治療骨髓再生障礙的聚陽離子納米顆粒及制備方法、應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及治療骨髓再生障礙藥物的【技術領域】，特別涉及一種治療骨髓再生障礙的聚陽離子納米顆粒及制備方法、應用。本發明的治療骨髓再生障礙的聚陽離子納米顆粒包含聚陽離子核酸材料和基因物質，所述聚陽離子核酸材料與基因物質的質量比為0.1～100：1，所述基因物質包括硫酸酯酶2型基因。與現有技術相比，本發明的納米顆粒可治療骨髓再生障礙，可實現Sulf-2的輸送，并且，不存在體內毒性和體內免疫原性的問題，由于納米顆粒不帶電荷，還可避免體內非靶組織的粘附，實現體內病變細胞靶向，從而有效提高靶向效果，且不影響體內病變細胞的內吞。
【專利說明】治療骨髓再生障礙的聚陽離子納米顆粒及制備方法、應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及治療骨髓再生障礙藥物的【技術領域】，特別涉及一種治療骨髓再生障礙 的聚陽離子納米顆粒及制備方法、應用。
【背景技術】
[0002] 硫酸酯酶是指能夠水解多種生物物質中的硫酸酯鍵的酶的總稱。至今，已有13 種人源的硫酸酯酶被克隆。硫酸酯酶的生物活性作用出現在許多基本的細胞代謝活動中， 包括降解硫酸化的分子，這些分子包括生物大分子（例如，蛋白多糖）和生物小分子（例 如，雌激素的硫酸化合物）。大部分人源的硫酸酯酶存在于細胞內的脂質體上，它們在脂 質體上發揮生物活性作用。但是有一小部分硫酸酯酶被發現存在于細胞外，這些地方包括 Golgi網絡、內質網以及細胞間質。硫酸醋酶1型基因和硫酸醋酶2型基因就存在于細胞 組織，并且作用于硫酸乙酰肝素糖蛋白（heparan sulfate proteoglycans, HSPG)的硫酸 酯鍵。硫酸乙酰肝素糖蛋白是普遍存在于基底膜（basement membrane, BM)中的一種蛋白。 HSPG與細胞外的信號分子結合是通過硫酸乙酰肝素（heparinsulfate，HS)鏈的多樣變化 來進行的。硫酸乙酰肝素的成分是基底膜蛋白多糖，基底膜糖蛋白與成纖維細胞生長因子 (fibroblastgrowth factor，FGF)等細胞因子及其細胞膜受體結合，能夠調節細胞內的信號 分子，不僅參與血管再生，還影響細胞的增殖與分化。進一步的研究發現，硫酸乙酰肝素上 6-0-氨基葡萄糖的硫酸化對于部分細胞增殖分化的生長因子信號傳導是必須的。
[0003] 我們知道，經5-氟尿嘧啶注射的小鼠，骨髓細胞數目迅速下降，并在第7天達 到最低點，隨后開始逐漸恢復，在第14天基本恢復到注射前的水平。我們研究發現， Sulf_2(即硫酸酯酶2型基因）能夠顯著地減少第7天小鼠外周血白細胞數、骨髓細胞數 和血小板數，而在第11天，實驗組小鼠的骨髓細胞數恢復程度好于對照組。一種解釋是 Sulf-2質粒的表達能夠暫時地抑制骨髓干細胞和祖細胞進入增殖狀態，保存其將來的再生 能力。因此，Sulf2質粒在骨髓再生中的功能值得進一步的研究。
[0004] 將核酸物質輸送到靶細胞的胞漿或細胞核內，需要克服一系列的體內輸送屏障， 因此，核酸載體是否高效，是其能否用于臨床治療的關鍵所在。核酸物質輸送的載體一般為 以下兩類：（1)病毒載體：病毒載體（如慢病毒載體、腺病毒載體）作為基因的輸送載體， 雖然有較高的體外轉染活性，然而，其免疫原性與易導致突變的缺點為臨床試驗帶來了巨 大的安全問題，使得其應用受限。（2)非病毒載體：非病毒載體的優勢主要在于，在保證預 期的轉染活性的條件下，可以大大降低病毒載體所帶來的免疫原性與諸多炎癥反應，其一 般為以下兩種載體設計：(a)陽離子脂質體；(b)聚陽離子基因載體。而目前研究更多的主 要集中于聚陽離子基因載體與陽離子脂質體的修飾，使之適用于基因物質的靶向輸送。陽 離子脂質體具有較高的體內外轉染活性，然而，由于表面的正電荷影響其體內的正常分布， 同時，由于選用陽離子脂質，免疫原性與炎癥反應在動物試驗中也成為不可避免的缺點之 一 (Gao, K. &Huang, L. Nonviral methods for siRNA delivery. Molecular pharmaceutics 6, 651-658 (2008).)。目前，沒有適合輸送Sulf-2的載體。
【發明內容】
[0005] 本發明目的在于提供一種治療骨髓再生障礙的聚陽離子納米顆粒，以解決現有的 Sulf-2沒有適合輸送的載體的技術問題。
[0006] 本發明的另一目的在于提供上述的治療骨髓再生障礙的聚陽離子納米顆粒的制 備方法，以解決現有的Sulf-2沒有適合輸送的載體的技術問題。
[0007] 本發明的再一目的在于提供上述的聚陽離子納米顆粒在制備治療骨髓再生障礙 的藥物中的應用。
[0008] 本發明目的通過以下的技術方案實現：
[0009] -種治療骨髓再生障礙的聚陽離子納米顆粒，所述納米顆粒包含聚陽離子核酸材 料和基因物質，所述聚陽離子核酸材料與基因物質的質量比為0. 1?100 :1，所述基因物質 包括硫酸酯酶2型基因。
[0010] 優選地，所述聚陽離子核酸材料由低分子量的聚乙烯亞胺（PEI)與含二甲醛的鏈 接劑以亞胺鍵構成，所述聚陽離子核酸材料的結構式為：
[0011]
【權利要求】
1. 一種治療骨髓再生障礙的聚陽離子納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒包含聚陽 離子核酸材料和基因物質，所述聚陽離子核酸材料與基因物質的質量比為0. 1?100 :1，所 述基因物質包括硫酸酯酶2型基因。
2. 如權利要求1所述的納米顆粒，其特征在于，所述聚陽離子核酸材料由低分子量的 聚乙烯亞胺（PEI)與含二甲醛的鏈接劑以亞胺鍵構成，所述聚陽離子核酸材料的結構式 為：
其中，X為含二甲醛的鏈接劑衍生的基團。
3. 如權利要求2所述的納米顆粒，其特征在于，所述聚乙烯亞胺的分子量低于2000。
4. 如權利要求2所述的納米顆粒，其特征在于，所述聚乙烯亞胺選自直鏈聚乙烯亞胺 或支鏈聚乙烯亞胺。
5. 如權利要求2所述的納米顆粒，其特征在于，所述鏈接劑選自戊二醛、對苯二甲醛、 間苯二甲醛、鄰苯二甲醛、2, 5-咪唑二甲醛、2, 4-吡啶二甲醛、2, 5-吡啶二甲醛、2, 6-吡啶 二甲醛、2, 5-噠嗪二甲醛或2, 6-噠嗪二甲醛的其中一種。
6. 如權利要求1所述的納米顆粒，其特征在于，所述基因物質為DNA，所述DNA為構建 的質粒DNA，所述質粒DNA包括功能基因序列、啟動子序列和抗性基因，所述質粒DNA的功能 基因序列包括： ATGCCC GGCCTCACGT GCTTTACCCA CGACAACAC CACTGGCAGA CGGCGCCACT CTGGACGCTG GGGCCGTTCT GCGCCTGCAC CAGCGCCAAC AACAACACGT ACTGGTGCTT GAGGACCATA AATGAGACCC ACAACTTCCT CTTCTGCGAA TTTGCAACCG GCTTCATAGA ATACTTTGAC CTCAGTACAG ACCCCTACCA GCTGATGAAC GCGGTGAACA CACTGGACAG GGACGTCTTT AACCAACTGC ACGTGCAGCT CATGGAGCTA AGGAGCTGTA AAGGCTACAA GCAGTGCAAC CCCCGGACC GCAACATGGA CCTGGGGCTT AGAGACGGaXG GAAGCTATGA ACAATACAGG CAGTTTCAGC GTCGAAAATG GCCAGAAATG AAGAGACCTT ACTGGGACACG CTATGGGAAG GTTGGGAAGG CTAA:
7. 如權利要求1所述的納米顆粒，其特征在于，所述聚陽離子核酸材料與基因物質的 質量比為5?50 :1。
8. 如權利要求1所述的納米顆粒，其特征在于，所述聚陽離子核酸材料與基因物質的 質量比10?30:1。
9. 權利要求1所述的治療骨髓再生障礙的聚陽離子納米顆粒的制備方法，其特征在 于，包括以下步驟： 聚陽離子核酸材料的水溶液和基因物質的水溶液混合，在室溫靜置20-60分鐘即可制 成所述納米顆粒。
10. 權利要求1所述的聚陽離子納米顆粒在制備治療骨髓再生障礙的藥物中的應用。
【文檔編號】C08G73/04GK104288783SQ201410505563
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月26日 優先權日:2014年9月26日
【發明者】袁偉恩, 毛文偉, 原明璐, 車俊怡 申請人:上海交通大學