本發明涉及基因工程和蛋白質表達領域，尤其涉及AuEH2G218S和AuEH2S247Y酶基因的構建，以及該酶的制備和性質研究。
背景技術：
環氧化物水解酶(Epoxidehydrolase,EH，EC,3.3.2.-)又稱環氧化物水合酶或環氧水化酶，是一類催化水分子立體選擇性的加成環氧化物水解為相應1,2-二醇的水解酶類。此類水解酶具有較好的區域選擇性和對映體選擇性，因此成為動力學拆分消旋體環氧化物制備手性環氧化物與二醇的理想生物催化劑。手性環氧化物和鄰二醇是有機合成中重要的手性合成子，是合成現在手性藥物、農業、香料及精細化工等行業各種活性物質的重要中間體。一些手性的環氧化物和二醇已用于β-腎上腺素受體抑制劑、減肥藥、神經藥物、抗癌藥物，殺蟲劑及液晶材料等的生產，具有廣闊的應用前景和市場需求。傳統化學合成法由于其合成產物為消旋體，進行手性拆分尤為困難，常需要用到重金屬元素等有毒物質，不僅面臨著資源和環境巨大的挑戰，且很難獲得高對映體得率的化合物。在化學法和生物法制備手性純環氧化物的方法中，酶動力學拆分法由于其高的對映體選擇受到廣大研究者的重視。EH廣泛存在于植物、昆蟲、哺乳動物及微生物體內，微生物來源的EH具有不依賴輔因子的酶，其來源廣泛，底物譜寬廣，對映體選擇性高等特性，對其研究已成為當前研究的熱點。目前，研究較多的微生物EH主要來自于黑曲霉(Aspergillusniger)、黏紅酵母(Rhodotorulaglutinis)、放射形土壤桿菌(AgrobacteriumradiobacterAD1)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)和芽孢桿菌屬(Bacillussp.)，這些EH對一些特定的底物具有較高的催化活性和高對映體選擇性。近年來，分子生物學技術，如定點突變、飽和突變、錯易PCR和DNAshuffling等也用于改造EH的催化活性、穩定性、對映體選擇性等性質，并通過高通量篩選獲得性質提高的突變酶。基于同源建模，分子對接，動力學模擬等理性設計的宇佐美曲霉(Aspergillususamii)環氧化物水解酶(AuEH2)的分子改造研究未見有報道。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種對映體選擇性不同的AuEH2G218S和AuEH2S247Y酶的設計與構建方法，對宇佐美曲霉(Aspergillususamii)環氧化物水解酶(AuEH2)進行了分子改造。本發明的技術方案：綜合考慮分子對接、同源建模、結合能計算、同源性分析等因素確定宇佐美曲霉AuEH2基因突變位點，設計特異性突變引物，構建突變酶基因Aueh2G218S和Aueh2S247Y，并成功實現其在大腸桿菌中的表達。AuEH2G218S和AuEH2S247Y的cDNA序列及氨基酸序列分別為SEQIDNO:1和SEQIDNO:2，SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。攜帶有宇佐美曲霉AuEH2基因的重組質粒pET-28a(+)-Aueh2由江南大學構建和保藏(專利公開號:CN102994470A)。所述的突變酶的活性測定方法：在2mLEP管中各加入800μL磷酸鉀緩沖液(pH7.0)和100μL稀釋適當超聲破碎粗酶液，在30℃下預溫5min，然后各加入100μL200mM消旋體環氧苯乙烷(SO)立即記時反應10min后。取反應液200μL加入至含有1mL乙酸乙酯(1mM的正戊醇作為內標)萃滅，1000rpm離心2min后，吸取上層有機相加入無水MgSO4干燥后，過0.22μm有機膜，用手性GC色譜柱CP-Chirasil-DexCB測定(S)/(R)-SO濃度。對映體過量率計算公式為ee＝(S-R)×100/(S+R)。計算當ee達到99％時，(S)-SO得率＝殘余(S)-SO濃度×100/初始SO濃度。酶活性單位定義：在本測定條件下，以每分鐘分解1μmolSO所需的酶量定義為1個環氧化物水解酶的活性單位(U)。所述的酶基因的構建和表達的方法：(1)以已知的黑曲霉EH的晶體結構(PDB：1Q07)為模板，同源建模獲得AuEH2的三維結構。(2)用AutoDock4.2軟件將模型底物分子(S)-SO和(R)-SO分別與AuEH2進行分子對接，統計出催化三聯體結合的(S)/(R)-SO分子內的氨基酸，同源性分析排除保守位點氨基酸，根據氨基酸的性質、空間結果及位置等選擇多個點進行同源建模，獲得突變酶的三維結構，并計算AuEH2及突變酶與(S)-SO)和(R)-SO之間的結合能，及親核攻擊191氨基酸Asp上O原子與環氧化物環氧環上未取代C原子距離，綜合以上因素選擇分別將218位甘氨酸突變為絲氨酸、247位絲氨酸突變為酪氨酸。(3)突變酶AuEH2G218S和AuEH2S247Y基因的獲得：基于上面設計的突變位點，設計并合成特異性定點突變引物如下：G218S-F：5′-GCCTGCTATATGTCGAAGCCATCGAGC-3'，S247Y-F：5′-TGCTACCTTTGGCTATGGTTATGCTGT-3'，根據AuEH2基因序列設計并合成上下游引物如下：AuEH2-F：5'-GAATTCATGGCACTCGCTTACAGCAA-3'，含EcoRⅠ酶切位點；AuEH2-R：5'-GCGGCCGCTCATTTTCTACCAGCCCATAC-3'，含NotⅠ酶切位點；先分別以pET-28a(+)-Aueh2為模板，分別以G218S-F和AuEH2-R、S247Y-F和AuEH2-R為引物分別PCR合成大引物B-G218S和B-S247Y。PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析并割膠回收目的條帶。然后以大引物(B-G218S或者B-S247Y)和AuEH2-F以pET-28a(+)-Aueh2為模板進行PCR獲得突變酶基因M-G218S和M-S247Y，將PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T連接(pUCm-T-Aueh2G218S、pUCm-T-Aueh2S247Y)，轉化JM109感受態細胞，經藍白斑篩選選擇正確的重組子送上海生工測序。將測序結果正確的pUCm-T-Aueh2G218S、pUCm-T-Aueh2S247Y與pET-28a(+)質粒均用EcoRⅠ和NotⅠ進行雙酶切，割膠回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pET-28a(+)-Aueh2G218S、pET-28a(+)-Aueh2S247Y，并對重組質粒進行序列測定。(4)E.coliBL21(DE3)/Aueh2G218、E.coliBL21(DE3)/Aueh2S247Y的構建、表達及活性測定：將pET-28a(+)-Aueh2G218S、pET-28a(+)-Aueh2S247Y分別轉化E.coliBL21(DE3)，在含有Kan抗性平板上篩選轉化子。挑去陽性轉化子于2mL含Kan抗性的LB培養基中，37℃振蕩培養過夜，以1％的接種量轉接到30mL相同培養基中，28℃振蕩培養至對數生長中期(OD600為0.6～0.8)，加人0.2mM的IPTG誘導8h。同時以含pET-28a(+)空質粒的E.coliBL21(DE3)為陰性對照。重組表達菌經超聲破碎后測定EH的活性及對映體比率(E)，及(S)-SO對映體過量率ee值。本發明的有益效果：本發明提供了兩種宇佐美曲霉AuEH2G218S和AuEH2S247Y突變酶的設計與構建的方法，新型突變酶工程菌的構建及突變酶的高效表達的方法。突變酶具有高對映體選擇性、高催化效率的優點，有較大應用潛力，也為EH的研究奠定了理論基礎。具體實施方式以下結合具體實施例，進一步闡述本發明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳細說明本發明，而不用于限制本發明的范圍。實施例1突變酶基因及其表達質粒的構建采用大引物PCR技術構造突變酶基因Aueh2G218S和Aueh2S247Y：分別以G218S-F和AuEH2-R、S247Y-F和AuEH2-R為引物、以pET-28a(+)-Aueh2為模板進行PCR(94℃4min；94℃30s，45℃30s，72℃30s，2個循環；94℃30s，55℃30s，72℃30s，28個循環；72℃10min)，PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶得到大引物；以第一輪PCR割膠回收產物和AuEH2-F為引物進行大引物PCR(94℃4min；94℃30s，45℃30s，72℃30s，2個循環；94℃30s，55℃30s，72℃30s，28個循環；72℃10min)，PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并pUCm-T連接(pUCm-T-Aueh2G218S、pUCm-T-Aueh2S247Y)，轉化JM109感受態細胞，經酶切鑒定正確后送上海生工測序。實施例2E.coliBL21(DE3)/Aueh2G218、E.coliBL21(DE3)/Aueh2S247Y的構建、表達及活性測定將pET-28a(+)-Aueh2G218S、pET-28a(+)-Aueh2S247Y分別轉化E.coliBL21(DE3)，在含有Kan抗性平板上篩選轉化子。挑去陽性轉化子于2mL含Kan抗性的LB培養基中，37℃振蕩培養過夜，以1％的接種量轉接到30mL相同培養基中，28℃振蕩培養至對數生長中期(OD600為0.6～0.8)，加人0.2mM的IPTG誘導8h。同時以含pET-28a(+)空質粒的E.coliBL21(DE3)為陰性對照，經SDS-PAGE檢測實現了突變酶在大腸桿菌中的表達。重組表達菌經超聲破碎后，利用突變酶動力學拆分消旋體SO，生產的(S)-SO對映體過量率ee值均大于98％。