溫度和糖雙重敏感的水凝膠基材的制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了3-丙烯酰胺基苯硼酸AAPBA在制備細胞片獲取基材中的應用，提供了一種雙重敏感水凝膠基材制備方法，步驟簡單易行，無需大型設備，反應平穩，不污染環境，在臨床治療上有很高的應用前景和實用價值。按照本發明制備方法制得的雙重敏感水凝膠細胞片獲取基材與傳統的細胞片獲取方法相比，具有很好的生物相容性的，不會殘留有害物質，同時能使獲得的細胞片層保持較高的活性。
【專利說明】溫度和糖雙重敏感的水凝膠基材的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種材料工程【技術領域】，特別涉及無支架材料組織工程領域，具體涉及一種細胞片獲取基材及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]細胞片技術是指將細胞在特殊基材上培養，在獲取的過程中不使用任何蛋白水解酶，可生成具有完整的細胞外間質與細胞間連接的無損細胞片的技術。應用此技術可獲得同種細胞單層，同種細胞多層及不同種細胞多層細胞片，目前已用于修復角膜、食管、牙周韌帶等單層組織，構建心肌組織，重建肝小葉、腎小球和血管等組織，在臨床治療領域有著廣泛的應用前景。
[0003]在傳統的細胞片技術中，研究最多的是聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)溫度敏感材料。因其無需使用胰蛋白酶，只需通過溫度變化調節表面親水與疏水性轉變就可實現細胞在其表面的自主貼附與自行分離，被廣泛用于低損傷或無損傷細胞片層的獲取，在細胞治療技術、再生醫學，特別是無支架材料的組織工程領域顯示出極大的潛力。然而，溫度誘導的細胞脫附通常需要將細胞在20°C甚至更低的溫度下孵育約30分鐘或者更長的時間，有報道證明，當溫度低于32°C時細胞的新陳代謝過程將會受到抑制，獲得的細胞片的細胞活性因此可能會隨之降低，同時可能會降低后續的臨床治療效率。
[0004]近年來，除了溫度敏感材料，其他多種智能材料如電敏感材料、磁性材料、pH以及光敏感性材料等也被成功用于低損傷或無損傷的收獲細胞及細胞片層。這些新的智能材料極大地豐富了低損傷或無損傷細胞片層的獲取手段，對細胞片組織工程的發展具有極大的推動作用。然而，由此類智能材料構建的細胞培養基材均存在各自的不足，如:通過電敏感或磁性的細胞培養基材收獲細胞或細胞片層不可避免地會使得培養基材中的化學物質殘留在所收獲的細胞中，這將對后續的應用產生不可預知的影響；采用PH值敏感性材料收獲細胞將則導致局部生理PH的偏差，會對細胞的活性造成損傷；光敏感性材料目前均是基于紫外光的誘導，同樣會損傷收獲的細胞。
[0005]開發和使用更多新穎的智能材料，對豐富細胞片收獲方式以及克服當前存在的問題均有極大的實際應用價值，本發明由此而來。
【發明內容】
[0006]本發明所要解決的第一方面的問題在于克服現有技術中的不足，提供3-丙烯酰胺基苯硼酸AAPBA在制備細胞片獲取基材中的應用。
[0007]為了解決上述技術問題，本發明提供的第一方面的技術方案:3_丙烯酰胺基苯硼酸AAPBA在無支架材料組織工程中的應用。
[0008]優選地，3-丙烯酰胺基苯硼酸AAPBA在制備細胞片獲取基材中的應用。
[0009]優選地，所述制備細胞片獲取基材的方法，其包括如下步驟:
[0010]S1.稱取適量N，N-亞甲基雙丙烯酰胺MBA和少量細胞粘附肽Ac-RGD分別溶于水中，在MBA水溶液中通入氬氣，然后將Ac-RGD的水溶液快速加入到N，N-亞甲基雙丙烯酰胺MBA的水溶液，并加入少量連二亞硫酸鈉水溶液，磁子攪拌反應；
[0011]S2.將AAPBA溶于NaOH水溶液中，然后將溫度敏感性單體NIPAAm、輔助單體丙烯酰胺AAm、另一部分交聯劑N，N-亞甲基雙丙烯酰胺MBA溶于前述NaOH水溶液中并混合均勻；
[0012]S3.將步驟(I)制得的溶液和(2)制得的兩種溶液混合并通氬氣，然后加入氧化還原引發劑APS/TEMED，混合均勻后澆鑄到兩層玻璃板之間，靜置反應。
[0013]3-丙烯酰胺基苯硼酸AAPBA是一種含有苯硼酸基團和雙鍵的單體化合物。其中，硼酸基團是生物相容性的官能團，有著較低的細胞毒性和免疫原性，在水相中可與順式二醇動態結合形成硼酸酯，同樣，苯硼酸基團在弱堿性條件下也可以和含有多羥基的化合物(糖類)形成穩定的復合體系，因此苯硼酸衍生物是具有糖響應性的化合物。同時，AAPBA帶有的雙鍵可參與交聯反應，在其堿性水溶液中通過氧化還原反應引發可與溫度敏感性單體N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)交聯反應形成水凝膠。
[0014]本發明的第二方面所要解決的問題在于提供一種溫度和糖雙重敏感水凝膠基材的制備方法，其包括如下步驟:
[0015]S1.稱取適量N，N-亞甲基雙丙烯酰胺MBA和少量細胞粘附肽Ac-RGD分別溶于水中，在MBA水溶液中通入氬氣，然后將Ac-RGD的水溶液快速加入到N，N-亞甲基雙丙烯酰胺MBA的水溶液，并加入少量連二亞硫酸鈉水溶液，磁子攪拌反應；
[0016]S2.將AAPBA溶于NaOH水溶液中，然后將溫度敏感性單體NIPAAm、輔助單體丙烯酰胺AAm、另一部分交聯劑N，N-亞甲基雙丙烯酰胺MBA溶于前述NaOH水溶液中并混合均勻；
[0017]S3.將步驟(I)制得的溶液和(2)制得的兩種溶液混合并通氬氣，然后加入氧化還原引發劑APS/TEMED，混合均勻后澆鑄到兩層玻璃板之間，靜置反應。
[0018]優選地,步驟SI中,其中Ac-RGD是序列為Ac-Arg-Gly-Asp-Cys的短肽,且Ac-RGD與MBA的摩爾比為1:10。
[0019]優選地，所述方法中各反應組分最終摩爾比為
[0020]NIPAAm: AAPBA: AAm: MBA: Ac-RGD = 2:0.1:0.6:0.1:0.005。
[0021]優選地，步驟SI中，Ac-RGD與MBA在室溫下反應6h，后置于_4°C保存。
[0022]優選地，步驟S3中，所述引發劑的使用量為5mg APS,5yL TEMED0
[0023]本發明的第三方面所要解決的問題在于提供上述制備方法得到的溫度和糖雙重敏感水凝膠基材。
[0024]所述雙重敏感水凝膠基材為片狀，透明性好，厚度為0.75mm。
[0025]本發明的第四方面在于提供一種溫度和糖雙重敏感水凝膠基材在無支架材料組織工程中的應用。
[0026]優選地，所述無支架材料組織工程為細胞片工程。
[0027]所述溫度和糖雙重敏感水凝膠基材在細胞片工程的實施步驟如下:
[0028]S4.將步驟S3制得的雙重敏感水凝膠置于PBS溶液中浸泡除去殘留單體和堿；
[0029]S5.將含有種子細胞的細胞懸液加入到步驟S4得到的水凝膠片層上，置于37°C培養箱培養至細胞生長成為連續的細胞片；
[0030]S6.將原來的培養基吸凈，加入含一定濃度糖的或溫度降低的新鮮培養基，置于倒置顯微鏡下觀察細胞片的脫附。
[0031]AAPBA經過合成與提純之后，可與NIPAAm等其他組分交聯反應制備雙重敏感水凝膠。細胞實驗表明，本發明制得的雙重敏感凝膠基材對細胞有非常好的相容性，同時制備的水凝膠透明性好，可以滿足細胞培養與細胞片獲取的需求，達到減少溫度的降低幅度、克服由溫度降低引起細胞活性降低的目的。
[0032]與現有技術相比，本發明具有如下有益效果:
[0033]本發明公開了 3-丙烯酰胺基苯硼酸(AAPBA在制備細胞片獲取基材中的應用，提供了一種雙重敏感水凝膠基材制備方法，步驟簡單易行，無需大型設備，反應平穩，不污染環境，在臨床治療上有很高的應用前景和實用價值。按照本發明制備方法制得的雙重敏感水凝膠細胞片獲取基材與傳統的細胞片獲取方法相比，具有很好的生物相容性的，不會殘留有害物質，同時能使獲得的細胞片層保持較高的活性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0034]圖1為實施例1雙重敏感水凝膠基材于不同溫度和糖濃度條件下的照片；
[0035]圖2為實施例2雙重敏感水凝膠基材的細胞培養細胞活力檢測結果圖(其中，圖(a)和圖(C)的水凝膠基材不含Ac-RGD，圖(b)和圖(d)的水凝膠基材含Ac-RGD，圖(a)和圖(b)為FITC-鬼筆環肽和DAPI的細胞染色圖)；
[0036]圖3為細胞片于雙重敏感水凝膠基材表面脫附圖(恒溫為37°C，更換含10g/L果糖培養基之后細胞片的脫附圖)；
[0037]圖4為細胞片于雙重敏感水凝膠基材表面脫附圖(變溫為20°C，更換含10g/L果糖培養基之后細胞片的脫附圖)。
【具體實施方式】
[0038]以下結合附圖1作進一步描述:
[0039]下面結合具體實施例對本發明作進一步的解釋說明，但具體實施例并不對本發明作任何限定。除非特別說明，實施例中所涉及的試劑、方法均為本領域常用的試劑和方法。
[0040]其中，3-丙烯酰胺基苯硼酸AAPBA，N，N-亞甲基雙丙烯酰胺MBA為普通市售產品，Ac-RGD由蘇州強耀生物科技有限公司合成。
[0041]實施例1雙重敏感水凝膠基材的制備
[0042]首先制備Ac-RGD/MBA水溶液，將125mg MBA溶于5mL去離子水中并通氬氣5min，40mg Ac-RGD溶于40 μ L去離子水中，將Ac-RGD的水溶液加入MBA水溶液中，再滴加5滴100mg/mL連二亞硫酸鈉水溶液，密封后置于室溫下反應6h后轉移至_4°C冰箱中備用。然后稱取 AAPBA 19mg 溶于 0.875mL 的 8mg/mL NaOH 水溶液中，稱取 225mg NIPAAm, 42mg AAm,8mg MBA溶于2mL去離子水中。取一只潔凈離心管，在其中加入上述AAPBA NaOH水溶液，NIPAAm/AAm/MBA水溶液和383 μ L Ac-RGD/MBA水溶液，混合均勻，通氬氣5min，然后依次加Λ 100 μ L的50 μ L/mL TEMED水溶液和100 μ L 50mg/mL APS水溶液，快速攪拌均勻后加入到制膠專用的兩塊玻璃板中間，兩層玻璃板間距為0.75mm，置于37°C下反應2h。之后將水凝膠片切成直徑為1.4cm的圓片，產品如圖1所示。
[0043]實施例2雙重敏感水凝膠基材用于細胞培養、貼附性能和活性檢測
[0044]將實施例1所得的圓形水凝膠片泡在PBS溶液中，首先恒溫于37°C中2h，吸掉原來的PBS換為新鮮的PBS，然后置于20°C下恒溫2h，之后再轉入37°C中，重復前面的步驟反復洗滌水凝膠片，每天洗3次。2天以后將水凝膠片轉入24孔培養板中，加入0.5mL PBS,強紫外滅菌15min。同時制備了不含Ac-RGD的雙重敏感水凝膠作為陰性對照組。將濃度為5*14CelVmL的MC3T3-E1細胞懸液按每孔ImL接種到培養板中的水凝膠片上，放入37°C的5% C02培養箱中培養。使用的培養基為含有10% FBS的LG-DMEM。為了檢測細胞貼附性能和活性，6h后進行細胞骨架和細胞核的染色。首先用PBS溶液清洗細胞3次，每次5min，然后用4%多聚甲醛固定15min，再用PBS溶液清洗細胞3次，每次5min，之后用0.1 % TritonX-100/PBS室溫破膜5min，PBS清洗細胞3次，每次5min，然后加入含有濃度均為5 μ g/mL的FITC-鬼筆環肽和DAPI的PBS溶液染色20min，錫箔紙包覆避光，然后用PBS清洗細胞3次，每次20min，清洗過程中用錫箔紙包覆避光。然后置于熒光顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。結果如圖2所示。
[0045]結果表明，加入Ac-RGD的雙重敏感水凝膠利于細胞貼附，水凝膠上的細胞形態良好，而陰性對照組雙重敏感水凝膠上的細胞呈圓形，基本不貼附。因此，本發明提供的雙重敏感水凝膠可用于細胞培養。
[0046]實施例3雙重敏感水凝膠基材用于細胞片獲取
[0047]按照實施例2中的細胞接種方法，于水凝膠表面接種MC3T3-E1細胞，細胞3天之后長成連續的細胞片。分別配制含有10g/L果糖或葡萄糖的DMEM培養基，將含糖培養基分為兩組，設置不同的溫度以考察水凝膠的溫度敏感性對于細胞片脫附的影響，一組恒溫于370C，另一組恒溫于20°C。將長滿細胞的水凝膠片上的LG-DMEM吸掉，加入溫度為37°C或者20°C的含有10g/L果糖或葡萄糖的DMEM培養基，將培養板置于倒置顯微鏡下觀察細胞片的脫附情況并連續拍照記錄。結果如圖3所示。
[0048]結果表明，在一定范圍內降低溫度或者在培養基中添加糖(果糖和葡萄糖)能夠有效促進細胞片的脫附，而且，當兩種因素同時作用時，細胞片脫附速度更快，脫附率更高。
[0049]當然，上述實施例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在于讓人們能夠了解本發明的內容并據以實施，并不能以此限制本發明的保護范圍。凡根據本發明主要技術方案的精神實質所做的等效變換或修飾，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.3-丙烯酰胺基苯硼酸AAPBA在無支架材料組織工程中的應用。
2.根據權利要求1所述的用途，其特征在于，3-丙烯酰胺基苯硼酸AAPBA在制備細胞片獲取基材中的應用。
3.一種溫度和糖雙重敏感水凝膠基材的制備方法，其包括如下步驟: .51.稱取適量N，N-亞甲基雙丙烯酰胺MBA和少量細胞粘附肽Ac-R⑶分別溶于水中，在MBA水溶液中通入氬氣，然后將Ac-RGD的水溶液快速加入到N，N-亞甲基雙丙烯酰胺MBA的水溶液，并加入少量連二亞硫酸鈉水溶液，磁子攪拌反應； . 52.將AAPBA溶于NaOH水溶液中，然后將溫度敏感性單體NIPAAm、輔助單體丙烯酰胺AAm、另一部分交聯劑N，N-亞甲基雙丙烯酰胺MBA溶于前述NaOH水溶液中并混合均勻； . 53.將步驟(I)制得的溶液和(2)制得的兩種溶液混合并通氬氣，然后加入氧化還原引發劑APS/TEMED，混合均勻后澆鑄到兩層玻璃板之間，靜置反應。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟SI中，所述其中Ac-RGD是序列為 Ac-Arg-Gly-Asp-Cys 的短肽。
5.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述各反應組分最終摩爾比為NIPAAm:AAPBA:AAm: MBA:Ac-RGD = 2:0.1:0.6:0.1:0.005。
6.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟SI中，Ac-RGD與MBA在室溫下反應6h,后置于-4°C保存。
7.一種根據權利要求3的制備方法而制備得到的溫度和糖雙重敏感水凝膠基材。
8.一種溫度和糖雙重敏感水凝膠基材在無支架材料組織工程中的應用。
9.根據權利要求8所述的用途，其特征在于，所述無支架材料組織工程為細胞片工程。
10.根據權利要求9所述的用途，其特征在于，所述溫度和糖雙重敏感水凝膠基材在細胞片工程中的實施步驟如下: .54.將雙重敏感水凝膠置于PBS溶液中浸泡除去殘留單體和堿； . 55.將含有種子細胞的細胞懸液加入到步驟S4得到的水凝膠片層上，置于37°C培養箱培養至細胞生長成為連續的細胞片； . 56.將原來的培養基吸凈，加入含一定濃度糖的或溫度降低的新鮮培養基，置于倒置顯微鏡下觀察細胞片的脫附。
【文檔編號】C08F220/56GK104328083SQ201410659518
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月18日 優先權日:2014年11月18日
【發明者】潘國慶, 郭兵兵, 李斌, 朱彩虹 申請人:蘇州大學