，得硫酸乙酰肝素精品。本發明從動物肺臟中分離硫酸乙酰肝素的方法，工藝條件簡單，易于實現，且原料易于獲取，成本低，所得硫酸乙酰肝素純度高。
【專利說明】從動物肺臟中分離硫酸乙酰肝素的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物制藥【技術領域】，具體涉及一種從動物肺臟中分離硫酸乙酰肝素的方法。
【背景技術】
[0002]硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate, HS)屬于黏多糖類化合物，因其組成糖基和糖苷鍵連接方式上與肝素相似而得名。但其糖鏈中以由β -D-葡萄糖醛酸和2-Ν-乙酰氨基2-去氧ct-D-匍萄糖(包括C6-0-硫酸酯取代)通過(1 — 4)連接的雙糖單位為主。HS是與肝素緊密相連但又獨立的一類糖胺聚糖(Casu，2005)。同肝素相比HS硫酸化程度較低，而乙酰化程度較高。
[0003]腫瘤是當今世界上發病率最高、對人類健康和生命危害極大的疾病。據統計，近幾年在中國，死于腫瘤的人數占死亡總人數比例超過25 %，部分地區超過30 %，且死亡人數及比例正逐年增加。目前，并無很好的治療性藥物，對該類藥物的開發仍然是世界上的研究的熱點。最新研究表明，HS是近年來研究發現可以通過調節免疫功能和抑制腫瘤細胞的轉移而發揮抗腫瘤作用的新的多糖類藥物。目前，以HS為原料，通過酶工程或化學法來制備其衍生物，是世界研究的熱點，以其得到藥理作用強、副作用小、療效高的新產品。因而，該產品具有廣闊的應用前景。其藥理作用強、無明顯的毒副作用是其突出特點，由牛肺或豬肺來源的HS具有很強的抗腫瘤和抗血栓活性。
[0004]我國是世界上產牛、豬、羊等哺乳動物的大國，每年都有大量的牛肺、豬肺和羊肺等沒有很好的利用，以其為原料開發有高生物活性的硫酸乙酰肝素將具有巨大的經濟效益和社會效益。國內尚未有開發該產品的報道，開發該產品，可出口原料藥，也開發為國內新藥。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供了一種從動物肺臟中分離硫酸乙酰肝素的方法。
[0006]本發明所述的一種從動物肺臟中分離硫酸乙酰肝素的方法，包括以下步驟:
[0007]I)鹽水提取:將肺臟搗碎，然后加入其重量30-40倍2%的NaCl水溶液(w/v)，溫度控制在90-95°C，攪拌5-6h，離心，分別收集上清液和沉淀，向沉淀中加入80-120倍2%的NaCl水溶液(w/v)，重復上述操作2-3次；
[0008]2)酶水解:合并步驟I)中的上清液，調節pH為9-11，溫度為40_50°C，加入水解酶，攪拌20-24h，然后升溫至90-95°C，保溫2_3h，離心，棄去沉淀，向上清液中加入乙醇，沉淀12-18h，得沉淀物；
[0009]3)氧化脫色:在步驟2)所得的沉淀物中加入其重量30-60倍的2% NaCl水溶液，控制溶解液溫度為40°C -50°C, pH為9-11，加入溶解液體積0.1 %的KMnO4和0.2%的活性炭，室溫攪拌6-8h，離心去除沉淀，向上清液中加入I倍體積的乙醇沉淀12-18h，得沉淀物；
[0010]4)丙酮分級沉淀:在步驟3)所得的沉淀物中加入其重量30-60倍的2% NaCl水溶液，攪拌溶解，加入0.6-1.3倍體積的丙酮，沉淀12-18h，離心收集沉淀，重復上述操作3次，向沉淀物加入2-3倍體積的乙醇，充分攪拌，靜置過濾去除乙醇，真空干燥得硫酸乙酰肝素粗品；
[0011]5)超濾:向硫酸乙酰肝素粗品中加入80-120倍體積純化水，攪拌溶解，循環超濾3_5h，收集截留液；
[0012]6)離子交換柱層析:選擇強陰離子交換樹脂對5)中的截留液進行交換吸附，先以2-3倍體積的0.5-lmol/L的NaCl溶液進行洗脫；再用2-3倍體積的1.5mol/L的NaCl溶液洗脫，收集洗脫液；
[0013]7)凝膠過濾層析:對6)中的洗脫液進行凝膠過濾層析，收集洗脫液；
[0014]8)濃縮:對7)中的洗脫液進行超濾為原體積的1/20-1/30，收集截留液；
[0015]9)凝膠過濾脫鹽:對8)中的洗脫液進行凝膠過濾脫鹽，收集洗脫液；
[0016]10)凍干:將步驟9)所得的洗脫液凍干，得到硫酸乙酰肝素精品。
[0017]所述步驟2)酶水解過程中，所述水解酶為胰蛋白酶、核糖核酸酶II中的一種或二者的組合。
[0018]所述步驟2)酶水解過程中，胰蛋白酶的用量為為肺臟重量的0.5% -2.0%，加入乙醇的量為上清液體積的2-3倍。
[0019]所述步驟5)中，選用截留分子量為5000_7000Da的超濾膜。
[0020]所述步驟7)中,采用Sephadex G-100制備層析柱進行洗脫。
[0021]所述步驟9)中采用Sephadex G_10層析柱進行洗脫。
[0022]選用截留分子量為2000_4000Da的超濾膜。
[0023]所述動物肺臟為哺乳動物肺臟。
[0024]與現有技術相比，本發明的優點在于:本發明從動物肺臟中分離硫酸乙酰肝素的方法，工藝條件簡單，易于實現，且原料易于獲取，成本低，所得硫酸乙酰肝素純度高。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1為本發明實施例1、2和3所得硫酸乙酰肝素的凝膠色譜圖；
[0026]圖中，色譜帶分別為標準品HS、牛肺制的HS、豬肺制的HS和羊肺制的HS。
【具體實施方式】
[0027]下面結合實施例對本發明作進一步說明。
[0028]實施例1
[0029]從動物肺臟中分離硫酸乙酰肝素的方法，包括以下步驟:
[0030]I)取豬肺3Kg搗碎，然后加入120L 2% NaCl溶液，90°C攪拌5小時，離心，轉移上清液并收集沉淀，向沉淀中加入300L的2% NaCl純化水溶液，重復上述操作2次；
[0031]2)合并步驟I)中的上清液，用NaOH溶液調整pH為9，在40°C下加入胰蛋白水解酶60g，攪拌24小時，然后將溫度升至90°C保溫3個小時，離心，棄去沉淀，向上清液中加入乙醇，沉淀18小時，得沉淀物626g ；
[0032]3)在步驟2)所得的沉淀物中加入其重量60倍的2% NaCl水溶液，攪拌溶解，得溶解液；控制溶解液溫度為40°C V，調整溶解液pH為9，加入溶解液體積0.1 %的KMnO4和0.2%的活性炭，室溫攪拌反應8小時，離心去除沉淀，向其中加入一倍體積的乙醇沉淀18小時，得沉淀物；
[0033]4)在步驟3)所得的沉淀物中加入其重量60倍的2% NaCl水溶液，攪拌溶解，得溶解液，向溶解液中加入0.6倍體積的丙酮，室溫下攪拌沉淀18小時，離心收集沉淀；向沉淀物中加入其重量60倍體積的2% NaCl水溶液，攪拌溶解，得溶解液，向溶解液中加入0.8倍體積的丙酮，室溫下攪拌沉淀18小時，離心收集沉淀；60倍體積的2% NaCl水溶液，攪拌溶解，得溶解液，向溶解液中加入1.2倍體積的丙酮，室溫下攪拌沉淀18小時，離心收集沉淀；60倍體積的2% NaCl水溶液，攪拌溶解，得溶解液，向溶解液中加入1.3倍體積的丙酮，室溫下攪拌沉淀18小時，離心收集沉淀，并向沉淀中加入2倍體積的99.9%的乙醇，去除乙醇，真空干燥得硫酸乙酰肝素粗品；
[0034]5)向步驟4)中的硫酸乙酰肝素粗品中加入100倍體積純化水，攪拌溶解，得溶解液；選擇截留分子量為7000Da的超濾膜超濾，循環超濾5小時收集截留液；
[0035]6)選擇強陰離子交換樹脂對5)中的截留液進行交換吸附，先以2倍體積的Imol/L的NaCl水溶液進行洗脫；再用2倍體積的1.5mol/L的NaCl溶液洗脫，并收集洗脫液；
[0036]7)選擇Sephadex G-100制備層析柱對6)中的洗脫液進行分離純化，洗脫速度為2ml/s，分段收集洗脫液；
[0037]8)選擇分子量為100Da的超濾膜對7)中的洗脫液進行濃縮，收集截留液；
[0038]9)選擇S^hadex G-1O層析柱對8)中的洗脫液進行洗脫，分段收集洗脫液；
[0039]10)將洗脫液凍干，得到HS精品；其純度彡98%。
[0040]實施例2
[0041]從動物肺臟中分離硫酸乙酰肝素的方法，包括以下步驟:
[0042]I)取牛肺2.5Kg搗碎，然后加入100L 2% NaCl溶液，95°C攪拌6小時，離心，轉移上清液并收集沉淀。向沉淀中加入200L的2% NaCl溶液，并重復2次；
[0043]2)合并步驟I)中的上清液，用NaOH溶液調整pH為11，在50°C加入胰蛋白水解酶20g和核糖核酸酶II 13g攪拌22小時然后將溫度升至95°C保溫3個小時，離心，棄去沉淀，向上清液中加入乙醇，沉淀17小時，得沉淀物532g ；
[0044]3)在步驟2)所得的沉淀物中加入其重量50倍的2% NaCl水溶液，攪拌溶解，得溶解液；控制溶解液溫度為50°C，調整溶解液pH為11，加入溶解液體積0.1 %的KMnO4和0.2%的活性炭，室溫攪拌反應6小時，離心去除沉淀，向其中加入一倍體積的乙醇沉淀12小時，得沉淀物；
[0045]4)在步驟3)所得的沉淀物中加入其重量30倍的2% NaCl水溶液，攪拌溶解，得溶解液，向溶解液中加入0.6倍體積的丙酮，室溫下攪拌沉淀12小時，離心收集沉淀；向沉淀物中加入其重量30倍體積的2% NaCl水溶液，攪拌溶解，得溶解液，向溶解液中加入0.8倍體積的丙酮，室溫下攪拌沉淀12小時，離心收集沉淀；30倍體積的2% NaCl水溶液，攪拌溶解，得溶解液，向溶解液中加入1.2倍體積的丙酮，室溫下攪拌沉淀12小時，離心收集沉淀；30倍體積的2% NaCl水溶液，攪拌溶解，得溶解液，向溶解液中加入1.3倍體積的丙酮，室溫下攪拌沉淀12小時，離心收集沉淀，并向沉淀中加入2倍體積的99.9%的乙醇，充分攪拌，靜置抽濾去除乙醇，真空干燥得硫酸乙酰肝素粗品；
[0046]5)向步驟4)中的硫酸乙酰肝素粗品中加入100倍體積純化水，攪拌溶解，得溶解液；選擇截留分子量為5000Da的超濾膜超濾，循環超濾3小時收集截留液；
[0047]6)選擇強陰離子交換樹脂對5)中的截留液進行交換吸附，先以2.5倍體積的0.5mol/L的NaCl水溶液進行洗脫；再用2.5倍體積的1.5mol/L的NaCl溶液洗脫，并收集洗脫液；
[0048]7)選擇S^hadex G-100制備層析柱對6)中的洗脫液進行分離純化，洗脫速度為2ml/s，分段收集洗脫液；
[0049]8)選擇分子量為100Da的超濾膜對7)中的洗脫液進行濃縮，收集截留液；
[0050]9)選擇S印hadex G-1O層析柱對8)中的洗脫液進行脫鹽洗脫，分段收集洗脫液；
[0051]10)將洗脫液凍干，得到HS精品；其純度彡97%。
[0052]實施例3
[0053]從動物肺臟中分離硫酸乙酰肝素的方法，包括以下步驟:
[0054]I)取2Kg搗碎，然后加入80L 2 % NaCl溶液，92°C攪拌5小時，離心，轉移上清液并收集沉淀。向沉淀中加入200L的2% NaCl純化水溶液，并重復2次；
[0055]2)合并步驟I)中的上清液，用NaOH溶液調整pH為10，在45°C加入胰蛋白水解酶36g和核糖核酸酶II 24g攪拌24小時然后將溫度升至92°C保溫3個小時，離心，棄去沉淀，向上清液中加入乙醇，沉淀15小時，得沉淀物626g ；
[0056]3)在步驟2)所得的沉淀物中加入其重量50倍的2% NaCl水溶液，攪拌溶解，得溶解液；控制溶解液溫度為45°C，調整溶解液pH為10，加入溶解液體積0.1 %的KMnO4和0.2%的活性炭，室溫攪拌反應7小時，離心去除沉淀，向其中加入一倍體積的乙醇沉淀15小時，得沉淀物；
[0057]4)在步驟3)所得的沉淀物中加入其重量50倍的2% NaCl水溶液，攪拌溶解，得溶解液，向溶解液中加入0.6倍體積的丙酮，室溫下攪拌沉淀15小時，離心收集沉淀；向沉淀物中加入其重量50倍體積的2% NaCl水溶液，攪拌溶解，得溶解液，向溶解液中加入0.8倍體積的丙酮，室溫下攪拌沉淀15小時，離心收集沉淀；50倍體積的2% NaCl水溶液，攪拌溶解，得溶解液，向溶解液中加入1.2倍體積的丙酮，室溫下攪拌沉淀15小時，離心收集沉淀；50倍體積的2% NaCl水溶液，攪拌溶解，得溶解液，向溶解液中加入1.3倍體積的丙酮，室溫下攪拌沉淀15小時，離心收集沉淀，并向沉淀中加入2倍體積的99.9%的乙醇，去除乙醇，真空干燥得硫酸乙酰肝素粗品；
[0058]5)向步驟4)中的硫酸乙酰肝素粗品中加入110倍體積純化水，攪拌溶解，得溶解液；選擇截留分子量為6000Da的超濾膜超濾，循環超濾5小時收集截留液；
[0059]6)選擇強陰離子交換樹脂對5)中的截留液進行交換吸附，先以3倍體積的0.7mol/L的NaCl水溶液進行洗脫；再用3倍體積的1.5mol/L的NaCl溶液洗脫，并收集洗脫液；
[0060]7)選擇S印hadex G-100制備層析柱對6)中的洗脫液進行分離純化，洗脫速度為2ml/s，分段收集洗脫液；
[0061]8)選擇分子量為100Da的超濾膜對7)中的洗脫液進行濃縮，收集截留液；
[0062]9)選擇S印hadex G-1O層析柱對8)中的洗脫液進行洗脫，分段收集洗脫液；
[0063]10)將洗脫液凍干，得到HS精品；其純度彡99%。
[0064] 由圖1可得知，采用本方法制備的HS精品，雜質極少，純度高。
【權利要求】
1.一種從動物肺臟中分離硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)鹽水提取:將肺臟搗碎，然后加入其重量30-40倍2%的NaCl水溶液(w/v)，溫度控制在90-95°C，攪拌5-6h，離心，分別收集上清液和沉淀，向沉淀中加入80-120倍2%的NaCl水溶液(w/v)，重復上述操作2-3次； 2)酶水解:合并步驟I)中的上清液，調節PH為9-11，溫度為40-50°C，加入水解酶，攪拌20-24h，然后升溫至90-95°C，保溫2_3h，離心，棄去沉淀，向上清液中加入乙醇，沉淀12-18h，得沉淀物； 3)氧化脫色:在步驟2)所得的沉淀物中加入其重量30-60倍的2%NaCl水溶液，控制溶解液溫度為40°C -50°C，pH為9-11，加入溶解液體積0.1 %的KMnO4和0.2%的活性炭，室溫攪拌6-8h，離心去除沉淀，向上清液中加入I倍體積的乙醇沉淀12-18h，得沉淀物； 4)丙酮分級沉淀:在步驟3)所得的沉淀物中加入其重量30-60倍的2%NaCl水溶液，攪拌溶解，加入0.6-1.3倍體積的丙酮，沉淀12-18h，離心收集沉淀，重復上述操作3次，向沉淀物加入2-3倍體積的乙醇，充分攪拌，靜置過濾去除乙醇，真空干燥得硫酸乙酰肝素粗品; 5)超濾:向硫酸乙酰肝素粗品中加入80-120倍體積純化水，攪拌溶解，循環超濾3-5h，收集截留液； 6)離子交換柱層析:選擇強陰離子交換樹脂對5)中的截留液進行交換吸附，先以2-3倍體積的0.5-lmol/L的NaCl溶液進行洗脫；再用2_3倍體積的1.5mol/L的NaCl溶液洗脫，收集洗脫液； 7)凝膠過濾層析:對6)中的洗脫液進行凝膠過濾層析，收集洗脫液； 8)濃縮:對7)中的洗脫液進行超濾為原體積的1/20-1/30，收集截留液； 9)凝膠過濾脫鹽:對8)中的洗脫液進行凝膠過濾脫鹽，收集洗脫液； 10)凍干:將步驟9)所得的洗脫液凍干，得到硫酸乙酰肝素精品。
2.根據權利要求1所述的從動物肺臟中分離硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于，所述步驟2)酶水解過程中，所述水解酶為胰蛋白酶、核糖核酸酶II中的一種或二者的組合。
3.根據權利要求1或2所述的從動物肺臟中分離硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于，所述步驟2)酶水解過程中，胰蛋白酶的用量為為肺臟重量的0.5% -2.0%，加入乙醇的量為上清液體積的2-3倍。
4.根據權利要求1所述的從動物肺臟中分離硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于，所述步驟5)中，選用截留分子量為5000-7000Da的超濾膜。
5.根據權利要求1所述的從動物肺臟中分離硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于，所述步驟7)中,采用Sephadex G-100制備層析柱進行洗脫。
6.根據權利要求1所述的從動物肺臟中分離硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于，所述步驟9)中采用Sephadex G_10層析柱進行洗脫。
7.根據權利要求1所述的從動物肺臟中分離硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于，選用截留分子量為2000-4000Da的超濾膜。
8.根據權利要求1所述的從動物肺臟中分離硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于，所述動物肺臟為哺乳動物肺臟。
【文檔編號】C08B37/10GK104403026SQ201410819670
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月24日 優先權日:2014年12月24日
【發明者】周霞, 郭維, 雷曉剛, 林勇, 喬德強, 郭恩中 申請人:山東辰中生物制藥有限公司