一種樟芝菌絲體胞內多糖的提取方法
【專利摘要】本發明涉及一種樟芝菌絲體胞內多糖的提取方法。所述的方法包括以下步驟：先將樟芝菌種進行液體發酵、過濾、烘干，制得樟芝干菌絲體；再對粉碎后的樟芝干菌絲體進行恒溫提取、過濾、離心、濃縮、醇析、離心，最后加入溶劑洗滌，并用蒸餾水溶解稀釋，離心取上清液，真空干燥至恒重，制得樟芝菌絲體粗多糖。本發明將樟芝菌絲體多糖的提取溫度限定在70-80℃，提取時間限定為4.5-5h，可達到最佳多糖提取效果，同時，也避免了多糖在提取過程中的理化性質的改變，保證了提取的多糖的生理活性，且本發明先后對樟芝菌進行發酵培養、提取及多次離心等操作，也保證了樟芝菌多糖被充分提取。
【專利說明】一種樟芝菌絲體胞內多糖的提取方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物領域，具體涉及一種樟芝菌絲體胞內多糖的提取方法。
【背景技術】
[0002] 食藥用菌是一種重要的生物資源，我國食用菌資源豐富，但開發利用相對晚于動 植物資源。樟芝（Antrodia Camphorata)生長在中國臺灣牛樟樹的中空心木材內壁，故被 稱為牛樟芝，屬擔子菌綱，多孔菌目，多孔菌科，薄孔茵屬。樟芝多糖是其樟芝菌體發酵初級 代謝產物，也是樟芝菌最主要的一種保健功能因子。研究表明，樟芝菌多糖能刺激人體產 生抗體，發揮抗癌作用，同時，還具有抗病菌、抗病毒、抗輻射、抗衰老等功能及降血糖、降血 壓、降膽固醇、抗炎癥、抗血凝等多種生理活性，此外，它能通過刺激巨噬細胞、T淋巴細胞、B 淋巴細胞等增強人體免疫功能。臨床試驗表明，食藥樟芝菌多糖類無任何副作用，可作為高 效低毒藥物。因此，樟芝菌是一種極具開發潛力及應用前景的藥用菌，但樟芝目前還不能完 全人工栽培，且天然樟芝子實體價格過高，導致目前樟芝菌成為全世界市場上最昂貴的野 生真菌。
[0003] 隨著基礎理論及應用技術研究的不斷深入，目前，現代生物工程技術之一即食藥 菌的發酵工程技術也取得了較大的進展，為了提高樟芝菌絲體內胞內多糖的提取率，已有 學者進行了熱水浸提法等試驗研究，但有關提取溫度、提取時間等研究尚不充分，且多糖提 取率也較低。為此，本發明提供一種簡單可行且多糖提取率高的樟芝多糖提取方法。
【發明內容】
[0004] 針對上述現有技術的不足，本發明提供一種從樟芝菌絲體中提取多糖的方法。
[0005] 本發明的技術方案如下： 一種樟芝菌絲體胞內多糖的提取方法，包括以下步驟： (1) 制備樟芝干菌絲體：將樟芝菌種先后進行液體發酵、過濾、烘干，制得樟菌菌干菌絲 體； (2) 取步驟（1)中制得的干菌絲體5-10g粉碎，將粉碎的粉末放入燒杯中，加蒸餾水 20-50ml，將燒杯置入電熱恒溫水浴鍋中進行提取，提取液過濾，離心取上清液進行濃縮，取 濃縮液進行醇析、離心，取沉淀； (3) 在步驟（2)中得到的沉淀中加2-4倍體積的溶劑洗滌，再用等量的的蒸餾水溶解稀 釋，離心取上清液，真空干燥至恒重，制得樟芝菌絲體粗多糖。
[0006] 步驟（1)中所述的發酵具體方法為：將樟芝斜面菌株接種于樟芝發酵基礎培養基 中，在光照下培養l〇-15d。
[0007] 優選的，所述的樟芝發酵基礎培養基由以下重量份的組分組成：馬鈴薯50-100g， 葡萄糖10-20g，黃豆粉2-5g，玉米粉2-5g，蛋白胨l-3g，磷酸二氫鉀0. 2-0. 5g，硫酸鎂 0· 15-0.35g，水 10_20ml。
[0008] 步驟（1)中所述的過濾的具體方法為：將發酵后的樟芝發酵液經40目篩過濾，截 留的菌絲體再用3倍量蒸餾水洗滌溶解，再過40目篩，取濾液即為過濾后的樟芝發酵液。
[0009] 步驟（1)中所述的烘干的具體過程為：將過濾后的樟芝發酵液在60_65°C的烘箱 中烘干至恒重，制得樟芝干菌絲體。
[0010] 步驟（2)中所述的提取溫度為70-80°C，所述的提取時間為4. 5-5h。
[0011] 步驟（2)中所述的過濾為微孔濾膜過濾，所述的離心速度為4000-6000r/min， 離心時間為10-30min ;所述的濃縮為旋轉蒸發濃縮，操作溫度為60-65°C，操作時間為 20-30min〇
[0012] 步驟（2)中所述的醇析過程中，加入的溶劑為體積比為（2-5) :(0.6-1.2)的氯仿 與異戊醇的混合溶液。
[0013] 步驟（3)中洗滌時所加入的溶劑為無水乙醇，洗滌次數為2-4次。
[0014] 步驟（3)中所述的離心速度為4000-6000r/min，離心時間為5-10min，干燥溫度為 60-65。。。
[0015] 本發明與現有技術相比，有益效果體現在以下幾點： 1.研究顯示，樟芝菌絲體多糖的提取時間為4. 7h、提取溫度為75°C左右時，提取率的 理論值為8. 8%，是樟芝菌絲體胞內多糖提取的最佳參數，因此，本發明在提取過程中，將提 取溫度限定在70-80°C，提取時間限定為4. 5-5h，可達到最佳多糖提取效果，同時，也避免 了多糖在提取過程中的理化性質的改變，保證了提取的多糖的生理活性。
[0016] 2.本發明中，先對樟芝菌進行發酵培養、過濾及烘干制得干菌絲體，然后先后進行 提取、離心、濃縮、醇析、再次離心、洗滌、離心及干燥，保證了樟芝菌多糖被充分提取。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合實施例對本發明做進一步說明。
[0018] 實施例1 一種樟芝菌絲體胞內多糖的提取方法，包括以下步驟： (1) 制備樟芝干菌絲體：將樟芝斜面菌株接種于樟芝發酵基礎培養基中，在光照下培養 l〇d進行發酵，將發酵液經40目篩過濾，截留的菌絲體再用3倍量蒸餾水洗滌溶解，再過40 目篩，取濾液即為過濾后的樟芝發酵液，在60°C的烘箱中烘干至恒重，制得樟芝干菌絲體； (2) 取步驟（1)中制得的干菌絲體5g粉碎，將粉碎的粉末放入燒杯中，加蒸餾水20ml， 將燒杯置入電熱恒溫水浴鍋中進行提取，提取溫度為70°C，所述的提取時間為4. 5h，將提 取液采用微孔濾膜過濾過濾，以4000r/min的離心速度離心lOmin ;取上清液進行旋轉蒸發 濃縮，操作溫度為60°C，操作時間為20min ;在濃縮液中加入體積比為2 :0. 6的氯仿與異戊 醇的混合溶液進行醇析，以4000r/min的離心速度離心lOmin，取沉淀； (3) 在步驟（2)中得到的沉淀中加2倍體積的無水乙醇洗滌2次，再用等量的的蒸餾水 溶解稀釋，以4000r/min的速度離心5min,離心取上清液，在60°C真空干燥至恒重，制得樟 芝菌絲體粗多糖。
[0019] 優選的，所述的樟芝發酵基礎培養基由以下重量份的組分組成：馬鈴薯50g，葡萄 糖l〇g，黃豆粉2g，玉米粉2g，蛋白胨lg，磷酸二氫鉀0.25g，硫酸鎂0. 15g，水10ml。
[0020] 實施例2 一種樟芝菌絲體胞內多糖的提取方法，包括以下步驟： (1) 制備樟芝干菌絲體：將樟芝斜面菌株接種于樟芝發酵基礎培養基中，在光照下培養 15d進行發酵，將發酵液經40目篩過濾，截留的菌絲體再用3倍量蒸餾水洗滌溶解，再過40 目篩，取濾液即為過濾后的樟芝發酵液，在65°C的烘箱中烘干至恒重，制得樟芝干菌絲體； (2) 取步驟（1)中制得的干菌絲體10g粉碎，將粉碎的粉末放入燒杯中，加蒸餾水50ml， 將燒杯置入電熱恒溫水浴鍋中進行提取，提取溫度為80°C，所述的提取時間為5h，將提取 液采用微孔濾膜過濾過濾，以6000r/min的離心速度離心30min ;取上清液進行旋轉蒸發濃 縮，操作溫度為65°C，操作時間為30min ;在濃縮液中加入體積比為5 :1. 2的氯仿與異戊醇 的混合溶液進行醇析、以6000r/min的離心速度離心30min，取沉淀； (3) 在步驟（2)中得到的沉淀中加3倍體積的無水乙醇洗滌3次，再用等量的的蒸餾水 溶解稀釋，以5000r/min的速度離心8min,離心取上清液，在63°C真空干燥至恒重，制得樟 芝菌絲體粗多糖。
[0021] 優選的，所述的樟芝發酵基礎培養基由以下重量份的組分組成：馬鈴薯l〇〇g，葡 萄糖20g，黃豆粉5g，玉米粉5g，蛋白胨3g，磷酸二氫鉀0. 5g，硫酸鎂0. 35g，水20ml。
[0022] 實施例3 一種樟芝菌絲體胞內多糖的提取方法，包括以下步驟： (1) 制備樟芝干菌絲體：將樟芝斜面菌株接種于樟芝發酵基礎培養基中，在光照下培養 12d進行發酵，將發酵液經40目篩過濾，截留的菌絲體再用3倍量蒸餾水洗滌溶解，再過40 目篩，取濾液即為過濾后的樟芝發酵液，在62°C的烘箱中烘干至恒重，制得樟芝干菌絲體； (2) 取步驟（1)中制得的干菌絲體8g粉碎，將粉碎的粉末放入燒杯中，加蒸餾水30ml， 將燒杯置入電熱恒溫水浴鍋中進行提取，提取溫度為75°C，所述的提取時間為4. 8h，將提 取液采用微孔濾膜過濾過濾，以6000r/min的離心速度離心30min ;取上清液進行旋轉蒸發 濃縮，操作溫度為65°C，操作時間為30min ;在濃縮液中加入體積比為5 : 1. 2的氯仿與異 戊醇的混合溶液進行醇析、以6000r/min的離心速度離心30min，取沉淀； (3) 在步驟（2)中得到的沉淀中加4倍體積的無水乙醇洗滌4次，再用等量的的蒸餾水 溶解稀釋，以4000-6000r/min的速度離心Omin,離心取上清液，在65?真空干燥至恒重，制 得樟芝菌絲體粗多糖。
[0023] 優選的，所述的樟芝發酵基礎培養基由以下重量份的組分組成：馬鈴薯80g，葡萄 糖15g，黃豆粉3g，玉米粉3g，蛋白胨2g，磷酸二氫鉀0. 3g，硫酸鎂0. 25g，水15ml。
[0024] 上述實施例僅為本發明的優選實施方式，并不應理解為對本發明的限定，本領域 技術人員根據本發明的揭示，不脫離本發明范疇所做出的改進和修改都應該在本發明的保 護范圍之內。
【權利要求】
1. 一種樟芝菌絲體胞內多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 制備樟芝干菌絲體：將樟芝菌種先后進行液體發酵、過濾、烘干，制得樟菌菌干菌絲 體； (2) 取步驟（1)中制得的干菌絲體5-10g粉碎，將粉碎的粉末放入燒杯中，加蒸餾水 20-50ml，將燒杯置入電熱恒溫水浴鍋中進行提取，提取液過濾，離心取上清液進行濃縮，取 濃縮液進行醇析、離心，取沉淀； (3) 在步驟（2)中得到的沉淀中加2-4倍體積的溶劑洗滌，再用等量的的蒸餾水溶解稀 釋，離心取上清液，真空干燥至恒重，制得樟芝菌絲體粗多糖。
2. 根據權利要求1所述的一種樟芝菌絲體胞內多糖的提取方法，其特征在于，步驟（1) 中所述的發酵具體方法為：將樟芝斜面菌株接種于樟芝發酵基礎培養基中，在光照下培養 10-15d。
3. 根據權利要求2所述的一種樟芝菌絲體胞內多糖的提取方法，其特征在于，所述的 樟芝發酵基礎培養基由以下重量份的組分組成：馬鈴薯50-100g，葡萄糖10-20g，黃豆粉 2-5g，玉米粉 2-5g，蛋白胨 l-3g，磷酸二氫鉀 0. 2-0. 5g，硫酸鎂 0. 15-0. 35g，水 10-20ml。
4. 根據權利要求1所述的一種樟芝菌絲體胞內多糖的提取方法，其特征在于，步驟（1) 中所述的過濾的具體方法為：將發酵后的樟芝發酵液經40目篩過濾，截留的菌絲體再用3 倍量蒸餾水洗滌溶解，再過40目篩，取濾液即為過濾后的樟芝發酵液。
5. 根據權利要求1所述的一種樟芝菌絲體胞內多糖的提取方法，其特征在于，步驟（1) 中所述的烘干的具體過程為：將過濾后的樟芝發酵液在60-65°C的烘箱中烘干至恒重，制 得樟芝干菌絲體。
6. 根據權利要求1所述的一種樟芝菌絲體胞內多糖的提取方法，其特征在于，步驟（2) 中所述的提取溫度為70-80°C，所述的提取時間為4. 5-5h。
7. 根據權利要求1所述的一種樟芝菌絲體胞內多糖的提取方法，其特征在于，步驟 (2) 中所述的過濾為微孔濾膜過濾，所述的離心速度為4000-6000r/min,離心時間為 10-30min ;所述的濃縮為旋轉蒸發濃縮，操作溫度為60-65°C，操作時間為20-30min。
8. 根據權利要求1所述的一種樟芝菌絲體胞內多糖的提取方法，其特征在于，步驟（2) 中所述的醇析過程中，加入的溶劑為體積比為（2-5) : (0. 6-1. 2)的氯仿與異戊醇的混合溶 液。
9. 根據權利要求1所述的一種樟芝菌絲體胞內多糖的提取方法，其特征在于，步驟（3) 中洗滌時所加入的溶劑為無水乙醇，洗滌次數為2-4次。
10. 根據權利要求1所述的一種樟芝菌絲體胞內多糖的提取方法，其特征在于，步驟 (3) 中所述的離心速度為4000-6000r/min，離心時間為5-10min，干燥溫度為60-65°C。
【文檔編號】C08B37/00GK104193843SQ201410446060
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月4日 優先權日:2014年9月4日
【發明者】劉巴寧, 鄭安喬 申請人:中山安蕎生物科技有限公司