魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖及其制備方法、用途
【專利摘要】本發明涉及一種魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖及其制備方法、用途，屬于高分子化學材料領域。本發明的魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖是將殼聚糖在酸性條件下溶解后，與魚鱗膠原蛋白溶液在催化劑轉谷氨酰胺酶的作用下得到。本發明反應條件溫和，環境友好，工藝簡單。制得的水溶性魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖具有良好的吸濕保濕性、抗氧化性、促進成纖維細胞增殖的性能。
【專利說明】魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖及其制備方法、用途
【技術領域】
[0001]本發明屬高分子化學材料領域，具體涉及一種魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖及其制備方法、用途。
【背景技術】
[0002]殼聚糖是自然界廣泛存在的幾丁質經過脫乙酰作用得到的，具有良好的生物相容性，生物黏附性和多種生物活性，無毒無免疫原性、生物降解性等優良性質，這種天然高分子在生物醫藥行業得到了廣泛的應用。
[0003]膠原蛋白是細胞外基質中最重要的組成部分，是哺乳動物體內含量最豐富的蛋白質，真皮組織中約70%的成分是膠原，它具有良好的生物相容性和細胞親和性，有利于細胞的粘著與生長，可促進創傷愈合，是修復各損傷組織的重要原料物質。魚鱗膠原蛋白含有大量的活性基團，如羥基、氨基和酰胺基等，分子量大約在3000，其肽鏈長度約為30-50納米，易被人體直接吸收，具有獨特的吸濕保濕性，外可阻止陽光對皮膚的傷害，內可預防游離基對皮膚的摧毀。
[0004]本發明以轉谷氨酰胺酶為催化劑，催化魚鱗膠原蛋白和殼聚糖合成以酰胺鍵連接的魚鱗膠原蛋白-殼聚糖改性物。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是提供一種水溶性魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖改性物的制備方法及其用途。
[0006]本發明解決其技術問題采用以下的技術方案:
[0007]本發明提供的魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖，其特征在于:它是以魚鱗膠原蛋白和殼聚糖為底物，轉谷氨酰胺酶為催化劑催化合成得到的。
[0008]按上述方案，所述的魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖中氨基被魚鱗膠原蛋白取代的取代度為 0.259-0.660。
[0009]本發明提供的上述魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖，其制備方法包括:殼聚糖在醋酸溶液中溶解后，加入預先在磷酸緩沖溶液中溶解的魚鱗膠原蛋白，在20-60°C下加入轉谷氨酰胺酶進行催化接枝反應后，再進行后處理。
[0010]按上述反應,所述的魚鱗膠原蛋白和殼聚糖的質量比為(0.6-1.4):1.0。
[0011]按上述方案，所述醋酸溶液的pH為5.7-6.0，磷酸緩沖溶液的pH為5.7-6.0，兩者混合時維持混合液pH為5.7-6.0。
[0012]按上述方案，所述殼聚糖與醋酸溶液比例為1.0g:(25-50)ml ;魚鱗膠原蛋白與磷酸緩沖溶液的比 例為(0.6-1.4) g:25ml。
[0013]按上述反應，所述的轉谷氨酰胺酶是粗制轉谷氨酰胺酶經純化后冷凍干燥制得。
[0014]按上述反應，所述的轉谷氨酰胺酶和殼聚糖的質量比為(0.06-0.24):1.0。
[0015]按上述反應，所述的催化接枝反應是在pH為5.7-6.0的條件下反應0.5-4.0小時。
[0016]按上述反應，所述的后處理是將產物煮沸IOmin后，經抽濾、透析、冷凍干燥。
[0017]本發明的有益效果:本發明以轉谷氨酰胺酶為催化劑，催化魚鱗膠原蛋白和殼聚糖合成以酰胺鍵連接的魚鱗膠原蛋白-殼聚糖改性物，解決了傳統化學交聯劑合成帶來的有毒副反應，酶催化反應進行條件溫和，環境友好，工藝簡單；制得的可溶性魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖具有良好的吸濕保濕性、抗氧化性、并能促進成纖維細胞增殖。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為實施例2制備的膠原蛋白接枝殼聚糖和殼聚糖的紅外圖譜；
[0019]圖2為實施例1-4制備的膠原蛋白接枝殼聚糖對過氧化氫的清除率；
[0020]圖3為實施例1-4制備的膠原蛋白接枝殼聚糖對DPPH的清除率；
[0021]圖4為實施例2-5制備的膠原蛋白接枝殼聚糖對L929大鼠成纖維細胞的存活率；
[0022]圖5為實施例3制備的膠原蛋白接枝殼聚糖對L929大鼠成纖維細胞倒置顯微鏡觀察圖像。
[0023]其中，附圖2-4中的取代度分別對應相應的實施例，取代度0.259代表實施例1，取代度0.409代表實施例2，取代度0.486代表實施例3，取代度0.568代表實施例4，取代度0.660代表實施例5 'Ne代 表維生素C。
【具體實施方式】
[0024]下面結合實施例進一步說明本申請之發明，但實施例不應視作對本發明權利的限定。
[0025]實施例1
[0026]魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖，其制備方法如下:
[0027](I)配制pH為5.7的醋酸溶液，量取50ml醋酸溶液至三口燒瓶中，加入1.0g殼聚糖，使其充分溶解；配制pH為5.7的磷酸緩沖溶液，將0.6g魚鱗膠原蛋白溶解于25ml磷酸緩沖溶液中；
[0028](2)催化接枝:在步驟(1)所得的殼聚糖醋酸溶液中，依次加入步驟(1)所得的魚鱗膠原蛋白緩沖溶液和0.22g轉谷氨酰胺酶，在20°C下磁力攪拌2小時；
[0029](3)后處理:將步驟(2)反應得到的溶液繼續升溫至100°C，并磁力攪拌IOmin后，經抽濾，透析三天純化，冷凍干燥后得到魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖。
[0030]經測定:該魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖中氨基基團被魚鱗膠原蛋白取代的取代度為0.259。該魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖紅外表征的紅外圖譜見圖1，圖中:在1654CHT1和1545CHT1處出現的吸收峰，分別歸屬于酰胺I帶和酰胺II帶，說明魚鱗膠原蛋白中酰胺基已成功接枝到殼聚糖的氨基上，得到以酰胺鍵連接的魚鱗膠原蛋白-殼聚糖共聚物。
[0031]實施例2
[0032]魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖，其制備方法如下:
[0033](I)配制pH為6.0的醋酸溶液，量取50ml醋酸溶液至三口燒瓶中，加入1.0g殼聚糖，使其充分溶解；配制pH為6.0的磷酸緩沖溶液，將0.6g魚鱗膠原蛋白溶解于25ml磷酸緩沖溶液中；[0034](2)催化接枝:在步驟(1)所得的殼聚糖醋酸溶液中，依次加入步驟(1)所得的魚鱗膠原蛋白緩沖溶液和0.06g轉谷氨酰胺酶，在30°C下磁力攪拌3小時；
[0035](3)后處理:將步驟(2)反應得到的溶液繼續升溫至100°C，并磁力攪拌IOmin后，經抽濾，透析三天純化，冷凍干燥后得到魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖。
[0036]經測定:該魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖中氨基基團被魚鱗膠原蛋白取代的取代度為0.409。
[0037]實施例3
[0038]魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖，其制備方法如下:
[0039](I)配制pH為6.0的醋酸溶液，量取25ml醋酸溶液至三口燒瓶中，加入1.0g殼聚糖，使其充分溶解；配制pH為6.0的磷酸緩沖溶液，將1.4g魚鱗膠原蛋白溶解于25ml磷酸緩沖溶液中；
[0040](2)催化接枝:在步驟(1)所得的殼聚糖醋酸溶液中，依次加入步驟(1)所得的魚鱗膠原蛋白緩沖溶液和0.1g轉谷氨酰胺酶，在50°C下磁力攪拌4小時；
[0041](3)后處理:將步驟(2)反應得到的溶液繼續升溫至100°C，并磁力攪拌IOmin后，經抽濾，透析三天純化，冷凍干燥后得到魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖。
[0042]經測定:該魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖中氨基基團被魚鱗膠原蛋白取代的取代度為0.486。
[0043]實施例4`[0044]魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖，其制備方法如下:
[0045](I)配制pH為5.7的醋酸溶液，量取25ml醋酸溶液至三口燒瓶中，加入1.0g殼聚糖，使其充分溶解；配制pH為5.7的磷酸緩沖溶液，將1.4g魚鱗膠原蛋白溶解于25ml磷酸緩沖溶液中；
[0046](2)催化接枝:在步驟(1)所得的殼聚糖醋酸溶液中，依次加入步驟(1)所得的魚鱗膠原蛋白緩沖溶液和0.1g轉谷氨酰胺酶，在40°C下磁力攪拌0.5小時；
[0047](3)后處理:將步驟(2)反應得到的溶液繼續升溫至100°C，并磁力攪拌IOmin后，經抽濾，透析三天純化，冷凍干燥后得到魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖。
[0048]經測定:該魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖中氨基基團被魚鱗膠原蛋白取代的取代度為0.568ο
[0049]實施例5
[0050]魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖，其制備方法如下:
[0051 ] (I)配制pH為6.0的醋酸溶液，量取50ml醋酸溶液至三口燒瓶中，加入1.0g殼聚糖，使其充分溶解；配制pH為6.0的磷酸緩沖溶液，將1.0g魚鱗膠原蛋白溶解于25ml磷酸緩沖溶液中；
[0052](2)催化接枝:在步驟(1)所得的殼聚糖醋酸溶液中，依次加入步驟(1)所得的魚鱗膠原蛋白緩沖溶液和0.14g轉谷氨酰胺酶，在40°C下磁力攪拌I小時；
[0053](3)后處理:將步驟(2)反應得到的溶液繼續升溫至100°C，并磁力攪拌IOmin后，經抽濾，透析三天純化，冷凍干燥后得到魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖。
[0054]經測定:該魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖中氨基基團被魚鱗膠原蛋白取代的取代度為0.660ο[0055]將上述各實施例制備的魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖進行如下性能表征:
[0056](I)吸濕性實驗:精確稱取0.5g實施例1、2、5制備的魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖各兩份，分別加入直徑3cm的稱量瓶中，將稱量瓶分別放置在兩個干燥器中，一個干燥器內放有硫酸銨飽和溶液(相對濕度RH=81%)，另一個干燥器內放有飽和碳酸鈉溶液(RH=43%)，放置時間為24h，分別稱量樣品放置前質量(Wtl)和放置后質量(Wn)。根據下式計算吸濕率:
[0057]
【權利要求】
1.魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖，其特征在于:它是以魚鱗膠原蛋白和殼聚糖為底物，轉谷氨酰胺酶為催化劑催化接枝得到的。
2.根據權利要求1所述的魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖，其特征在于:所述魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖中氨基被魚鱗膠原蛋白取代的取代度為0.259-0.660。
3.根據權利要求1或2所述的任意一種魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖的制備方法，其特征在于:它是先將殼聚糖溶于醋酸溶液中，與魚鱗膠原蛋白溶液在轉谷氨酰胺酶的作用下，進行接枝反應，并進行后處理。
4.根據權利要求3所述的魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖的制備方法，其特征在于:所述的接枝反應是在PH為5.7-6.0的條件下，將殼聚糖溶液與魚鱗膠原蛋白溶液在20-60°C反應0.5-4.0 小時。
5.根據權利要求3所述的魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖的制備方法，其特征在于:殼聚糖溶解于PH為5.7-6.0的醋酸溶液中，殼聚糖與醋酸溶液比例為l.0g:(25-50) ml ;魚鱗膠原蛋白溶解于pH為5.7-6.0的磷酸鹽緩沖溶液中，魚鱗膠原蛋白與磷酸鹽緩沖溶液的比例為(0.6-1.4) g:25ml
6.根據權利要求3所述的魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖的制備方法，其特征在于:所述的轉谷氨酰胺酶是粗制轉谷氨酰胺酶經純化后冷凍干燥制得。
7.根據權利要求3所述的魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖的制備方法，其特征在于:所述后處理是將接枝反應的產物煮沸lOmin，經抽濾、透析后冷凍干燥。
8.根據權利要求4所述的魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖的制備方法，其特征在于:魚鱗膠原蛋白和殼聚糖的質量比為 (0.6-1.4):1.0。
9.根據權利要求4所述的魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖的制備方法，其特征在于:轉谷氨酰胺酶和殼聚糖的質量比為(0.06-0.24):1.0。
10.權利要求1-9中任意一項權利要求所述的魚鱗膠原蛋白接枝殼聚糖有促進傷口愈合的作用。
【文檔編號】C08H1/00GK103819685SQ201410086650
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月11日 優先權日:2014年3月11日
【發明者】樊李紅, 吳歡, 王坦, 彭敏, 周瀟宇 申請人:武漢理工大學