一種濃縮純化肝素的生產工藝的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種濃縮純化肝素的生產工藝，屬于生物工程領域。采用擴張柱床離子交換樹脂法。改變了使用傳統的離子交換固定柱床吸附技術原料液中不能含有不溶性顆粒的限制，并可將肝素與雜質蛋白、核酸及其余硫酸多糖分離，濃縮，純化一次完成。減少工序，縮短時間，降低成本，提高效率和質量。
【專利說明】一種濃縮純化肝素的生產工藝
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種濃縮純化肝素的生產工藝，屬于生物工程領域，具體是一種采用擴張柱床離子交換吸附層析技術濃縮純化肝素的生產工藝。
技術背景
[0002]肝素(heparin)是1916年Mclean研宄凝血機制時從肝臟組織中發現的一種酸性粘多糖。1939年，Brinkhous等證明了肝素具有抗凝血活性，從此，肝素作為天然抗凝血物質而受到世界各國的重視。
目前，非氧化法制備肝素比較常用的方法是離子交換樹脂法。離子交換樹脂的性能和工藝是決定收率的關鍵，要選擇好樹脂的處理方法和處理時間，使其最大限度地進行肝素的交換吸附。國內離子交換樹脂法普遍采用分批吸附的方法，上柱、除雜、洗脫分開進行。這種方法柱效低，對樹脂損害大，操作步驟多，費用高，活性成分提取率低。
【發明內容】
[0003]本發明公開了一種純化肝素的生產工藝。
[0004]本發明的技術方案為:一種濃縮純化肝素的生產工藝，其步驟如下:
(I)粗品制備:
a)豬、牛、羊等哺乳動物的小腸粘膜或肝、肺等臟器的組織勻漿液中加入NaCI，攪拌、靜置、過濾。
[0005]b)在 ρΗ7.5-10.5，40-50 °C 下酶解數小時，NaOH 調 pH 至 8.0-10.0，升溫至50-55°C，保溫2-4h，不斷攪拌，然后快速升溫到92-95°C，保持10_15min，趁熱用80目濾網過濾，得到濾液(I)備用。
c)擴張床柱Streamline50裝入已處理好的強堿性陰離子交換樹脂。控制溫度40-65°C，用蠕動泵調pH為7.5-10.5，適量MTris-HCl緩沖液自柱床底部泵入，使樹脂擴張并保持平衡。保持PH值不變，將適量濾液(I)加MTris-HCl緩沖液配制成NaCI為2_6%，pH為7.5-10.5的溶液，用蠕動泵通進擴張交換柱中先平衡樹脂，然后反復進行離子交換，流速約為每小時2倍柱床體積，直至流出液檢驗無肝素，全部吸附在樹脂上為止。
d)然后配制適量的的2.5-6.5%氯化鈉溶液，MTris-HCl緩沖液調節pH3_5，以2?3個沉積床體積的緩沖液平衡/擴張柱床后，以5-6倍沉積床體積的緩沖液除雜，整個過程控制溫度15-30°C。
e)關掉蠕動泵，使D254樹脂重新沉積，調節活塞至剛好在沉積床的表面，然后以向下的液流和沉積床的狀態進行洗脫。
[0006]f)按洗脫液體積加入1.0倍量的預冷乙醇，沉淀過夜。
g)次日吸除乙醇。沉淀物用1.5-2.5%氯化鈉溶液溶解，調pH至6.0。按溶液體積加
0.7倍乙醇，沉淀過夜。
h)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用無水乙醇、丙酮洗滌脫水。真空干燥后得肝素。
(2)精品制備:
a)將肝素粗品以1: 10的比例溶于3%的氯化鈉溶液中，然后再用2%的氫氧化鈉溶液調PH至7.5-11.5，于室溫靜置數小時，真空抽濾，去沉淀物，濾液待用。
b)在上述清液中加入0.05-0.2%胰蛋白酶，在pH7.5-10.5，35_45°C酶解數小時，升溫98-100°C，10-15min，趁熱真空抽濾，濾液備用。
c)擴張床柱Streamline50裝入已處理好的強堿性陰離子交換樹脂，用蠕動泵將PH7-10，適量MTris-HCl緩沖液自柱床底部泵入，使樹脂擴張并保持平衡。
d)控制溫度40-60°C，將適量濾液加MTris-HCl緩沖液配制pH為7.5-10.5的溶液，用蠕動泵通進擴張交換柱中反復進行離子交換，交換過程中保持PH值與溫度恒定，流速約為每小時2倍柱床體積，直至流出液檢驗無肝素，全部吸附在樹脂上為止。
e)然后配制適量的預冷的2.5-6.5%氯化鈉溶液，MTris-HCl緩沖液調節ρΗ1_3，以2?3個沉積床體積的緩沖液平衡/擴張柱床后，以5-6倍沉積床體積的緩沖液除雜，整個過程控制溫度3-6 °C，流速約為每小時2.5柱床體積。
f)關掉蠕動泵，使樹脂重新沉積，調節活塞至剛好在沉積床的表面，然后以向下的液流和沉積床的狀態進行洗脫。
[0007]g)按洗脫液體積加入1.0倍量的預冷乙醇，沉淀過夜。
h)次日吸除乙醇。沉淀物用2 %氯化鈉溶液溶解，調pH至6.0。
[0008]i)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用無水乙醇、丙酮洗滌脫水。真空干燥后得精品肝素。
有益效果:
本發明用濃縮純化肝素的生產工藝最后得到效價高于180U/mg，收率高于80%的高純度肝素鈉。達到中國藥典標準。
【具體實施方式】
[0009]實施例1
a)豬、牛、羊等哺乳動物的小腸粘膜的組織勻漿液50g左右加水至250L，加入NaCI，攪拌、靜置、過濾。
b)濾液加入0.25%胰蛋白酶，在pH8.5，40 °C下酶解數小時，NaOH調pH至9.0，升溫至50°C，保溫2h，不斷攪拌，然后快速升溫到92-95°C，保持10_15min，趁熱用80目濾網過濾，濾液(I )備用。
c)取適量強堿性D254干樹脂，在蒸餾水中充分浸泡，溶脹后濾干，加等體積乙醇或丙酮攪拌I小時，用蒸餾水洗凈濾干，加4倍量的2mol/l的鹽酸溶液攪拌2小時，用蒸餾水洗至中性，濾干；加2倍量2mol/l的氫氧化鈉溶液攪拌2小時，蒸餾水洗至中性，濾干；最后用2倍量2mol/l的鹽酸溶液攪拌2小時，水洗至中性。
d)取10g已處理好的強堿性D254樹脂加入擴張床柱Streamline50，用蠕動泵以每小時2倍柱床體積的流速將pH為8.0的適量MTris-HCl緩沖液(II )自柱床底部泵入，使樹脂擴張并保持平衡。控制溫度40°C (平衡)。
e)將適量濾液(I)加緩沖液(II )，配置成料液(III)。調整料液(III)NaCI濃度達到3%左右，NaOH調pH至8.0。用蠕動泵將料液(III)通進擴張交換柱中反復進行離子交換，交換過程中保持恒定的PH值，溫度為18°C。流速約為每小時2.5倍柱床體積，直至流出液檢驗無肝素，全部吸附在樹脂上為止(上樣)。，
f)配制10個柱床體積的6%氯化鈉溶液，MTris-HCl緩沖液調節pH3_5，以2?3個沉積床體積的緩沖液平衡/擴張柱床后，以5-6倍沉積床體積的緩沖液除雜，整個過程控制溫度15-25°C，流速約為每小時2.5柱床體積。(向上沖洗，除雜)。
g)關掉蠕動泵，使D254樹脂重新沉積，調節活塞至剛好在沉積床的表面，然后以向下的液流和沉積床的狀態進行洗脫。樹脂先用用約4倍柱床體積的4%氯化鈉溶液進行洗脫，收集洗脫液。再用約2倍柱床體積的3%氯化鈉溶液(用量先多后少)同法洗脫2次。合并全部洗脫液，調節PH為6 (洗脫)。
h)按洗脫液體積加入1.0倍量的預冷乙醇，沉淀過夜。次日吸除乙醇。沉淀物用2%氯化鈉溶液溶解，調pH至6.0。按溶液體積加0.7倍乙醇，沉淀過夜。
i)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用無水乙醇、丙酮洗滌脫水。真空干燥后得肝素成品。
實施例2
a)將1g肝素粗品溶于3%的10ml氯化鈉溶液中，然后再用2%的氫氧化鈉溶液調pH至9，于18°C靜置6小時，真空抽濾，濾液待用。
[0010]b)在上述清液中加入0.03 %胰蛋白酶，在pH8.5，40 °C下酶解4小時，升溫98-100°C，10min，趁熱真空抽濾，濾液(I )備用。
[0011]c)取適量強堿性D254干樹脂，在蒸餾水中充分浸泡，溶脹后濾干，加等體積乙醇或丙酮攪拌I小時，用蒸餾水洗凈濾干，加4倍量的2mol/l的鹽酸溶液攪拌2小時，用蒸餾水洗至中性，濾干；加2倍量2mol/l的氫氧化鈉溶液攪拌2小時，蒸餾水洗至中性，濾干；最后用2倍量2mol/l的鹽酸溶液攪拌2小時，水洗至中性。
[0012]d)取30g已處理好的強堿性D254樹脂加入擴張床柱Streamline50 (5cm內徑)、用蠕動泵以每小時2倍柱床體積的流蘇將pH為8.0的適量MTris-HCl緩沖液(II )自柱床底部泵入，使樹脂擴張并保持平衡(平衡)。
[0013]e)調整pH值9不變，將適量濾液(I )加緩沖液(II )，使粗品氯化鈉濃度達到3%左右(III)。用蠕動泵將料液(III)通進擴張交換柱中反復進行離子交換，交換過程中保持恒定的PH值，保持溫度20°C。流速約為每小時2倍柱床體積，直至流出液檢驗無肝素，全部吸附在樹脂上為止(上樣)。
[0014]f)配制約10個柱床體積的預冷的6 %氯化鈉溶液，用MTris-HCl緩沖液調節PH1.2，緩沖液平衡/擴張柱床后，以5-6倍沉積床體積的緩沖液除雜，整個過程控制溫度5°C度以下，流速約為每小時2.5柱床體積。(向上沖洗)。
[0015]g)關掉蠕動泵，使D254樹脂重新沉積，調節活塞至剛好在沉積床的表面，然后以向下的液流和沉積床的狀態進行洗脫。樹脂先用用約4倍柱床體積的pH為8的4%氯化鈉溶液進行洗脫，收集洗脫液。再用約2倍柱床體積的3%氯化鈉溶液(用量先多后少)同法洗脫2次。合并全部洗脫液，調節pH為6 (洗脫)。
[0016]h)按洗脫液體積加入1.0倍量的預冷乙醇，沉淀過夜。次日吸除乙醇。沉淀物用2%氯化鈉溶液溶解，調pH至6.0。按溶液體積加0.7倍乙醇，沉淀過夜。
[0017]i)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用無水乙醇、丙酮洗滌脫水。真空干燥后得精品肝素。
[0018]實施例3
a)豬、牛、羊等哺乳動物的肝、肺等臟器的組織勻漿液30g左右加水至250L，加入NaCI至5%，攪拌、靜置、過濾。
[0019]b)在上述清液中加入0.4%木瓜蛋白酶，在pH8.5，40°C下酶解4小時，升溫98-100°C，10分鐘，趁熱真空抽濾，濾液(I )備用。
[0020]c)取適量強堿性D254干樹脂，在蒸餾水中充分浸泡，溶脹后濾干，加等體積乙醇或丙酮攪拌I小時，用蒸餾水洗凈濾干，加4倍量的2mol/l的鹽酸溶液攪拌2小時，用蒸餾水洗至中性，濾干；加2倍量2mol/l的氫氧化鈉溶液攪拌2小時，蒸餾水洗至中性，濾干；最后用2倍量2mol/l的鹽酸溶液攪拌2小時，水洗至中性。
[0021]d)取10g已處理好的強堿性D254樹脂加入擴張床柱Streamline50 (5cm內徑)、用蠕動泵以每小時2倍柱床體積的流速將pH為8.0的適量MTris-HCl緩沖液(II )自柱床底部泵入，使樹脂擴張并保持平衡。控制溫度40°C (平衡)。
[0022]e)將適量濾液(I )加緩沖液(II )，配置成料液(III)。調整料液(III) NaCI濃度達到3%左右，NaOH調pH至8.0。用蠕動泵將料液(III)通進擴張交換柱中反復進行離子交換，交換過程中保持恒定的PH值，溫度為18°C。流速約為每小時2.5倍柱床體積，直至流出液檢驗無肝素，全部吸附在樹脂上為止(上樣)。
[0023]f)配制10個柱床體積的6%氯化鈉溶液，MTris-HCl緩沖液調節pH3_5，以2?3個沉積床體積的緩沖液平衡/擴張柱床后，以5-6倍沉積床體積的緩沖液除雜，整個過程控制溫度15-25°C，流速約為每小時2.5柱床體積。(向上沖洗，除雜)。
[0024]g)關掉蠕動泵，使D254樹脂重新沉積，調節活塞至剛好在沉積床的表面，然后以向下的液流和沉積床的狀態進行洗脫。樹脂先用用約4倍柱床體積的4%氯化鈉溶液進行洗脫，收集洗脫液。再用約2倍柱床體積的3%氯化鈉溶液(用量先多后少)同法洗脫2次。合并全部洗脫液，調節PH為6(洗脫)。
[0025]h)按洗脫液體積加入1.0倍量的預冷乙醇，沉淀過夜。次日吸除乙醇。沉淀物用2%氯化鈉溶液溶解，調pH至6.0。按溶液體積加0.7倍乙醇，沉淀過夜。
[0026]i)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用無水乙醇、丙酮洗滌脫水。真空干燥后得肝素成品。
【權利要求】
1.一種濃縮純化肝素的生產工藝，其特征在于其工藝步驟如下: (1)粗品制備: a)豬、牛、羊等哺乳動物的小腸粘膜或肝、肺等臟器的組織勻漿液中加入NaCI，攪拌、靜置、過濾； b)在ρΗ7.5-10.5，40-50 °C 下酶解數小時，NaOHi周 pH 至 8.0-10.0，升溫至 50-55。。，保溫2-4h，不斷攪拌，然后快速升溫到92-95°C，保持10-15min，趁熱用80目濾網過濾，得到濾液⑴備用； c)擴張床柱Streamline50裝入已處理好的強堿性陰離子交換樹脂； 控制溫度40-65°C，用蠕動泵調pH為7.5-10.5，適量MTris-HCl緩沖液自柱床底部泵入，使樹脂擴張并保持平衡； 保持pH值不變，將適量濾液⑴加MTris-HCl緩沖液配制成NaCI為2_6%，pH為7.5-10.5的溶液，用蠕動泵通進擴張交換柱中先平衡樹脂，然后反復進行離子交換，流速約為每小時2倍柱床體積，直至流出液檢驗無肝素，全部吸附在樹脂上為止； d)然后配制適量的的2.5-6.5%氯化鈉溶液，MTris-HCl緩沖液調節pH3_5，以2?3個沉積床體積的緩沖液平衡/擴張柱床后，以5-6倍沉積床體積的緩沖液除雜，整個過程控制溫度15-30 0C ； e)關掉蠕動泵，使D254樹脂重新沉積，調節活塞至剛好在沉積床的表面，然后以向下的液流和沉積床的狀態進行洗脫； f)按洗脫液體積加入1.0倍量的預冷乙醇，沉淀過夜； g)次日吸除乙醇； 沉淀物用1.5-2.5%氯化鈉溶液溶解，調pH至6.0 ; 按溶液體積加0.7倍乙醇，沉淀過夜； h)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物； 沉淀物依序用無水乙醇、丙酮洗滌脫水； 真空干燥后得肝素； (2)精品制備: a)將肝素粗品以1: 10的比例溶于3%的氯化鈉溶液中，然后再用2%的氫氧化鈉溶液調PH至7.5-11.5，于室溫靜置數小時，真空抽濾，去沉淀物，濾液待用； b)在上述清液中加入0.05-0.2%胰蛋白酶，在pH7.5-10.5，35_45°C酶解數小時，升溫98-100°C，10-15min，趁熱真空抽濾，濾液備用； c)擴張床柱Streamline50裝入已處理好的強堿性陰離子交換樹脂，用蠕動泵將PH7-10，適量MTris-HCl緩沖液自柱床底部泵入，使樹脂擴張并保持平衡； d)控制溫度40-60°C，將適量濾液加MTris-HCl緩沖液配制pH為7.5-10.5的溶液，用蠕動泵通進擴張交換柱中反復進行離子交換，交換過程中保持PH值與溫度恒定，流速約為每小時2倍柱床體積，直至流出液檢驗無肝素，全部吸附在樹脂上為止； e)然后配制適量的預冷的2.5-6.5%氯化鈉溶液，MTris-HCl緩沖液調節ρΗ1_3，以2?3個沉積床體積的緩沖液平衡/擴張柱床后，以5-6倍沉積床體積的緩沖液除雜，整個過程控制溫度3-6 °C，流速約為每小時2.5柱床體積； f)關掉蠕動泵，使樹脂重新沉積，調節活塞至剛好在沉積床的表面，然后以向下的液流和沉積床的狀態進行洗脫； g)按洗脫液體積加入1.0倍量的預冷乙醇，沉淀過夜； h)次日吸除乙醇； 沉淀物用2%氯化鈉溶液溶解，調pH至6.0 ; i)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物； 沉淀物依序用無水乙醇、丙酮洗滌脫水； 真空干燥后得精品肝素； 如權利要求1所述:擴張柱床離子交換色譜技術的原料為豬、牛、羊等哺乳動物的小腸粘膜、肝、肺臟等臟器和粗品肝素。
2.如權利要求1所述的濃縮純化肝素的生產工藝，其特征在于:步驟(I)中c擴張柱床溫度控制為40-65 °C。
3.如權利要求1所述的濃縮純化肝素的生產工藝，其特征在于:步驟(I)中c擴張柱床Ph 調控在 7.5-10.5。
4.如權利要求1所述的濃縮純化肝素的生產工藝，其特征在于:步驟(I)中d使用的氯化鈉質量百分濃度為2.5-6.5%。
5.如權利要求1所述的濃縮純化肝素的生產工藝，其特征在于:步驟(2)中a氫氧化鈉調節Ph范圍為7.5-11.5。
6.如權利要求1所述的濃縮純化肝素的生產工藝，其特征在于:步驟(2)中c強堿性陰離子交換樹脂作為吸附介質。
7.如權利要求1所述的濃縮純化肝素的生產工藝，其特征在于:步驟(2)中e溫度控制的范圍為3 — 6°C。
【文檔編號】C08B37/10GK104479050SQ201410813643
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月24日 優先權日:2014年12月24日
【發明者】劉乃山, 劉忠凱, 遲培升 申請人:青島九龍生物醫藥有限公司