一種猴頭菌大分子量多糖及其制備方法
【專利摘要】本發明提供了一種猴頭菌大分子量多糖及其制備方法，其是通過水提醇沉、冷凍、溶解制備得到的。本發明猴頭菌大分子量多糖分子量大于100萬，且色素少，多糖含量大大提高，超過80%；對RAW264.7巨噬細胞株釋放NO有明顯地促進作用，從而可增強機體免疫力、抗腫瘤能力。
【專利說明】—種猴頭菌大分子量多糖及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及食藥用菌提取純化領域，具體地涉及一種猴頭菌大分子量多糖及其制備方法。
【背景技術】
[0002]猴頭菌(Hericium erinaceus)是一種食藥兩用菌，肉嫩味美,營養豐富。在古代，人們把它與鱉魚、海參、熊掌刺并列為“四大名菜”，并且有“山珍猴頭，海味燕窩”的美稱。文獻報道，猴頭菌具有抗潰瘍、抗炎癥、抗腫瘤、降血糖、抗衰老、抗突變、保肝等多方面的藥理作用。猴頭菌多糖作為猴頭菌中最重要的活性成分之一，具有增強機體免疫、抗腫瘤、抗氧化延緩衰老、抗炎癥等多種生物活性和藥理作用。
[0003]對猴頭菌多糖的研究，不同的學者、不同的品種、不同的提取分離純化方法，結果不同，但目前關于猴頭菌多糖的研究主要集中在分子量1-1OKDa部分，對其中大分子量部分研究較少，且分離純化方法普遍采用水提醇沉、離子交換、樹脂脫色、凝膠柱純化等方法，得到的多糖純度雖高，但操作過程復雜，耗時長，且得率非常低，不利于規模化生產應用。
【發明內容】
[0004]本發明首先提供了一種猴頭菌大分子量多糖，其是通過如下方法制備得到的:
[0005]①水提醇沉:將猴頭菌的沸水提取液，濃縮，添加無水乙醇至乙醇質量百分比含量達到50-70%，4°C靜置過夜，離心收集沉淀；
[0006]②冷凍:將上述沉淀加水溶解后，溶液置于-20~_70°C冷凍，得到冷凍液；
[0007]③溶解:將步驟②得到的冷凍液于70-100°C水浴加熱解凍，離心收集沉淀；即為猴頭菌大分子量多糖。
[0008]優選的，本發明的猴頭菌大分子量多糖可通過如下方法制備得到:
[0009]①水提醇沉:將猴頭菌的沸水提取液，濃縮，添加無水乙醇至乙醇質量百分比含量達到50-70%，4°C靜置過夜，離心收集沉淀；
[0010]②冷凍:將上述沉淀加水溶解后，溶液置于-20~-70°c冷凍，得到冷凍液；
[0011]③溶解:將步驟②得到的冷凍液于70_100°C水浴加熱解凍，離心收集沉淀；
[0012]④將步驟③得到的沉淀用水稀釋后，添加無水乙醇至乙醇質量百分比濃度達到20-30%,離心收集沉淀，再用質量百分比濃度為20-30%的乙醇溶液洗滌沉淀2-5次，收集沉淀；將沉淀加水溶解后揮去殘留乙醇，冷凍干燥即得到猴頭菌大分子量多糖。
[0013]具體的說，本發明的高純度猴頭菌大分子量多糖，是用如下方法制備得到的:
[0014]①水提醇沉:將新鮮猴頭菌的沸水提取液，過濾，濾液減壓濃縮至可溶性固形物含量為18° Brix，冷卻至室溫后，添加無水乙醇至乙醇質量百分比含量為50-70%，4°C靜置過夜，10000g，離心15min收集沉淀；
[0015]②冷凍:將上述沉淀加水溶解后，離心去除雜質，上清液置于-20~_70°C冷凍過夜，得到冷凍液；[0016]③溶解:將步驟②中得到的冷凍液置于70-100°C水浴加熱解凍，離心，收集沉淀，即為猴頭菌大分子量多糖。
[0017]進一步優選的，本發明的猴頭菌大分子量多糖是通過如下方法制備得到的:
[0018]①水提醇沉:將新鮮猴頭菌的沸水提取液，過濾，濾液減壓濃縮至可溶性固形物含量為18° Brix，冷卻至室溫后，添加無水乙醇至乙醇質量百分比含量為50-70%，4°C靜置過夜，lOOOOg，離心15min收集沉淀；
[0019]②冷凍:將上述沉淀加水溶解后，離心去除雜質，上清液置于-20~-70°C冷凍過夜，得到冷凍液；
[0020]③溶解:將步驟②中得到的冷凍液置于70_100°C水浴加熱解凍，離心，收集沉淀；
[0021]④將步驟③得到的沉淀用水稀釋溶解至可溶性固形物含量為1.0° Brix后，添加無水乙醇至乙醇質量百分比濃度達到20-30%，4°C靜置過夜，lOOOOg，離心15min收集沉淀，沉淀用重量百分比濃度為20-30%的乙醇溶液洗滌3-5次，收集沉淀；沉淀加水溶解后揮去殘留乙醇，冷凍干燥即得到猴頭菌大分子量多糖。
[0022]本發明還提供了制備上述猴頭菌大分子量多糖的方法，該方法為:
[0023]①水提醇沉:將猴頭菌的沸水提取液，濃縮，添加無水乙醇至乙醇質量百分比含量達到50-70%，4°C靜置過夜，離心收集沉淀；
[0024]②冷凍:將上述沉淀加水溶解后，溶液置于-20~_70°C冷凍，得到冷凍液；
[0025]③溶解:將步驟②得到的冷凍液于70-100°C水浴加熱解凍，離心收集沉淀，即為猴頭菌大分子量多糖。
`[0026]本發明制備的猴頭菌大分子量多糖分子量大，且色素少，多糖含量大大提高，超過80%。且本發明提供的制備方法簡便、快速、高效、成本低、綠色環保，適用于規模化生產的應用。并且本發明制備的猴頭菇大分子量多糖對RAW264.7巨噬細胞株釋放NO有明顯地促進作用，從而增強機體免疫力、抗腫瘤能力。
【具體實施方式】
[0027]本發明使用的猴頭菌由上海市農業科學院食用菌所(上海國森生物科技有限公司栽培，菌株編號:H0605)提供；
[0028]本發明使用的無水乙醇購于國藥集團化學試劑有限公司
[0029]實施例1
[0030]1.水提醇沉:以猴頭菌成熟期新鮮子實體為原料，切成約2cm碎塊，稱取2kg原料沸水提取后，提取液用200目濾網過濾后，4000rpm，30min離心收集上清，減壓濃縮至可溶性固形物含量為18° Brix (其中的可溶性固形物采用手持式數顯糖度計測定。)，冷卻至室溫后添加無水乙醇至乙醇質量百分比含量為70%，4°C靜置過夜，lOOOOg，離心15min收集沉淀。
[0031]2.冷凍:將上述沉淀加水溶解后，lOOOOg，離心15min去除雜質，上清置于-20°C冷凍。3.溶解:將上述冷凍液置于80°C水浴加熱解凍，lOOOOg，離心20min收集沉淀；
[0032]4.乙醇沉淀及洗滌:將上述沉淀用水溶解稀釋至可溶性固形物含量為1.0° Brix后，添加無水乙醇至乙醇質量百分比濃度達到20%，4°C靜置過夜，lOOOOg，離心15min收集沉淀，沉淀用20%乙醇洗滌3次，收集沉淀。[0033]5.冷凍干燥:上述沉淀加水溶解后揮去殘留乙醇，冷凍干燥即獲得猴頭菌大分子
量多糖。
[0034]多糖含量檢測:采用苯酚-硫酸法。
[0035]分子量測定:采用HPLC法。
[0036]經測定制備的猴頭菌多糖的多糖含量為79.6%，分子量325KDa。
[0037]實施例2
[0038]1.水提醇沉:以猴頭菌成熟期新鮮子實體為原料，切成約2cm碎塊，稱取Ikg原料沸水提取后，提取液用200目濾網過濾后，4000rpm，30min離心收集上清，減壓濃縮至可溶性固形物含量為18° Brix，冷卻至室溫后添加無水乙醇至乙醇質量百分比濃度為60%，4°C靜置過夜，lOOOOg，離心15min收集沉淀。
[0039]2.冷凍:將上述沉淀加水溶解后，lOOOOg，離心15min去除雜質，上清置于_20°C冷凍。
[0040]3.溶解:將上述冷凍液置于100°C水浴加熱解凍，1000Og,離心20min收集沉淀；
[0041]4.乙醇沉淀及洗滌:將上述沉淀用水溶解稀釋至可溶性固形物含量為1.0° Brix后，添加無水乙醇至乙醇質量百分比濃度為20%，4°C靜置過夜，lOOOOg，離心15min收集沉淀，沉淀用20%乙醇洗滌5次。
[0042]5.冷凍干 燥:沉淀加水溶解后揮去殘留乙醇，冷凍干燥即獲得猴頭菌大分子量多糖。
[0043]多糖含量檢測:采用苯酚-硫酸法。
[0044]分子量測定:采用HPLC法。
[0045]經測定制備的猴頭菌多糖的多糖含量為81.1%，分子量312KDa。
[0046]實施例3
[0047]體外刺激巨噬細胞釋放NO活性測定
[0048]本實施例中RAW264.7骨髓巨噬細胞株，購自美國國家菌種保藏中心(ATCC numberTIB-71?)；
[0049]本實施例中DMEM、RPMI1640購于GIBCO公司。
[0050]供試樣品的配制
[0051]精確稱取實例1、2制備的猴頭菌多糖樣品于滅菌的印pendorf管中，用PBS緩沖液配置成濃度5mg/mL。充分溶解后以12000rpm/min離心30min,無菌條件下轉移至新的無菌印pendorf管中，將樣品稀釋成終濃度50、200、500 μ g/mL待用。陰性對照為PBS緩沖液，陽性對照為10 μ g/mL LPS溶液。
[0052]小鼠RAW264.7巨噬細胞的制備
[0053]用DMEM培養基在37 °C、5%C02條件下傳代培養后，用0.25%胰蛋白酶消化，混懸液300 X g離心3min后收集細胞，用無色RPMI1640培養基將細胞稀釋到一定濃度備用。
[0054]巨噬細胞釋放NO活性的測定
[0055]由于NO極不穩定，在體內很快生成亞硝酸基(N02—)和硝酸基(N03—)，故采用Griess法測定樣品中的N027N03—作為衡量NO水平的指標。
[0056]( I)用亞硝酸鈉制標準曲線:
[0057]配成不同濃度的亞硝酸鈉溶液，濃度梯度為0、5、10、15、20、25、30、35、40μΜ共9個濃度梯度；取IOOyL于96孔板，加入50μ L Griess試劑，測定543nm吸光值，標準曲線每個濃度3個重復，繪制標準曲線。
[0058](2) NO產量測定
[0059]巨噬細胞的培養液消化完畢后用無色RPMI1640培養基(含10%胎牛血清、1%抗生素液體)將細胞稀釋至5 X 105/ml，每孔180 μ L加入96孔板，然后再加入20 μ L各濃度待測樣品和陰性(PBS)、陽性(LPS，10 μ g/mL)對照，于37°C、含5%的C02條件下培養48h后，取100 μ L培養上清于96孔板，加入50 μ L Griess試劑，顯色IOmin后，于波長543nm處測定吸光度，根據標準曲線計算相應的NO量。
[0060]實驗結果:
[0061]實施例1、2制備的猴頭菌多糖在濃度50 μ g/mL時，刺激巨噬細胞產生NO的量(單位:μ moL/5.0X 105cells)分別為:56.61、58.32 ;在濃度 200 μ g/mL 時，產生 NO 量分別為74.65、75.72 ;在濃度500 μ g/mL時，產生NO量分別為80.89、81.22，陰性對照為8.84，陽性對照為(終濃度I μ g/mL) 70.18，本發明制備的猴頭菌多糖顯著高于陰性對照組活性，多糖在200 μ g/mL時活性高于陽性對照LPS，表現出良好的促進RAW264.7巨噬細胞株釋放NO活性，從而增強機體免疫力、抗腫瘤能力。`
【權利要求】
1.一種猴頭菌大分子量多糖，其特征在于其是通過如下方法制備得到的: ①水提醇沉:將猴頭菌的沸水提取液，濃縮，添加無水乙醇至乙醇質量百分比含量達到50-70%，4°C靜置過夜，離心收集沉淀； ②冷凍:將上述沉淀加水溶解后，溶液置于-20~_70°C冷凍，得到冷凍液； ③溶解:將步驟②得到的冷凍液于70-100°C水浴加熱解凍，離心收集沉淀，即為猴頭菌大分子量多糖。
2.根據權利要求1所述的猴頭菌大分子量多糖，其特征在于其是通過如下方法制備得到的: ①水提醇沉:將猴頭菌的沸水提取液，濃縮，添加無水乙醇至乙醇質量百分比含量達到50-70%，4°C靜置過夜，離心收集沉淀； ②冷凍:將上述沉淀加水溶解后，溶液置于-20~_70°C冷凍，得到冷凍液； ③溶解:將步驟②得到的冷凍液于70-100°C水浴加熱解凍，離心收集沉淀； ④將步驟③得到的沉淀用水稀釋后，添加無水乙醇至乙醇質量百分比濃度達到20-30%,離心收集沉淀，再用質量百分比濃度為20-30%的乙醇溶液洗滌沉淀2-5次，收集沉淀；將沉淀加水溶解后揮去殘留乙醇，冷凍干燥即得到猴頭菌大分子量多糖。
3.根據權利要求1所述的猴頭菌大分子量多糖，其特征在于其是通過如下方法制備得到的: ①水提醇沉:將新鮮猴頭菌的沸水提取液，過濾，濾液減壓濃縮至可溶性固形物含量為18° Brix，冷卻至室溫后，添加無水乙醇至乙醇質量百分比含量為50-70%，4°C靜置過夜，lOOOOg，離心15min收集沉淀；` ②冷凍:將上述沉淀加水溶解后，離心去除雜質，上清液置于-20~-70°C冷凍過夜，得到冷凍液； ③溶解:將步驟②中得到的冷凍液置于70-100°C水浴加熱解凍，離心，收集沉淀，即為猴頭菌大分子量多糖。
4.根據權利要求2所述的猴頭菌大分子量多糖，其特征在于其是通過如下方法制備得到的: ①水提醇沉:將新鮮猴頭菌的沸水提取液，過濾，濾液減壓濃縮至可溶性固形物含量為18° Brix，冷卻至室溫后，添加無水乙醇至乙醇質量百分比含量為50-70%，4°C靜置過夜，lOOOOg，離心15min收集沉淀； ②冷凍:將上述沉淀加水溶解后，離心去除雜質，上清液置于-20~-70°C冷凍過夜，得到冷凍液； ③溶解:將步驟②中得到的冷凍液置于70-100°C水浴加熱解凍，離心，收集沉淀； ④將步驟③得到的沉淀用水稀釋溶解至可溶性固形物含量為1.0°Brix后，添加無水乙醇至乙醇質量百分比濃度達到20-30%，4°C靜置過夜，lOOOOg，離心15min收集沉淀，沉淀用重量百分比濃度為20-30%的乙醇溶液洗滌3-5次，收集沉淀；沉淀加水溶解后揮去殘留乙醇，冷凍干燥即得到猴頭菌大分子量多糖。
5.一種制備權利要求1-4任一項所述猴頭菌大分子量多糖的方法,其特征在于該方法包括如下步驟: ①水提醇沉:將猴頭菌的沸水提取液，濃縮，添加無水乙醇至乙醇質量百分比含量達到50-70%，4°C靜置過夜，離心收集沉淀； ②冷凍:將上述沉淀加水溶解后，溶液置于-20~_70°C冷凍，得到冷凍液； ③溶解:將步驟②得到的冷凍液于70-100°C水浴加熱解凍，離心收集沉淀，即為猴頭菌大分子量 多糖。
【文檔編號】C08B37/00GK103819576SQ201410103882
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月19日 優先權日:2014年3月19日
【發明者】吳迪, 楊焱, 唐川, 劉艷芳, 張勁松, 汪雯翰, 顏夢秋, 唐慶九, 唐傳紅, 馮娜, 周帥, 賈薇, 張忠, 馮杰 申請人:上海市農業科學院