一種殼聚糖微球復合絲素基硫酸鈣骨水泥及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種殼聚糖微球復合絲素硫酸鈣骨水泥及其制備方法。本發明公開的可注射復合型骨水泥由殼聚糖微球和硫酸鈣組成的混合粉末與絲素溶液以1∶0.45的固液比g／ml配制而成，混合粉末中殼聚糖微球含量是0.1％w／w-1％w／w，硫酸鈣含量是99％w／w-99.9％w／w。首先利用乳化-化學交聯法制備殼聚糖微球，從家蠶蠶絲中提取絲素纖維進一步制成絲素溶液，然后將殼聚糖微球與硫酸鈣粉末混合，混合粉末再按照一定量的固液比與絲素溶液混合。本發明的骨水泥復合材料的優點在于不僅可被經皮微創注射至骨缺損部位修復骨缺損，且可在體內被降解吸收，可被用作藥物緩釋系統進行藥物或生長因子釋放較長時間作用于填充部位。
【專利說明】一種殼聚糖微球復合絲素基硫酸鈣骨水泥及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種醫用填充材料及其制備方法。具體而言，本發明涉及一種可注射 含有殼聚糖微球和絲素蛋白的硫酸鈣骨水泥復合材料及其制備方法。本發明的骨水泥復合 材料不僅可作為填充材料微創注射至填充修復骨缺損且可作為藥物緩釋系統用于術后的 藥物治療。
【背景技術】
[0002] 隨著人口老齡化的加快，椎體壓縮性骨折的發生率也隨之增多，椎體壓縮性骨折 的治療也不斷涌現出新的手術方法，如椎體成形術和椎體后凸成形術[毛海清等，中國組 織工程研究，2013,12 :2108-2115]，對于脊柱外科學材料的要求也越來越高。為了提升 患者的生存質量，必須不斷尋找具有良好生物相容性并且能提供足夠支撐強度的生物材 料。目前臨床上用于填充后凸成形擴張后椎體骨缺損的骨水泥多為聚甲基丙烯酸甲酯 (Polymethyl Methacrylate, PMMA)，在其提供足夠支撐強度和粘固作用等優點的同時也存 在一些明顯的缺點，如PMM在體內不能被降解吸收，生物相容性差，無生物活性，聚合時釋 放大量的熱，未聚合單體的毒性等。這些缺點導致了 PMM在臨床應用時常常會發生一些嚴 重的并發癥。
[0003] 硫酸鈣骨水泥（Calcium Sulfate Cement，CSC)作為一種具有良好的生物相容 性的骨替代材料，可在注入時可隨意塑形，固化后留下大量微孔，研究認為[Sidqui M.，et al.，Biomaterials，1995,16 (17) :1327-1332]，CSC在無骨膜存在的條件下不能刺激骨生 成，而在骨膜存在的條件下，硫酸鈣降解形成的局部微酸環境及局部高濃度的鈣離子有利 于血管和成骨細胞的長入，促進成骨細胞的增殖、分化，調節類骨質的形成，同時阻止纖維 組織的長入，進而發揮其骨誘導和傳導的功能[Lazary M.，et al.，Biomaterial, 2007， 28(3) :393-399 ；Chattopadhyay N. , et al. , Biochem Pharmacol,2007,74(3) :438-447]〇 但硫酸鈣存在一定的不足，如脆性大、強度較低、固化時間過快[白明等，中國組織工程研 究與臨床康復，2011,16:2937-2940]。絲素蛋白（Silk Fibroin，SF)結構與骨骼膠原相 似，無明顯抗原性，植入骨骼中不發生明顯的排異反應，具有良好的生物相容性，并且有利 于鈣鹽的沉積[Wang G·，et al·，J Bone Joint Surg Br, 2010,92 (2) :320-325]。殼聚 糖（Chitosan，CTS)具有生物可降解性、生物相容性，是自然界不可多得的天然高分子載 體材料[Wang AH.，et al.，J Microencapsul，2009, 26 (7) :593-602] ;Subramanian A.， et al·，Biomedical sciences instrumentation，2004,40:117_122]。使用殼聚糖微球 (Chitosan Microspheres，CM)包封藥物，具有控制藥物釋放、延長藥物療效的作用[Wang QZ. , et al. ,J Mater Sci Mater Med,2008,19(3) :1371-1377] ；Zhang Y. ,et al.,Biochem Biophys Res Commun, 2006, 344 (I) :362-369],從而提高藥物的穩定性，降低藥物的毒副作 用[Grenha A.，et al. ,Eur J Pharm Biopharm，2008,69(l) :83-93]，同時其自身具有抗炎 作用。目前，利用殼聚糖制備化療藥物、胰島素、抗生素等藥物的緩釋、控釋制劑及血脂吸附 微球已取得較好效果，部分已應用于臨床[郭保林等，膠體與聚合物，2006,02 :30-33 ;劉利 萍等，中國藥學雜志，2003,10 :46-49 ;Ozbas-Turan S et al·，J Pharm Sci，2002,91(5): 1245-1251 ;Shu ΧΖ·，et al.，J Microencapsul，2001，18(2) :237-245]。本發明在硫酸鈣 骨水泥的基礎上進一步優化配方，添加絲素蛋白和殼聚糖微球，使骨水泥能提供支撐作用 的同時緩慢釋放藥物，且可實現微創經皮注入填充修復和術后藥物治療的雙重目的。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種殼聚糖微球復合絲素基硫酸鈣骨水泥。
[0005] 本發明公開的復合型骨水泥由殼聚糖微球和硫酸鈣組成的混合粉末與絲素溶液 以1 : 0. 45的固液比g / ml配制而成，混合粉末中殼聚糖微球含量是0. 1 % W / W-I % w / w，硫酸|丐含量是 99%w / w-99.9%w / w。
[0006] 優選地，上述混合粉末中殼聚糖微球含量是0. 1% w / w-0. 5% w / w，硫酸I丐含 量是99. 5% w / w-99. 9% w / w ;更優選地，上述混合粉末中殼聚糖微球含量是0. 5% w / w，硫酸興含量是99. 5% w / w。
[0007] 優選地，絲素溶液濃度為3 % W / V-9 % W / V ;更優選地，絲素溶液濃度為6 % W / Vo
[0008] 本發明的另一目的在于提供一種殼聚糖微球復合絲素基硫酸鈣骨水泥的制備方 法，具體步驟如下：
[0009] (1)制備殼聚糖微球；
[0010] (2)從蠶絲中提取絲素，制成所述絲素溶液；
[0011] (3)將步驟（1)制備的所述殼聚糖微球與硫酸鈣粉末混合，所得混合粉末中含有 0· 1 % w / w殼聚糖微球及99 % w /w-99. 9 % w / w硫酸I丐，然后按照1 : 0.45 的固液比g/ml加入步驟（2)中制備的絲素溶液，調制均勻；
[0012] (4)將步驟（3)制備的混合物填注于柱形模具內，放置在烘箱中養護。
[0013] 殼聚糖微球的制備方法包括乳化-化學交聯法、噴霧干燥法、離子交聯法、沉淀/ 凝聚法。
[0014] 本發明的殼聚糖微球采用乳化-化學交聯法制備。
[0015] 采用乳化-化學交聯法制備殼聚糖微球的具體步驟如下：先將殼聚糖粉末溶于乙 酸溶液中，制成殼聚糖溶液，在燒瓶中分別加入油相液體石蠟乳化劑Span-80,攪拌同時逐 滴加入已溶解殼聚糖溶液，室溫攪拌。緩慢加入三聚磷酸鈉（TPP)水溶液，繼續攪拌。將混 合溶液離心，所得沉淀物用石油醚、酒精和雙蒸水各洗滌三遍，室溫干燥后產物研磨成均勻 的粉末，即可得殼聚糖微球。
[0016] 根據本發明的具體實施方案，殼聚糖微球的制備過程如下：先將150mg殼聚糖粉 末溶于10ml2%v / V乙酸溶液中，制成1.5%w / V殼聚糖溶液，在250ml燒瓶中分別加 入油相液體石錯eOmlU^v / V乳化劑Span-80,在2000r / min攪拌的同時逐滴加入已 溶解的I. 5% w / V殼聚糖溶液10ml，室溫攪拌2h。緩慢加入20g/L的三聚磷酸鈉（TPP) 水溶液50ml，繼續攪拌12h。將混合溶液1500r / min離心5min，所得沉淀物用石油醚、酒 精和雙蒸水各洗滌三遍，室溫干燥后產物研磨成均勻的粉末，即可得殼聚糖微球。
[0017] 絲素溶液制備方法如下：將蠶絲放入碳酸鈉溶液中一定時間后取出，先用溫水搓 洗，再用去離子水搓洗以脫膠，放入烘箱中烘干即得到脫膠的絲素纖維。將絲素纖維放入溴 化鋰溶液中，恒溫磁力攪拌，即得到棕黃色的絲素-溴化鋰混合液。將絲素-溴化鋰混合液 倒入清潔的透析袋中，透析三天，反復換水，經過濾獲得去鹽絲素溶液。再將去鹽絲素溶液 裝入透析袋中放入高濃度的聚乙烯醇（PEG)溶液中濃縮，將所得的濃縮液裝入離心管中， 離心，上清液即為絲素溶液的儲液。將絲素溶液的儲液稀釋成不同濃度用于后續實驗。
[0018] 根據本發明的具體實施方案，絲素溶液制備過程如下：將5g蠶絲放入2L含有 100°C、0.02mol / L的碳酸鈉溶液中，30min后取出，用溫水搓洗5遍，再用去離子水搓洗2 遍以脫膠，放入45°C-55°C烘箱中烘干即得到脫膠的絲素纖維。將絲素纖維放入20% w / v9. 3mol / L的溴化鋰溶液中，在60°C下恒溫磁力攪拌4h，即得到棕黃色的絲素-溴化鋰混 合液。將絲素-溴化鋰混合液倒入清潔的透析袋中，兩頭扎緊，放入去離子水中透析三天， 反復換水，經過濾獲得去鹽絲素溶液。再將去鹽絲素溶液裝入透析袋中放入高濃度的聚乙 烯醇（PEG)溶液中濃縮12h，將所得的濃縮液裝入離心管中，4°C，4950r / min離心lh，上清 液即為絲素溶液的儲液。將絲素溶液的儲液稀釋成不同濃度用于后續實驗。
[0019] 上述步驟（3)的具體操作如下：將殼聚糖微球與硫酸鈣粉末混合，混合粉末中殼 聚糖微球含量為〇. 1 % W / W-I % W / W殼聚糖微球，硫酸I丐含量為99% W / W-99. 9 % W / w，然后加入無水乙醇攪拌均勻，室溫揮發干燥，用瑪瑙研缽研磨后備用。將硫酸鈣與殼聚糖 組成的混合粉末與絲素溶液按1 : 0.45的固液比g / ml調制均勻，待凝固后即為本發明 的復合骨水泥產品。
[0020] 本發明的優點和有益效果如下：
[0021] (1)本發明首次將殼聚糖微球和絲素加入到硫酸鈣骨水泥中制成可注射修復承重 部位骨缺損的復合型磷酸鈣骨水泥，優化了硫酸鈣骨水泥的抗壓強度和凝固時間，進一步 提高了硫酸鈣骨水泥作為微創經皮椎體骨缺損修復材料的性能，擴大了其應用范圍。
[0022] (2)本發明將殼聚糖微球加入到硫酸鈣骨水泥中，除提高骨水泥作為骨損傷修復 材料的性能之外，還能作為藥物緩釋系統，負載藥物（如抗生素）或者成骨因子，通過殼聚 糖的緩慢釋放用以提高臨床療效。
[0023] 本發明的復合型骨水泥可攜帶治病藥物應用于體內，通過殼聚糖微球的緩慢釋放 藥物的功能，延長負載促進骨修復的因子或蛋白的釋放時間，提高骨缺損的修復效果。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024] 圖1顯示殼聚糖微球（CM)的粒徑及形態，其中（a)表示光鏡下CM形態，（b)表示 電鏡下CM的形態，（c)表示CM的粒徑分布；
[0025] 圖2顯不骨水泥的XRD圖，其中（a)代表硫酸I丐骨水泥（CSC)，（b)代表殼聚糖微 球復合絲素基硫酸鈣（CM / SF / CS)骨水泥；
[0026] 圖3顯示物質的紅外光譜，其中（a)代表殼聚糖微球（CM)，（b)代表絲素（SF)，（c) 代表硫酸鈣骨水泥（CSC)，（d)代表殼聚糖微球復合絲素基硫酸鈣（CM / SF / CS)骨水泥；
[0027] 圖4顯示骨水泥的掃描電鏡，其中（a)代表硫酸鈣骨水泥（CSC)，（b)代表絲素基 硫酸鈣（SF / CS)骨水泥，（c)代表殼聚糖微球復合絲素基硫酸鈣（CM / SF / CS)骨水泥， (d)代表骨水泥內的殼聚糖微球（CM);
[0028] 圖5顯示含有不同濃度絲素溶液的SF / CS骨水泥的抗壓強度；
[0029] 圖6顯示含有不同比例殼聚糖微球的CM / SF / CS骨水泥的抗壓強度；
[0030] 圖7顯示CS、SF / CS和CM / SF / CS三種骨水泥的抗稀散性，其中（a)代表 lOmin，（b)代表 24h，（c)代表 48h ;
[0031] 圖8顯示CS、SF / CS、CM / SF / CS三種骨水泥的凝固時間。
【具體實施方式】
[0032] 通過參閱下述實施例可以更容易地了解本發明的內容，這些實施例只是為進一步 說明本發明，并不意味著限定本發明的范圍。
[0033] 實施例1殼聚糖微球的制備
[0034] 制備：米用乳化-化學交聯法制備殼聚糖微球，先將150mg殼聚糖粉末溶于 10ml2%v / V乙酸溶液中，制成1.5%w / V殼聚糖溶液，于250ml燒瓶中分別加入油相 液體石錯eOmlU^v / V的乳化劑Span-80,在2000r / min攪拌的同時逐滴加入已溶解 的I. 5% w / V殼聚糖溶液10ml，室溫攪拌2h。緩慢加入20g/L的三聚磷酸鈉（TPP)水溶 液50ml，繼續攪拌12h。將溶液1500r / min離心5min，沉淀物用石油醚、酒精和雙蒸水各 洗滌三遍，室溫下干燥后產物研磨成均勻的粉末，即可得殼聚糖微球。
[0035] 殼聚糖微球形態和粒徑的觀察：將殼聚糖微球粉末分散于蒸餾水中，在帶標尺的 光學顯微鏡下觀察微球的球形及分散性。將微球懸液滴于樣品臺，待干燥后用導電膠固定 后噴金，電壓為15kV，用掃描電鏡（SEM，FEI-Quanta250)觀察微球表面形態。將微球溶懸 浮于蒸餾水中，采用粒度分析儀（HELOS / CUVETTE濕法粒度儀）測定微球粒徑大小。
[0036] 結果：光鏡下觀察微球球形良好，分散均勻，粒徑大小一致，無黏連（圖la)。掃 描電鏡顯示微球的球形完整，表面光滑無皺褶（圖lb)。粒徑分析顯示微球粒徑集中在 5 μ m-30 μ m范圍內，平均為20. 28 μ m，分布較均勻（圖Ic)。
[0037] 殼聚糖微球溶脹率測定：采用殼聚糖微球的吸水能力RS表示[Liu LS.，et al.， Biomaterials，1999, 20 (12) : 1097-1108]。將質量為WD的微球置于PBS中室溫4h后取出， 置于與水平面成60°的玻璃平板上，2min后用吸水紙吸干多余水分，稱量WW，按下式計算 RS ：
[0038] RS= [(Wff-WD) / WD] X 100%
[0039] 結果：微球的溶脹率為77. 02% +5. 57%，吸水后重量增加，微球體積增大明顯。 [0040] 實施例2絲素蛋白溶液的制備
[0041] 將5g蠶絲放入2L含有100°C、0.02mol / L的碳酸鈉溶液中，30min后取出，用溫 水搓洗5遍，再用去離子水搓洗2遍以脫膠，放入45°C _55°C烘箱中烘干即得到脫膠的絲素 纖維。將絲素纖維放入9. 3mol / L的LiBr溶液（20% w / V)中，在60°C下恒溫磁力攪拌 4h，即得到棕黃色的SF-LiBr混合液。將SF-LiBr混合液倒入清潔的透析袋中，兩頭扎緊， 放入去離子水中透析三天，反復換水，經過濾獲得去鹽的絲素溶液。將去鹽絲素溶液放入透 析袋，再將透析袋放入高濃度的PEG溶液中濃縮12h，將濃縮后的絲素溶液裝入離心管中在 4°C，4950r / min離心lh，取上清液保存于4°C備用。
[0042] 實施例3SF / CS骨水泥和CM / SF / CS骨水泥的制備
[0043] 本實施例中各種骨水泥的制備按照表1的配方進行。
[0044] SF / CS骨水泥的制備：分別將3 % w / v、6 % w / v、9 % w / V的絲素溶液按 0.45:1的液固比1111/8與硫酸鈣在溫度為221：±11：，濕度為40%-60%的條件下混合， 將SF / CS調和物填注于柱形模具內（直徑為4. 6mm)。將所制得的樣品放置在37°C烘箱 中養護，48h后取出。
[0045] CM / SF / CS骨水泥的制備：分別制備殼聚糖微球含量為0. 1% w / w、0. 5% w / / W、5%w / w的硫酸鈣混合粉末，加入無水乙醇攪拌均勻后室溫揮發干燥，用瑪瑙 研缽研磨后備用。絲素溶液與混合骨水泥粉末按0.45 : 1的液固比ml / g調制均勻，待 其凝固。
[0046] 表1各組骨水泥中的成分比例
[0047]
【權利要求】
1. 一種殼聚糖微球復合絲素基硫酸鈣骨水泥，其特征在于，所述骨水泥由殼聚糖微球 和硫酸鈣組成的混合粉末與絲素溶液以1 : 0.45的固液比（g/ml)配制而成，所述混合粉 末中所述殼聚糖微球含量是〇. 1%W / W-1%W / W，所述硫酸|丐含量是99%w / W-99. 9% w / w〇
2. 根據權利要求1所述的殼聚糖微球復合絲素基硫酸鈣骨水泥，其特征在于，所述混 合粉末中所述殼聚糖微球含量是〇. 1% w / w-0. 5% w / w，所述硫酸興含量是99. 5% w / w-99. 9% w / w〇
3. 根據權利要求1所述的殼聚糖微球復合絲素基硫酸鈣骨水泥，其特征在于，所述絲 素溶液濃度為3% w / v-9% w / V。
4. 根據權利要求1所述的殼聚糖微球復合絲素基硫酸鈣骨水泥，其特征在于，所述絲 素蛋白溶液濃度為6% w / V。
5. -種權利要求1所述的殼聚糖微球復合絲素基硫酸鈣骨水泥的制備方法，其特征在 于，所述制備方法包括以下步驟： (1) 制備所述殼聚糖微球； (2) 從蠶絲中提取絲素，制成所述絲素溶液； (3) 將步驟（1)制備的所述殼聚糖微球與硫酸鈣粉末混合，混合粉末中所述殼聚糖微 球含量為〇? 1% W / W-1% w / W，所述硫酸|丐含量為99% w / W-99.9% w / W，然后按照 1 : 0.45的固液比g/ml加入步驟（2)中制備的所述絲素溶液，調制均勻；將上述混合物填 注于柱形模具內，放置在烘箱中養護。
6. 根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述殼聚糖藥物微球的制備方法包 括乳化-化學交聯法、噴霧干燥法、離子交聯法、沉淀/凝聚法。
7. 根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述殼聚糖微球采用所述乳化-化學 交聯法制備。
8. 根據權利要求6或7所述的制備方法，其特征在于，所述乳化-化學交聯法具體步驟 如下：先將殼聚糖粉末溶于乙酸溶液中，制成殼聚糖溶液，在燒瓶中分別加入油相液體石蠟 乳化劑Span-80,在攪拌同時逐滴加入已溶解的所述殼聚糖溶液，室溫攪拌。緩慢加入三聚 磷酸鈉水溶液，繼續攪拌。將混合溶液離心，所得沉淀物用石油醚、酒精和雙蒸水各洗滌三 遍，室溫干燥后產物研磨成均勻的粉末，即可得所述殼聚糖微球。
9. 根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述絲素溶液的制備方法如下：將蠶 絲放入碳酸鈉溶液中，一定時間后取出，先用溫水搓洗，再用去離子水搓洗以脫膠，放入烘 箱中烘干即得到脫膠的絲素纖維。將絲素纖維放入溴化鋰溶液中，恒溫磁力攪拌，即得到棕 黃色的絲素-溴化鋰混合液。將所述絲素-溴化鋰混合液倒入清潔的透析袋中，透析三天， 反復換水，經過濾獲得去鹽絲素溶液。再將去鹽絲素溶液裝入透析袋中放入高濃度的聚乙 烯醇溶液，濃縮，將所得的濃縮液裝入離心管中，離心，上清液即為所述絲素溶液的儲液。將 所述絲素溶液的儲液稀釋成不同濃度。
10. 根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述步驟⑶的操作如下：將所述 殼聚糖微球與所述硫酸粉末混合，所述混合粉末中含有〇. 1% w / W-l% W / W所述殼聚 糖微球和99% w / W-99. 9% w / W所述硫酸|丐，在所述混合粉末中加入無水乙醇攪拌均勻， 室溫揮發干燥，用瑪瑙研缽研磨后備用。將所述絲素溶液與所述硫酸鈣和所述殼聚糖微球 組成的所述混合粉末按0.45 : 1的液固比ml / g調制均勻，待凝固后即得到本發明的復 合骨水泥產品。
【文檔編號】C08L5/08GK104491930SQ201410107798
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年3月21日 優先權日:2014年3月21日
【發明者】楊惠林, 朱雪松, 皮斌, 王鵬, 王金寧, 陶云霞 申請人:蘇州大學附屬第一醫院