一種高得率的灰樹花多糖的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種高得率的灰樹花多糖的制備方法，通過合適的酶解、醇沉技術、利用聚合物/無機鹽雙水相體系、大孔吸附樹脂除雜、超濾膜進行過濾等步驟來提高灰樹花多糖的提取率，將經過本發明提取的灰樹花多糖含量與微波輔助萃取得到的灰樹花含量進行對比，灰樹花多糖含量平均增加18％。
【專利說明】
一種高得率的灰樹花多糖的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于食用菌有效成份提取分離【技術領域】，具體而言，涉及高得率的灰樹花多糖的制備方法。
【背景技術】
[0002]灰樹花其主要活性成份是灰樹花蛋白多糖，多糖組份中以葡聚糖為主，以具有β-α —6)分支的β-α —3)葡聚糖為基本結構，含少量的木糖和甘露糖。研究結果表明，灰樹花多糖主要通過增強細胞免疫功能而發揮其抗腫瘤作用，在基因水平上，本品有較強的抗化學誘變作用，可用于慢性乙型肝炎及惡性腫瘤放化療后乏力、白細胞減少、免疫功能降低的綜合治療，并且對艾滋病的預防有一定作用。臨床上灰樹花多糖口服有效，安全無毒。灰樹花多糖具有抗腫瘤、抗高血壓、降低血糖、抗肥胖、抗肝炎的藥效。據美國一些癌癥專門治療醫院臨場實驗表明，在化學治療癌癥的同時，用灰樹花多糖抑制癌細胞比單純化療更見效果。日本醫學專家用灰樹花多糖進行抗腫瘤體內試驗，結果表明，灰樹花多糖抑制率可達86.5%，比國際認證的抗癌新藥香菇多糖抑制率高出32%。
[0003]灰樹花多糖是從優質灰樹花子實體中提取的有效活性成分，其氣味芳香，功效顯著，可做各類保健品、食品的添加原料。
[0004]雙水相萃取技術始于20世紀60年代，由于雙水相萃取條件溫和，容易放大，可連續操作，因此該技術已成功地應用于蛋白質、核酸和病毒等生物產品的分離和純化，也有抗生素，中藥有效成份等小分子分離方面的嘗試，利用聚合物/無機鹽雙水相體系來提取灰樹花多糖還沒見報道。
【發明內容】
[0005]本發明主要解決的技術問題是提供一種提取灰樹花多糖的方法，通過合適的酶解、醇沉技術、利用聚合物/無機鹽雙水相體系、大孔吸附樹脂除雜、超濾膜進行過濾等步驟來提高灰樹花多糖的提取率，為此本發明采用的一個技術方案是:
[0006]一種高得率的灰樹花多糖的制備方法，包括以下步驟:
[0007](I)將灰樹花子實體晾干至水分含量為10?20%，然后進行粉碎處理，得到200?300目的灰樹花粉，與蒸餾水按1:30-50的重量比混合成混合液后，備用；
[0008](2)酶解處理:取占混合液重量0.05-0.2%的纖維素酶加入混合液中，調解pH值至4-6，振蕩或攪拌下于45-55°C酶解30-90分鐘；
[0009](3)將灰樹花粉進行微波輔助熱水提取，所述的微波功率為500-700W，提取時間為3-5分鐘；然后繼續進行超聲波輔助熱水提取，其超聲溫度20-60°C，功率為600-800W，超聲時間為20-60min ;然后將所得的灰樹花水提液冷卻至室溫，離心分離得上清液和灰樹花殘渣，
[0010](4)醇沉多糖:將步驟(3)所得上清液減壓濃縮，加入2-4倍體積的無水乙醇進行醇沉后，離心，冷凍高燥后得灰樹花粗多糖；
[0011](5)雙水相萃取:將灰樹花粗多糖溶于水，得粗多糖溶液，加入聚合物/無機鹽雙水相體系中，在溫度30-50°C、pH 4-7的條件下震蕩30-50分鐘，震蕩速度為100-200r.mirT1,然后靜置20-40分鐘分層；所述的聚合物為聚乙二醇，無機鹽為磷酸鉀；所述的聚乙二醇濃度為10-20%，磷酸鉀的濃度15-25% ；
[0012](6)取出富含無機鹽的下層，采用大孔吸附樹脂以l_4BV/h的流速對所得灰樹花粗多糖以3-10倍柱體積水進行洗脫除雜，洗脫流速為0.5-5BV/h，之后，調節pH值范圍為6.5-8，采用陰陽離子交換樹脂串聯樹脂柱脫蛋白處理；所述的陰離子交換樹脂與陽離子樹脂的質量比為1:1?5。
[0013](7)用截留量為8000的超濾膜除鹽，截留分子量范圍為100000-800000D，
[0014]工作壓力為0.5-0.7Mpa，溫度為35_50°C，轉子的轉速為400_600r/min，收集截留濃縮液，并用蒸餾水清洗，合并洗液與濃縮液，干燥，得到灰樹花多糖。
[0015]本發明的有益效果是:
[0016]本發明的灰樹花粗多糖提取率較高，并且較純凈。
【具體實施方式】
[0017]下面對本發明的較佳實施例進行詳細闡述，以使本發明的優點和特征能更易于被本領域技術人員理解，從而對本發明的保護范圍做出更為清楚明確的界定。
[0018]實施例1
[0019](I)將灰樹花子實體晾干至水分含量為10%，然后進行粉碎處理，得到300目的灰樹花粉，與蒸餾水按1:30的重量比混合成混合液后，備用；
[0020](2)酶解處理:取占混合液重量0.05 %的纖維素酶加入混合液中，調解pH值至4，振蕩或攪拌下于45°C酶解90分鐘；
[0021 ] (3)將灰樹花粉進行微波輔助熱水提取，所述的微波功率為500W，提取時間為5分鐘；然后繼續進行超聲波輔助熱水提取，其超聲溫度20°C，功率為800W，超聲時間為20min ；然后將所得的灰樹花水提液冷卻至室溫，離心分離得上清液和灰樹花殘渣，
[0022](4)醇沉多糖:將步驟(3)所得上清液減壓濃縮，加入2倍體積的無水乙醇進行醇沉后，離心，冷凍高燥后得灰樹花粗多糖；
[0023](5)雙水相萃取:將灰樹花粗多糖溶于水，得粗多糖溶液，加入聚合物/無機鹽雙水相體系中，在溫度30°C、pH 7的條件下震蕩50分鐘，震蕩速度為200r.mirT1，然后靜置20分鐘分層；所述的聚合物為聚乙二醇，無機鹽為磷酸鉀；所述的聚乙二醇濃度為10%，磷酸鉀的濃度25% ；
[0024](6)取出富含無機鹽的下層，采用大孔吸附樹脂以lBV/h的流速對所得灰樹花粗多糖以3倍柱體積水進行洗脫除雜，洗脫流速為0.5BV/h，之后，調節pH值范圍為6.5，采用陰陽離子交換樹脂串聯樹脂柱脫蛋白處理；所述的陰離子交換樹脂與陽離子樹脂的質量比為 1:1。
[0025](7)用截留量為8000的超濾膜除鹽，截留分子量范圍為100000-800000D，
[0026]工作壓力為0.5Mpa，溫度為35°C，轉子的轉速為400r/min，收集截留濃縮液，并用蒸餾水清洗，合并洗液與濃縮液，干燥，得到灰樹花多糖。
[0027]實施例2
[0028](I)將灰樹花子實體晾干至水分含量為15%，然后進行粉碎處理，得到300目的灰樹花粉，與蒸餾水按1:30的重量比混合成混合液后，備用；
[0029](2)酶解處理:取占混合液重量0.1 %的纖維素酶加入混合液中，調解pH值至5，振蕩或攪拌下于50°C酶解60分鐘；
[0030](3)將灰樹花粉進行微波輔助熱水提取，所述的微波功率為600W，提取時間為4分鐘；然后繼續進行超聲波輔助熱水提取，其超聲溫度40°C，功率為700W，超聲時間為40min ；然后將所得的灰樹花水提液冷卻至室溫，離心分離得上清液和灰樹花殘渣，
[0031](4)醇沉多糖:將步驟(3)所得上清液減壓濃縮，加入3倍體積的無水乙醇進行醇沉后，離心，冷凍高燥后得灰樹花粗多糖；
[0032](5)雙水相萃取:將灰樹花粗多糖溶于水，得粗多糖溶液，加入聚合物/無機鹽雙水相體系中，在溫度40°C、pH為5.5的條件下震蕩40分鐘，震蕩速度為150r 然后靜置30分鐘分層；所述的聚合物為聚乙二醇，無機鹽為磷酸鉀；所述的聚乙二醇濃度為15%，磷酸鉀的濃度20% ；
[0033](6)取出富含無機鹽的下層，采用大孔吸附樹脂以3BV/h的流速對所得灰樹花粗多糖以6倍柱體積水進行洗脫除雜，洗脫流速為2BV/h，之后，調節pH值為7，采用陰陽離子交換樹脂串聯樹脂柱脫蛋白處理；所述的陰離子交換樹脂與陽離子樹脂的質量比為1:3。
[0034](7)用截留量為8000的超濾膜除鹽，截留分子量范圍為100000-800000D，
[0035]工作壓力為0.6Mpa，溫度為40°C，轉子的轉速為500r/min，收集截留濃縮液，并用蒸餾水清洗，合并洗液與濃縮液，干燥，得到灰樹花多糖。
[0036]實施例3
[0037](I)將灰樹花子實體晾干至水分含量為20%，然后進行粉碎處理，得到200目的灰樹花粉，與蒸餾水按1:50的重量比混合成混合液后，備用；
[0038](2)酶解處理:取占混合液重量0.2%的纖維素酶加入混合液中，調解pH值至6，振蕩或攪拌下于55°C酶解30分鐘；
[0039](3)將灰樹花粉進行微波輔助熱水提取，所述的微波功率為700W，提取時間為3分鐘；然后繼續進行超聲波輔助熱水提取，其超聲溫度60°C，功率為600W，超聲時間為60min ；然后將所得的灰樹花水提液冷卻至室溫，離心分離得上清液和灰樹花殘渣，
[0040](4)醇沉多糖:將步驟(3)所得上清液減壓濃縮，加入4倍體積的無水乙醇進行醇沉后，離心，冷凍高燥后得灰樹花粗多糖；
[0041](5)雙水相萃取:將灰樹花粗多糖溶于水，得粗多糖溶液，加入聚合物/無機鹽雙水相體系中，在溫度50°C、pH 4的條件下震蕩50分鐘，震蕩速度為200r.min-1，然后靜置20分鐘分層；所述的聚合物為聚乙二醇，無機鹽為磷酸鉀；所述的聚乙二醇濃度為20%，磷酸鉀的濃度15% ;
[0042](6)取出富含無機鹽的下層，采用大孔吸附樹脂以4BV/h的流速對所得灰樹花粗多糖以10倍柱體積水進行洗脫除雜，洗脫流速為5BV/h，之后，調節pH值范圍為8，采用陰陽離子交換樹脂串聯樹脂柱脫蛋白處理；所述的陰離子交換樹脂與陽離子樹脂的質量比為1:5。
[0043](7)用截留量為8000的超濾膜除鹽，截留分子量范圍為100000-800000D，
[0044]工作壓力為0.7Mpa，溫度為35°C，轉子的轉速為600r/min，收集截留濃縮液，并用蒸餾水清洗，合并洗液與濃縮液，干燥，得到灰樹花多糖。
[0045]將經過本發明提取的灰樹花多糖含量與單純用微波輔助提取灰樹花多糖得到的灰樹花多糖含量進行對比，灰樹花多糖含量平均增加18%。
[0046]以上所述僅為本發明的實施例，并非因此限制本發明的專利范圍，凡是利用本發明說明書內容所作的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關的【技術領域】，均同理包括在本發明的專利保護范圍內。
【權利要求】
1.一種高得率的灰樹花多糖的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將灰樹花子實體晾干至水分含量為10?20%，然后進行粉碎處理，得到200?300目的灰樹花粉，與蒸餾水按1:30-50的重量比混合成混合液后，備用； (2)酶解處理:取占混合液重量0.05-0.2%的纖維素酶加入混合液中，調解pH值至.4-6，振蕩或攪拌下于45-55°C酶解30-90分鐘； (3)將灰樹花粉進行微波輔助熱水提取，所述的微波功率為500-700W，提取時間為3-5分鐘；然后繼續進行超聲波輔助熱水提取，其超聲溫度20-60°C，功率為600-800W，超聲時間為20-60min ;然后將所得的灰樹花水提液冷卻至室溫，離心分離得上清液和灰樹花殘渣； (4)醇沉多糖:將步驟(3)所得上清液減壓濃縮，加入2-4倍體積的無水乙醇進行醇沉后，離心，冷凍高燥后得灰樹花粗多糖； (5)雙水相萃取:將灰樹花粗多糖溶于水，得粗多糖溶液，加入聚合物/無機鹽雙水相體系中，在溫度30-50°C、pH 4-7的條件下震蕩30-50分鐘，震蕩速度為100_200r.mirT1，然后靜置20-40分鐘分層；所述的聚合物為聚乙二醇，無機鹽為磷酸鉀；所述的聚乙二醇濃度為10-20%，磷酸鉀的濃度15-25% ； (6)取出富含無機鹽的下層，采用大孔吸附樹脂以l_4BV/h的流速對所得灰樹花粗多糖以3-10倍柱體積水進行洗脫除雜，洗脫流速為0.5-5BV/h,之后，調節pH值范圍為.6.5-8，采用陰陽離子交換樹脂串聯樹脂柱脫蛋白處理；所述的陰離子交換樹脂與陽離子樹脂的質量比為1:1?5 ; (7)用截留量為8000的超濾膜除鹽，截留分子量范圍為100000-800000D，工作壓力為.0.5-0.7Mpa，溫度為35_50°C，轉子的轉速為400_600r/min，收集截留濃縮液，并用蒸餾水清洗，合并洗液與濃縮液，干燥，得到灰樹花多糖。
【文檔編號】C08B37/00GK104403014SQ201410632018
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月11日 優先權日:2014年11月11日
【發明者】羅宇 申請人:羅宇