反萃取法制備硫酸軟骨素的方法
【專利摘要】本發明公開了反萃取法制備硫酸軟骨素的方法，該硫酸軟骨素制備方法包括下列步驟：（1）蒸煮、堿提；（2）酶解；（3）吸附；（4）反萃取；（5）沉淀、干燥。本發明的生產工藝簡單，適合規模化生產，產品質量穩定，硫酸軟骨素回收率達到80%以上。
【專利說明】反萃取法制備硫酸軟骨素的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種反萃取法制備硫酸軟骨素的方法。
【背景技術】
[0002]硫酸軟骨素,英文名chondroitin sulfate,是以動物(豬、牛、馬、羊、雞、藍魚等)的軟骨為原料的一種高分子酸性粘多糖，其分子結構為β -D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖通過βI — 3糖苷鍵形成的重復二糖單位所組成的多糖鏈。它是一種白色或微黃色粉末，吸水性強，易溶于水而成粘稠液體，不溶于酒精、丙酮、乙醚和氯仿等有機溶劑，其鹽類對熱較穩定。硫酸軟骨素的生物活性，隨分子量而不同。其藥理活性與分子量有密切關系，分子量的大小對口服后腸胃吸收率的影響也十分明顯。
[0003]目前，硫酸軟骨素的提取方法有酶解、堿法、超聲波法和中性鹽法等；其分離純化有乙醇沉淀法、離子交換色譜法、季銨鹽配合法、吸附法和纖維素分離法等。提取硫酸軟骨素主要采用堿-酶提取法，包括如下步驟:堿提、酶解、氧化、醇沉，操作過程繁瑣，周期長，生產成本高，產品純度低。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于:提供一種反萃取法制備硫酸軟骨素的方法，操作過程簡單，避免氧化及多次醇沉工序，縮短周期，制備的硫酸軟骨素的產品純度高。 本發明采取以下技術解決方案予以實現:該反萃取法制備硫酸軟骨素的方法包括下列步驟:
(1)蒸煮、堿提:先將軟骨在80-100°C水中煮4-6h，然后加入原料干重的6.25倍的質量濃度3%氫氧化鈉溶液，30-40°C提取1.5-2 h，再用鹽酸調pH到5.5-6.5，紗布過濾，留下濾液；
(2)酶解:將步驟(1)的濾液調節pH8.0~9.0，按濾液與胰酶1000: 0.5_2的質量比加入胰酶，于40~50°C水解4h，再按濾液與胃蛋白酶1000: 0.5-2的質量比加入胃蛋白酶，40~50°C水解3 h，過濾；
(3)吸附:步驟(2)的酶解液中加入吸附劑吸附，緩慢間歇攪拌4h，置4°C自然澄清，取上清液；
(4)反萃取:將步驟(3)的上清液按體積比1:1加入氯仿進行反萃取，靜置分層后留水層；
(5)沉淀、干燥:將步驟(4)的萃取液調PH6，加入體積的2.5倍量酒精沉淀，沉淀后再用質量濃度95%酒精脫水兩次，干燥，粉碎，得硫酸軟骨素成品。
[0005]其中，步驟(3)的吸附劑為硅藻土、高嶺土或活性炭，其終濃度0.2%-0.8%。
[0006]本發明的效果是:應用反萃取法制備硫酸軟骨素，方法簡單，工藝周期短，減少堿解帶來的環境污染，所得的硫酸軟骨素產品純度高，收率好。
【具體實施方式】
[0007]下面結合具體實施例進一步說明本發明的技術解決方案，這些實施例不能理解為是對技術方案的限制。
[0008]實施例1:依以下步驟制備硫酸軟骨素
(O蒸煮、堿提:先將2公斤軟骨原料加水浸沒，在80°C水中煮6 h，使附在軟骨表面的肌肉組織剝離，漏勺撈出軟骨；軟骨放入反應釜，加入12.5公斤質量濃度3%氫氧化鈉溶液，30°C提取2 h，再用鹽酸調pH到5.5，紗布過濾，留下濾液；
(2)酶解:將步驟(1)的濾液調節pH8.0，按濾液與胰酶1000: 0.5的質量比加入胰酶，于40°C水解4h，再按濾液與胃蛋白酶1000: 0.5的質量比加入胃蛋白酶，40°C水解3 h，過濾；
(3)吸附:步驟(2)的酶解液中加入硅藻土吸附，硅藻土終濃度為0.2%，緩慢間歇攪拌4h，置4°C自然澄清，取上清液；
(4)反萃取:將步驟(3)的上清液按體積比1:1加入氯仿進行反萃取，靜置分層后留水層；
(5)沉淀、干燥:將步驟(4)的萃取液調PH6，加入其體積的2.5倍量酒精沉淀，沉淀后再用質量濃度95%酒精脫水兩次，干燥，粉碎，得125g硫酸軟骨素成品；其中，硫酸軟骨素成品中葡萄糖醛酸的含量達35.0%。
[0009]實施例2:依以下步驟制備硫酸軟骨素
(O蒸煮、堿提:先將2公斤軟骨原料加水浸沒，在90°C水中煮5 h，使附在軟骨表面的肌肉組織剝離，漏勺撈出軟骨；軟骨放入反應釜，加入12.5公斤質量濃度3%氫氧化鈉溶液，35°C提取1.75 h，再用鹽酸調pH到6.0,紗布過濾，留下濾液；
(2)酶解:將步驟(1)的濾液調節pH8.5，按濾液與胰酶1000: 1.25的質量比加入胰酶，于45°C水解4h，再按濾液與胃蛋白酶1000: 1.25的質量比加入胃蛋白酶，45°C水解3h，過濾；
(3)吸附:步驟(2)的酶解液中加入高嶺土吸附，高嶺土終濃度為0.5%，緩慢間歇攪拌4h，置4°C自然澄清，取上清液；
(4)反萃取:將步驟(3)的上清液按體積比1:1加入氯仿進行反萃取，靜置分層后留水層；
(5)沉淀、干燥:將步驟(4)的萃取液調PH6，加入體積的2.5倍量酒精沉淀，沉淀后再用質量濃度95%酒精脫水兩次，干燥，粉碎，得127g硫酸軟骨素成品；其中，硫酸軟骨素成品中葡萄糖醛酸的含量達35.7%。
[0010]實施例3:依以下步驟制備硫酸軟骨素
(O蒸煮、堿提:先將2公斤軟骨原料加水浸沒，在100°C水中煮4 h，使附在軟骨表面的肌肉組織剝離，漏勺撈出軟骨；軟骨放入反應釜，加入12.5公斤
質量濃度3%氫氧化鈉溶液，40°C提取1.5 h，再用鹽酸調pH到6.5，紗布過濾，留下濾液；
(2)酶解:將步驟(1)的濾液調節pH9.0，按濾液與胰酶1000: 2的質量比加入胰酶，于50°C水解4h，再按濾液與胃蛋白酶1000: 2的質量比加入胃蛋白酶，50°C水解3 h，過濾；(3)吸附:步驟(2)的酶解液中加入活性炭吸附，活性炭終濃度為0.8%，緩慢間歇攪拌4h，置4°C自然澄清，取上清液；
(4)反萃取:將步驟(3)的上清液按體積比1:1加入氯仿進行反萃取，靜置分層后留水層；
(5)沉淀、干燥:將步驟(4)的萃取液調PH6，加入體積的2.5倍量酒精沉淀，沉淀后再用質量濃度95%酒精脫水兩次，干燥，粉碎，得128g硫酸軟骨素成品；硫酸軟骨素成品中葡萄糖醛酸的含量達36.5% 。
【權利要求】
1.反萃取法制備硫酸軟骨素的方法，其特征是該硫酸軟骨素制備方法包括下列步驟: (1)蒸煮、堿提:先將軟骨在80-100°C水中煮4-6h，然后加入原料干重的6.25倍的質量濃度3%氫氧化鈉溶液，30-40°C提取1.5-2 h，再用鹽酸調pH到5.5-6.5，紗布過濾，留下濾液； (2)酶解:將步驟(1)的濾液調節pH8.0~9.0，按濾液與胰酶1000: 0.5_2的質量比加入胰酶，于40~50°C水解4h，再按濾液與胃蛋白酶1000: 0.5-2的質量比加入胃蛋白酶，40~50°C水解3 h，過濾； (3)吸附:步驟(2)的酶解液中加入吸附劑吸附，緩慢間歇攪拌4h，置4°C自然澄清，取上清液； (4)反萃取:將步驟(3)的上清液按體積比1:1加入氯仿進行反萃取，靜置分層后留水層； (5)沉淀、干燥:將步驟(4)的萃取液調PH6，加入體積的2.5倍量酒精沉淀，沉淀后再用質量濃度95%酒精脫水兩次，干燥，粉碎，得硫酸軟骨素成品。
2.如權利要求1所述的反萃取法制備硫酸軟骨素的方法，其特征是:步驟(3)的吸附劑為硅藻土、高嶺土或 活性炭，其終濃度0.2%-0.8%。
【文檔編號】C08B37/08GK104177511SQ201410422075
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月26日 優先權日:2014年8月26日
【發明者】陳菊 申請人:淮安麥德森制藥有限公司