一種地木耳抗腫瘤多糖及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種地木耳抗腫瘤多糖及其制備方法，以及該多糖在制備抗腫瘤藥物和保健食品中的應用。其制備方法是將純天然地木耳干燥后粉碎，稱取適量，加蒸餾水回流浸提，合并提取液；將上述提取液旋轉蒸發濃縮至適量，以體積比1：1加入10.6％亞鐵氰化鉀溶液和21.9％乙酸鋅溶液沉淀蛋白，離心后吸取上清液；再減壓旋轉蒸發濃縮至一定體積，將濃縮液蒸餾水透析后，加入無水乙醇析出白色絮狀物，離心后再真空冷凍干燥，即得到地木耳多糖。體外抗腫瘤實驗表明，該多糖能明顯抑制人乳腺癌細胞增殖而無細胞毒性，具有良好的抗腫瘤活性，為開發研制新型抗癌保健品或藥物提供了可能。
【專利說明】一種地木耳抗腫瘤多糖及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及藍綠藻類植物多糖的制備和應用，具體屬于一種地木耳抗腫瘤多糖及 其制備方法，以及在制備抗腫瘤藥物和天然保健食品中的應用。
【背景技術】
[0002] 地木耳，學名普通念珠藻（Nostoc commune Vauch.)，俗稱地皮菜，別名地衣、地 菜燕、地軟兒、地菜皮、地耳，為藻類藍藻綱念珠藻科（nostocaceae)念珠藻屬植物念珠藻 (nostoc commune vauch)的片狀藻類。一般生長在潮濕的砂質土壤表面，常混雜于雜草基 部的莖葉間、大樹的基部及苔醉植物群間。地木耳幾乎在全國均有分布，在東北地區尤其是 長白山區有廣泛的野生資源分布，在山西亦有很高的產量。
[0003] 《本草綱目》記述地木耳："氣味：甘、平、無毒；主治：明目益氣，補腎。"《名醫 別錄》中記述"主明目，益氣，令人有子。"《食物考》中認為："清神解熱，痰火能療""久 服延年，蓋亦能清臟熱者。目前已有文獻報道：它含有豐富的蛋白質、糖類、多種微量元素 及一定的粗脂肪和粗纖維，具有較高的食用和營養價值，是典型綠色山野天然食品；同時經 常食用具有清熱解毒、涼血明目、促進新陳代謝的功效，是很好的醫療保健食品。因此，地木 耳可以作為一種食藥兩用的保健食品。
[0004] 多糖類物質是指一類由10個以上單糖分子聚合而成的天然高分子化合物，是維 持正常生命活動的大分子物質之一。有研究表明，地木耳多糖物質具有抗氧化和抑菌活性， 還有抗疲勞、抗病毒、降血糖、降血脂、消炎等功能，但尚未看到地木耳多糖抗腫瘤活性的研 究。本實驗以地木耳為材料，提取出一種具有抗腫瘤活性的多糖，該多糖能夠顯著抑制人乳 腺癌細胞的增殖。因此，本發明不僅能夠應用于抗腫瘤藥物、天然新食品和健康飲品的研制 開發，同時為促進地木耳資源的深度開發和有效利用提供理論依據。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種具有抗腫瘤活性的地木耳多糖及其制備方法，以及其 在制備抗腫瘤藥物和保健食品中的應用。
[0006] 本發明提供的一種地木耳抗腫瘤多糖的方法，包括如下步驟：
[0007] 第一步：取地木耳，60°C干燥2小時后粉碎，加蒸餾水加熱回流3小時，靜置，雙層 紗布過濾，取上清液，如上重復提取1次，合并濾液，減壓蒸發濃縮至粘稠狀；
[0008] 第二步：濃縮后的提取液邊攪拌邊加入10. 6 %的亞鐵氰化鉀 (K4 [Fe (CN) 6] · 3H20)，搖勻，再加入21. 9 %的乙酸鋅（C4H804Zn)，振搖均勻，以沉淀蛋白，室溫 下放置30分鐘，5000rpm離心20分鐘后取上清液，減壓蒸發濃縮至粘稠狀；所述的亞鐵氰 化鉀、乙酸鋅和提取液體積比為1 : 1 : 8-15;
[0009] 第三步：用截留量為3000的透析袋，將第二步得到的濃縮液在蒸餾水中透析，每 12小時換水一次，直至透析液電導率不變，以除去離子和單糖等小分子雜質；
[0010] 第四步：在第三步得到的提取液中加入無水乙醇，渦旋，室溫放置〇. 5-1小時，以 沉淀多糖，然后5000rpm離心15-20分鐘，收集沉淀；所述的提取液和無水乙醇體積比為 3-2 ： 7-8 ；
[0011] 第五步：在上述沉淀中加入適量蒸餾水，50-60°C下攪拌溶解，直至成均一液體， 再真空冷凍干燥成絮狀物即得粗多糖樣品，命名為NVPS，于4°C保存。
[0012] 第二步中所述的10. 6%亞鐵氰化鉀溶液、21. 9%乙酸鋅溶液和提取液體積比優選 為 1 : 1 : 10。
[0013] 第四步中所述的提取液和無水乙醇體積比優選為3 : 7。
[0014] 第五步中所述的溶解沉淀加熱溫度優選為55°C。
[0015] 上述制備方法制得的地木耳多糖可在制備新型抗癌藥物中應用，也可在制備保健 品中應用。
[0016] 經體外抗腫瘤活性檢測顯示，上述制備方法制得的地木耳多糖可明顯抑制癌細胞 增殖，具有良好的抗癌活性。結果顯示用不同濃度該多糖處理人乳腺癌細胞（MCF-7)24小 時、濃度為300ug/ml時，致死率達到約25% ;處理36小時、濃度為200ug/ml時，致死率 高至約60%，所以該多糖對癌細胞（MCF-7)具有良好的抑制效果。
[0017] 該方法制備的多糖，因其來源于純天然藻類，加之純化工藝簡單，因此有較大的開 發前景和應用價值。如：在醫藥方面，可作為其他藥物的輔料或制備具有抗腫瘤活性的癌癥 輔助藥物；在保健品方面，可制備具有抗腫瘤和抗氧化功能的保健口服液；另外，還可以作 為天然食品添加劑應用在飲料和點心中，還可作為乳化劑、保濕劑添加在化妝品中。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018] 圖1地木耳抗腫瘤多糖（NVPS)樣品
[0019] 圖2地木耳抗腫瘤多糖（NVPS)對細胞毒性的影響柱形圖
[0020] 圖3地木耳抗腫瘤多糖（NVPS)誘導MCF-7細胞凋亡具有劑量依賴性柱形圖
【具體實施方式】
[0021] 實施例1地木耳抗腫瘤多糖（NVPS)的制備方法
[0022] (1)將天然地木耳60°C干燥2小時，粉碎。
[0023] (2)取地木耳粉末100g，加5L蒸餾水加熱回流3小時，靜置，雙層紗布過濾，取上 清液，如上重復提取1次，2次濾液合并，減壓蒸發濃縮至1000ml ;
[0024] (3)將步驟⑵中獲得的地皮菜提取液邊攪拌邊加入100ml亞鐵氰化鉀 (K4[Fe(CN) 6] · 3H20) (10.6% )，搖勻，再加入 100ml 乙酸鋅（C4H804Zn) (21.9% )，振搖均 勻，以沉淀蛋白，室溫下放置30分鐘，5000rpm離心20分鐘后取上清液，減壓蒸發濃縮至 100ml ；
[0025] (4)將步驟（3)得到的濃縮液用截留量為3000的透析袋在蒸餾水中透析，每12 小時換水一次，直至透析液電導率幾乎不變，得到除去離子和單糖等小分子雜質的透析液 120ml ；
[0026] (5)在步驟⑷得到的提取液中加入280ml無水乙醇，渦旋，室溫放置1小時，以沉 淀多糖，然后5000rpm離心20分鐘，收集沉淀；
[0027] (6)在步驟（5)得到的沉淀中加入50ml蒸餾水加熱攪拌溶解，直至成均一液體，再 真空冷凍干燥成絮狀物即得粗多糖樣品，命名為NVPS，于4°C保存；
[0028] 采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標準品測定地木耳多糖含量。結果發現100g的地 木耳粉末中多糖含量約為8. 734g地木耳多糖樣品（如圖1所示）。
[0029] 實施例2 :選取對數生長期的MCF-7細胞，將細胞制成細胞懸液，通過細胞計數，每 孔4X104個接種到96孔板中，37°C、5% C02培養箱培養24小時待細胞貼壁后，棄掉舊的 培養基，加入不同多糖終濃度（〇、25、50、100、200、300ug/ml)的培養基，設5個平行孔，將培 養板繼續培養24小時，每孔加入20 μ L5. Omg/mL MTT，再孵育4小時。移去板中培養液，每 孔加入150 μ L的DMS0溶解活細胞產生的甲瓚結晶，置搖床上振蕩lOmin，在酶標儀于波長 570nm處測定各孔光吸光度。與對照孔相比如果含多糖提取物的孔吸光度的減少大于10% (也就是抑制率大于10% )，則認為該濃度下對細胞有毒性。
[0030] 細胞毒性實驗結果表明：用不同濃度（25、50、100、200、300ug/ml)地木耳多糖 (NVPS)處理MCF-7細胞24小時，與對照相比抑制率分別約為7. 62 %、9. 25 %、9. 51 %、 5. 25%、8. 64%，抑制率均小于10%，所以NVPS在這些濃度下對細胞沒有毒性（如圖2所 示）。
[0031] 實施例3:
[0032] 選取對數生長期的MCF-7細胞，調整細胞濃度為每孔8 X 103個細胞/100 μ 1培養 液，加到96孔培養板中。37°C、5%C02培養箱中過夜培養。待細胞貼壁后取出培養板，更 換含不同濃度（〇、25、50、100、200、300ug/ml)地木耳多糖的培養基，設5個平行孔。培養 板放回培養箱中繼續培養24小時和36小時，每孔加入20 μ L5. Omg/mL MTT，繼續孵育4小 時。吸去板中培養液，每孔加入150μ 1的DMS0溶解活細胞產生的甲瓚結晶，置搖床上振蕩 lOmin，在酶標儀于波長570nm處測定各孔光吸光度。
[0033] 本發明所得地木耳多糖（NVPS)，對人乳腺癌癌細胞株進行上述體外抗腫瘤活性檢 測。結果表明：用不同濃度的NVPS(0、25、50、100、200、300ug/ml)處理MCF-7細胞24小時， 以及處理36小時，25、50、100ug/ml的NVPS對MCF-7抑制率均在20%左右及以下，而處理 36小時濃度在200、300ug/ml時，NVPS對MCF-7抑制率分別為57. 6%、73. 3%，與對照組相 比具有極顯著性差異（P〈〇. 01)(如圖3所示）。
【權利要求】
1. 一種地木耳抗腫瘤多糖的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： 第一步：取地木耳，60°c干燥2小時后粉碎，加蒸餾水加熱回流3小時，靜置，雙層紗布 過濾，取上清液，如上重復提取1次，合并濾液，減壓蒸發濃縮至粘稠狀； 第二步：濃縮后的提取液邊攪拌邊加入10. 6%的亞鐵氰化鉀，搖勻，再加入21. 9%的 乙酸鋅，振搖均勻，室溫下放置30分鐘，5000rpm離心20分鐘后取上清液，減壓蒸發濃縮至 粘稠狀；所述的亞鐵氰化鉀、乙酸鋅和提取液體積比為1 : 1 : 8-15; 第三步：用截留量為3000的透析袋，將第二步得到的濃縮液在蒸餾水中透析，每12小 時換水一次，直至透析液電導率不變； 第四步：在第三步得到的提取液中加入無水乙醇，渦旋，室溫放置0.5-1小時，然后 5000rpm離心15-20分鐘，收集沉淀；所述的提取液和無水乙醇體積比為3-2 : 7-8 ; 第五步：在上述沉淀中加入適量蒸餾水，50-6(TC下攪拌溶解，直至成均一液體，再真 空冷凍干燥成絮狀物即得粗多糖樣品，于4°C保存。
2. 如權利要求1所述的一種地木耳抗腫瘤多糖的制備方法，其特征在于，第二步中所 述的10. 6%亞鐵氰化鉀溶液、21. 9%乙酸鋅溶液和提取液體積比為1 : 1 : 10。
3. 如權利要求1所述的一種地木耳抗腫瘤多糖的制備方法，其特征在于，第四步中所 述的提取液和無水乙醇體積比為3 : 7。
4. 如權利要求1所述的一種地木耳抗腫瘤多糖的制備方法，其特征在于，第五步中所 述的溶解沉淀加熱溫度為55°C。
5. 如權利要求1、2、3或4所述制備方法制得的地木耳抗腫瘤多糖。
6. 如權利要求5所述的地木耳抗腫瘤多糖在制備新型抗癌藥物中的應用。
7. 如權利要求5所述的地木耳抗腫瘤多糖在制備保健品中的應用。
【文檔編號】C08B37/00GK104193845SQ201410459857
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月11日 優先權日:2014年9月11日
【發明者】李卓玉, 郭敏, 郭松佳, 單樹花, 李宗偉, 盧德趙, 李漢卿 申請人:山西大學