一種用于檢測大豆擬莖點種腐病菌的特異性lamp引物組合物及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程領域，涉及一種用于檢測大豆擬莖點種腐病菌的特異性LAMP 引物組合物及其應用。
【背景技術】
[0002] 大豆擬莖點種腐病菌（PhomopsislongicollaHo化S)侵染大豆，引起大豆根腐W 及苗期病害，并且可W導致大豆種子品質降低W，。大豆擬莖點種腐病菌最早在1976年在 美國發現，此后，加拿大、阿根廷、韓國、意大利、南斯拉夫都有報道過據統計，在1994 年，全世界因為該病害導致大豆產量損失高達18. 6萬噸w'5^。因其近年來在國外發生普遍、 經濟影響大、傳入風險高且在我國尚未有發生的報道，被有關專家列為大豆上包括大豆疫 霉在內的7種危險性真菌病害之一 ?。為了阻止大豆擬莖點種腐病菌傳播范圍的不斷擴 大，使大豆擬莖點種腐病菌病得到控制，需要對其進行快速、準確地檢測。
[0003] 環介導等溫擴增法（loop-mediated isothermal amplification, LAMP)，是有日本 的榮研株式會社的Notomi等人于2000年開發的一種新型的核酸擴增方法[7]，其特點是針 對祀基因的6個區域設計4條特異性引物，在鏈置換DNA酶度St DNA polymerase)的作用 下，60~65C恒溫擴增，15~60min即可觀察結果，效率可達IO9~1〇1°個數量級，具有操 作簡單、特異性強、產物易檢測等特點。在DNA合成時，從脫氧核酸H磯酸基質（dNTPs)中析 出的焦磯酸根離子與反應溶液中的鎮離子反應，產生大量焦磯酸鎮沉淀，呈現白色。因此， 可W把渾濁度作為反應的指標，只用肉眼觀察白色渾濁沉淀，就能鑒定擴增與否，而不需要 繁瑣的電泳和紫外觀察。由于LAMP反應不需要PCR儀和昂貴的試劑，反應產物可通過是否 形成白色沉淀（渾濁）或SYBR GREEN I染色后的顏色變化來判斷是否反應。隨著技術的 不斷完善和發展，會在食品檢測臨床疾病診斷等領域有著廣泛的應用前景。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種用于檢測大豆擬莖點種腐病菌的特異性LAMP引物組 合物。
[0005] 本發明的另一目的是提供該特異性LAMP引物組合物的應用。
[0006] 本發明的目的可通過如下技術方案實現：
[0007] -種用于檢測大豆擬莖點種腐病菌的特異性LAMP引物組合物，由W下引物組成： 正向內引物FIP如SEQ ID NO. 2所示，反向內引物BIP如SEQ ID NO. 3所示，正向外引物F3 如沈Q ID NO. 4所示，反向外引物B3如沈Q ID NO. 5所示，正向環引物LF如沈Q ID NO. 6 所示。
[0008] 所述的特異性LAMP引物組合物在制備檢測或鑒定大豆擬莖點種腐病菌的試劑中 的應用。
[0009] -種用于檢測大豆擬莖點種腐病菌的LAMP檢測試劑盒，包含所述的特異性的 LAMP引物組合物。
[0010] 所述的用于檢測大豆擬莖點種腐病菌的LAMP檢測試劑盒，包含；2.5y L 10Xl'hermoI/)lBuffer，8mmol.LiMgS〇4，1.2mmol.LidNTPs，內引 物 FIP 和 BIP 各 1.6 Umol . 夕巧 I物 F3 和B3各0.4 Umol . 環弓 I物LF0. Symol . 0. Smol . Li 甜 菜堿，0. 1% Trion-XJOmmol .LiTris-HCUpH 8. 8) ,IOmmol .L Ikci,IOmmol .LI(NHa)SO" 8U . U L IBst DNA聚合酶及超純水組成的檢測溶液W及SYBR GREEN I染料。
[0011] 一種檢測大豆擬莖點種腐病菌的方法，提取待檢微生物的DNA，W提取的DNA為 模板，利用所述的特異性的LAMP引物組合物進行LAMP反應；擴增產物加入SYBR GREEN I 染料，在常光下檢測結果，如果反應產物在常光下變顯黃色，則表示存在大豆擬莖點種腐病 菌，在常光下顯澄色則表示不含該病菌。
[0012] 所述的檢測大豆擬莖點種腐病菌的方法優選提取待檢微生物的DNA，取3 U IDNA 溶液，加入20. 5 U 1所述的檢測溶液和1. 5 U 1滅菌去離子水進行LAMP反應，LAMP反應程 序為；64°C 60min〇
[0013] 有益效果：
[0014] 本發明在分析大豆擬莖點種腐病菌的檢測祀標序列Tefl-a和其他近似種病菌 在序列上的差異的基礎上，對多個潛在位點設計并篩選了 5條特異性的LAMP引物，目前用 于設計LAMP引物的軟件為Eiken化emical公司開發的PrimerExplorer,雖然利用軟件可 W設計出若干條符合設計參數的引物，但是此軟件還是存在W下的缺陷；（1)缺少引物特 異性檢測的步驟，盡管LAMP引物是由多條引物組成，特異性相對于PCR來說會有很大的提 高，但是缺少了特異性的檢測，會出現誤判，導致實驗結果錯誤；（2)即使特異性符合要求， 在實際的實驗驗證中也會出現某些引物產生假陽性的現象，產生送些假陽性的原因可能是 引物雖然不能形成啞鈴狀反應前體，但是還是可W線性的擴增。為了克服軟件設計的缺陷， 針對符合特異性的引物需要進行人工篩選，送需要很豐富的實驗經驗和理論基礎，送也是 本專利最核必的部分，引物所在祀標的位置圖見圖1。在此基礎上建立了檢測大豆擬莖點種 腐病菌的LAMP反應體系。本發明的檢測體系在LAMP擴增條件下，能快速、高效、高特異、高 靈敏地檢測到大豆擬莖點種腐病菌，具有優異的種間特異性、種內通用性W及靈敏度，能很 好滿足目前對大豆擬莖點種腐病菌的現場檢測的迫切需要，用于田間檢疫、進出口檢疫等 的現場檢測，易于大范圍推廣應用。
【附圖說明】
[0015] 圖ILAMP特異性引物祀標位點，選擇該位點的原因是后期人工篩選時引物的特異 性強，不會產生假陽性，靈敏度高。
[0016] 圖2實施例2大豆擬莖點種腐病菌LAMP引物特異性試驗常光光照射圖
[0017] 其中，1號、2號為大豆擬莖點種腐病菌不同菌株，3號為大豆南方莖潰瘍病菌，4號 為大豆北方莖潰瘍病菌，5號為平頭炭痕菌，6號為稻癌菌，7號為鏈格抱菌，8號為球黑抱 菌，9號為大豆疫霉菌，10號為菜豆殼球抱菌，11號為米曲霉菌，12號為菊池尾抱菌，13號為 油瓶霉菌，14號為了香疫霉菌，15號為3麻疫霉，16號為陰性對照。
[0018] 圖3實施例2大豆擬莖點種腐病菌LAMP引物特異性試驗電泳圖
[0019] 其中，M為MLSOOOMarker, 1號、2號為大豆擬莖點種腐病菌不同菌株，3號為大豆 南方莖潰瘍病菌，4號為大豆北方莖潰瘍病菌，5號為平頭炭痕菌，6號為稻癌菌，7號為鏈格 抱菌，8號為球黑抱菌，9號為大豆疫霉菌，10號為菜豆殼球抱菌，11號為米曲霉菌，12號為 菊池尾抱菌，13號為油瓶霉菌，14號為了香疫霉菌，15號為3麻疫霉，16號為陰性對照。
[0020] 圖4實施例3大豆擬莖點種腐病菌LAMP引物靈敏度試驗常光照射圖 [002。 LAMP擴增不同濃度大豆擬莖點種腐病菌基因組DNA ;從左到右分別為25U L的 反應體系中分別含有lOOng、lOng、Ing、lOOpg、lOpg、Ipg、lOOfg、IOfg大豆擬莖點種腐病菌 DM的LAMP擴增結果。LAMP擴增反應能特異性地識別大豆擬莖點種腐病菌，圖片表示靈敏 度能夠達到Ipg/U L。
[0022] 圖5感病大豆植株LAMP檢測試驗常光照射圖
[0023] 其中1為大豆擬莖點種腐病菌標準菌株基因組，2-7為接種大豆擬莖點種腐病菌 菌株6天后的大豆植株基因組，8為接種空白PDA培養基6天后的大豆植株基因組，9為健 康大豆植株基因組，10為陰性對照。
【具體實施方式】
[0024] 實施例1
[0025] -種用于檢測大豆擬莖點種腐病菌的LAMP檢測試劑盒，包含；2. 5 U L 10Xl'hermoI/)lBuffer，8mmol.LiMgS〇4，1.2mmol.LidNTPs，內引 物 FIP 和 BIP 各 1.6 U mol .Li,夕巧 I物 F3 和B3 各0.4 U mol .Li,環弓 I物LF 0.8 U mol .L 1,0. Smol .Li 甜 菜堿，8U - ULiBst DNA聚合酶，加入超純水制備成檢測溶液。各組分的濃度表示其在檢測 溶液中的終濃度。
[0026] 實施例2大豆擬莖點種腐病菌LAMP引物特異性試驗
[0027] 為了驗證LAMP方法的特異性，選擇大豆擬莖點種腐病菌標準菌株（繳策 46562?)與大豆擬莖點種腐病菌相近種的大豆南方莖潰瘍病菌、大豆北方莖潰瘍病菌，與大 豆擬莖點種腐病菌不同屬的菌（平頭炭痕菌；稻癌菌；鏈格抱菌；球黑抱菌；大豆疫霉菌； 菜豆殼球抱菌；米曲霉菌；菊池尾抱菌；油瓶霉菌；了香疫霉菌；3麻疫霉）的DNA作為模 板，取3 U IDNA溶液，加入20. 5 U 1實施例1所述的檢測溶液和1. 5 U 1滅菌去離子水進行 LAMP反應，反應程序為；64°C 60min ;擴增產物加入SYBR GREEN I染料，在常光下檢測，結 果如圖2所示。結果顯示特異性LAMP引物組合物能特異性地識別大豆擬莖點種腐病菌，含 有大豆擬莖點種腐病菌的樣品（1號和2號管）在常光下變成黃綠色，而其他種（3~15號 管）在常光下為澄色，陰性對照（16號）在常光下也為澄色，反應產物經過2 %瓊脂糖凝膠 電泳，觀察擴增的條帶，結果見圖3,只有1號和2號管出現典型的梯形條帶，表明進1號和 2號管存在大豆擬莖點種腐病菌，結果表明W SYBR green I為染料的顯色反應可作為檢測 陽性和陰性的判別標準，并可縮短檢測所需的時間。
[002引實施例3大豆擬莖點種腐病菌LAMP引物靈敏度試驗
[0029] 為了確定LAMP檢測方法的靈敏度，將提取的標準大豆擬莖點種腐病菌菌株DNA用 分光光度計測定濃度（1 U g/ U 1)后用DEPC水進行10倍比稀釋，-7(TC保存作為模板。分 別取10倍比稀釋后的各濃度DNA稀釋液3 U 1作為模板，加入20. 5 U 1實施例1所述的檢測 溶液和1. 5 U 1滅菌去離子水進行LAMP反應，反應程序為；64°C 60min ;擴增產物加入SYBR GREEN I染料，在常光下檢測，結果如圖4所示，1~6管在常光下變成黃綠色，表明本發明 方法的靈敏度為ipg/y L。
[0030] 實施例4感病大豆植株LAMP檢測試驗
[0031] 用化OH堿裂解法提取6株接種大豆擬莖點種腐病菌6天后的大豆植株的DNA，將 其作為模板用于LAMP擴增，將大豆擬莖點種腐病菌標準菌株DNA作為陽性對照，健康植株 DNA和滅菌水取代DNA擴增作為陰性對照。取3ULDNA溶液，加入20. 5 U 1實施例1所述的 檢測溶液和1. 5 U 1滅菌去離子水進行LAMP反應，反應程序為；64°C 60min。擴增產物加入 SYBRGREEN I染料，在常光下檢測，結果如圖5所示，顯示本方法能夠從接種大豆擬莖點種 腐病菌的大豆植株（2~7號管）在常光下變成黃綠色，能夠特異性地檢測出大豆擬莖點種 腐病菌，效果和直接檢測大豆南方莖潰瘍病菌DNA (1號管）沒有差別，而接種空白PDA培養 基6天后的大豆植株（8號管）、健康植株巧號管）和陰性對照滅菌水（10號管）則在常光 下變成澄色，可見本方法可W用于田間檢測（圖5)。
[00礎 參考文獻
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【主權項】
1. 一種用于檢測大豆擬莖點種腐病菌的特異性LAMP引物組合物，其特征在于有以下 引物組成：正向內引物FIP如SEQ ID NO. 2所示，反向內引物BIP如SEQ ID NO. 3所示，正 向外引物F3如SEQ ID NO. 4所示，反向外引物B3如SEQ ID NO. 5所示，正向環引物LF如 SEQ ID NO. 6 所示。2. 權利要求1所述的特異性LAMP弓|物組合物在制備檢測或鑒定大豆擬莖點種腐病菌 的試劑中的應用。3. -種用于檢測大豆擬莖點種腐病菌的LAMP檢測試劑盒，其特征在于包含權利要求1 所述的特異性LAMP引物組合物。4. 根據權利要求3所述的用于檢測大豆擬莖點種腐病菌的LAMP檢測試劑盒，其特征在 于所述的試劑盒包含：2.5yL 10XThermoPolBuffer，8mmol ?I^MgSOpUmmol .LMNTPs， 內引物FIP和BIP各L 6 μ mol · L /外引物F3和B3各0· 4 μ mol · L /環引物LF 0· 8 μ mol · L / 0· 8mol · L 1甜菜堿，8U · μ L Ast DNA聚合酶，及滅菌去離子水組成的檢測 溶液以及SYBR GREEN I染料。5. -種檢測大豆擬莖點種腐病菌的方法，其特征在于提取待檢微生物的DNA，以提取 的DNA為模板，利用權利要求1所述的特異性的LAMP引物組合物進行LAMP擴增反應；擴增 產物加入SYBR GREEN I染料，在常光下檢測結果，如果反應產物在常光下變成黃綠色，則 表示存在大豆擬莖點種腐病菌，在常光下顯橙色則表示不含該病菌。6. 根據權利要求5所述的檢測大豆擬莖點種腐病菌的方法，其特征在于提取待檢微生 物的DNA，取3 μ 1 DNA溶液，加入20. 5 μ 1權利要求4所述的檢測溶液和1. 5 μ 1滅菌去離 子水進行LAMP反應，反應程序為：64°C 60min。
【專利摘要】本發明屬于基因工程領域，公開了一種用于檢測大豆擬莖點種腐病菌的特異性LAMP引物組合物及其應用。大豆擬莖點種腐病菌的檢測靶標序列Tef-α，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，該靶標序列特異性的LAMP引物組合物，正向內引物FIP如SEQ ID NO.2所示，反向內引物BIP如SEQ ID NO.3所示，正向外引物F3如SEQ ID NO.4所示，反向外引物B3如SEQ ID NO.5所示，正向環引物LF如SEQ ID NO.6所示。本發明的檢測體系在LAMP擴增條件下，能快速、高效、高特異、高靈敏地檢測到大豆擬莖點種腐病菌，用于田間檢疫、進出口檢疫等的現場檢測，易于大范圍推廣應用。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68, C12R1/645, C12Q1/04
【公開號】CN105713960
【申請號】CN201410720592
【發明人】鄭小波, 沈浩, 王源超, 張海峰
【申請人】南京農業大學