絲膠蛋白水凝膠的制備方法及其應用的制作方法

絲膠蛋白水凝膠的制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種絲膠蛋白水凝膠的制備方法，該方法首先稱取家蠶絲素缺失型突變品種蠶繭，經過LiBr或LiCl提取，透析純化得到非降解的質量百分濃度為0.1～4％的絲膠蛋白水溶液；然后將絲膠蛋白水溶液濃縮至1.5～10.0％，向濃縮后的絲膠蛋白水溶液中加入交聯劑（每1mL絲膠蛋白水溶液加入2～500μL的交聯劑），充分混勻后置于4～45℃下5秒～36小時，得到水凝膠。該水凝膠具有生物活性和多功能性，可作為搭載生長因子，藥物以及細胞載體，可應用于多種軟組織損傷的修復和疾病的治療，包括但不限于皮膚損傷，肌肉損傷，血管損傷，神經損傷，心肌損傷等。
【專利說明】絲膠蛋白水凝膠的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫用復合材料領域，具體地指一種絲膠蛋白水凝膠的制備方法及其應用。該水凝膠具有生物活性和多功能性，可作為生長因子，藥物以及細胞的載體，可應用于多種軟組織損傷的修復和疾病的治療，包括但不限于皮膚損傷，肌肉損傷，血管損傷，神經損傷，心肌損傷等。
【背景技術】
[0002]水凝膠是一種能夠在水中溶脹、保持大量水分的三維網狀聚合物。水凝膠作為一類重要的生物材料具有可膨脹和保持大量水分的特性，已被廣泛地應用于生物醫藥和組織工程領域。其中一類水凝膠由天然生物材料(如膠原、海藻酸鹽和殼聚糖等)制備，這類水凝膠因為擁有與機體高度相似的理化特性和優越的生物學性能而備受青睞。近年來利用天然生物材料研發新型水凝膠是組織工程領域的重要課題和熱點問題。
[0003]絲膠蛋白(Silk Sericin)是包裹在絲素纖維表層的一種天然大分子粘性蛋白，約占蠶繭含量的20~30% ，由分子量為24~400kDa的多肽組成，其分子由絲氨酸、天門冬氨酸和甘氨酸等18種氨基酸組成。長期以來由于人們對絲膠蛋白認識的不足和研究的局限性，導致絲膠在繅絲工業中被當作廢物處理，浪費了大量寶貴的天然資源。近年來人們發現絲膠蛋白具有保濕、抗菌、抗氧化、抗凝血以及促進細胞粘附和增殖等生物特性。不僅如此，絲膠具有親水性和可降解性，是理想的生物醫用材料。已有的報道顯示絲膠常用于與其他材料(如彈性蛋白，聚乙烯醇等)共聚或簡單交聯，混合制作生物支架以獲得性能優良的生物材料。而單純用絲膠蛋白制作的生物材料仍僅限于性質脆弱的二維絲膠蛋白膜，真正意義上的三維純絲膠蛋白水凝膠依然難以實現。主要原因在于傳統絲膠蛋白分離方法(如高溫法，堿法)易導致絲膠蛋白降解，而降解的絲膠蛋白分子量較小，物理性質脆弱，水溶性高，難以制作(包括交聯)成水凝膠。大大制約了絲膠蛋白在組織工程中的應用。因此研發具有高生物相容性，優良力學性能和高穩定性的純絲膠蛋白水凝膠，充分發揮絲膠蛋白在組織工程學中的應用，具有重要的社會意義和廣闊的應用前景。所以能否成功制備具有三維結構的純絲膠水凝膠并將其應用于生物醫學領域是十分值得研究的重要課題。
[0004]本發明以家蠶絲素缺失型突變品種蠶繭采用溴化鋰提取法成功提取純絲膠蛋白，并首次利用化學共價鍵交聯的方式，成功地制備了具有熒光特性，可注射的純絲膠蛋白水凝膠。該絲膠蛋白水凝膠具有良好的生物相容性，細胞粘附性和優異的機械性能。該絲膠蛋白水凝膠自身的熒光特性，可用于體內實時跟蹤和成像。
[0005]該三維純絲膠蛋白水凝膠具有生物活性和多功能性，可作為生長因子，藥物以及細胞的載體，可應用于多種軟組織損傷的修復和疾病的治療，包括但不限于皮膚損傷，肌肉損傷，血管損傷，神經損傷，心肌損傷等。

【發明內容】

[0006]本發明所要解決的技術問題就是提供一種絲膠蛋白水凝膠的制備方法及其應用。本發明以家蠶絲素缺失型突變品種蠶繭(購于中國農業科學院蠶業研究所，該類品種資源保存于中國農業科學院蠶業研究所國家蠶資源保存中心)作為原材料，經過提取純化得到絲膠蛋白水溶液，使用化學交聯劑(醛類、京尼平)交聯，制備具有細胞相容性和細胞粘附性，高交聯率，凝膠快速，機械性能好，性質穩定且具有熒光特性的水凝膠。該材料是一種新型生物材料，可作為生長因子，藥物以及細胞的載體，能夠應用于多種軟組織損傷的修復和疾病的治療，包括但不限于皮膚損傷，肌肉損傷，血管損傷，神經損傷，心肌損傷等。
[0007]為解決上述技術問題，本發明提供的一種絲膠蛋白水凝膠的制備方法，包括以下步驟:
[0008]I)稱取家蠶絲素缺失型突變品種蠶繭，經過LiBr或LiCl水溶液提取，透析純化得到非降解性的質量百分濃度為0.1~4%的絲膠蛋白水溶液；
[0009]2)將步驟I)中得到的絲膠蛋白水溶液濃縮成為質量百分濃度為1.5~10.0%的溶液，向濃縮后的絲膠蛋白水溶液中加入交聯劑(每ImL絲膠蛋白水溶液加入2~IOOyL的交聯劑)，充分混勻后置于4~45°C下反應5秒~36小時，得到水凝膠。
[0010]進一步地，所述交聯劑為戊二醛、丙二醛或京尼平中的任意一種。
[0011]再進一步地，所述交聯劑的質量百分濃度為0.1~25%。
[0012]再進一步地，所述步驟I)中，絲膠蛋白水溶液的制備方法，包括以下步驟:
[0013]I)稱取家蠶絲素缺失型突變品種蠶繭，并將其剪成碎片，用水清洗，去除水份，備用；
[0014]2)將步驟I)的蠶繭碎片浸泡于濃度為6~8mol/L的LiBr或LiCl水溶液中(每克蠶繭碎片加入20~100mL6~8mol/L的Lifc或LiCl水溶液)，置于25~50°C，5~24小時；
[0015]3)然后將步驟2)中得到的溶液離心，分離去除不溶性物質，得到澄清溶液；
[0016]4)向步驟3)得到的澄清溶液中加入四分之一體積lmol/L、pH8.0~11.0的Tris-HCl緩沖液，并在超純水中透析，得到絲膠蛋白水溶液；
[0017]5)將步驟4)得到絲膠蛋白水溶液離心去除沉淀，濃縮得到質量百分濃度為1.5~10%的絲膠液絲膠蛋白水溶液，置于冰箱保存備用；
[0018]作為優選方案，絲膠蛋白水凝膠的制備方法，包括以下步驟:
[0019]I)稱取家蠶絲素缺失型突變品種蠶繭，并將其剪成Icm2碎片，清洗3次，去除水份，備用；
[0020]2)將步驟I)的蠶繭碎片浸泡于濃度為6mol/L的LiBr水溶液中(每克蠶繭碎片加入40mL的LiBr水溶液)充分浸泡后，置于35°C水浴24小時，溶解絲膠蛋白；
[0021]3)然后將步驟2)中的溶液在3500rpm離心，分離去除不溶性物質，得到澄清的溶液；
[0022]4)向步驟3)得到的澄清溶液中加入四分之一體積lmol/L，pH9.0的Tris-HCl緩沖液，并將其進行透析，得到絲膠蛋白水溶液，
[0023]5)將步驟4)得到絲膠蛋白水溶液離心去除沉淀，濃縮得到質量百分濃度為1.5~10%的絲膠蛋白水溶液，置于4°C保存備用；
[0024]6)將上述得到的絲膠蛋白水溶液中加入戊二醛(按每ImL絲膠蛋白水溶液加入2~100 μ L質量百分濃度為25%的戊二醛)，充分混勻后置于37°C 5分鐘，得到水凝膠。[0025]本發明還提供了一種絲膠蛋白水凝膠在生物醫用材料中的應用。該絲膠蛋白水凝膠可用于以下方面:
[0026]I)該絲膠蛋白水凝膠應用于多種損傷修復及疾病的治療，包括但不限于血管、表皮、肌肉、皮膚和神經組織損傷的修復；
[0027]2)該絲膠蛋白水凝膠結合工具細胞包裝相應的治療因子應用于組織修復；
[0028]3)該絲膠蛋白水凝膠可作為生長因子、藥物以及細胞的載體。
[0029]本發明還提供了一種絲膠蛋白凍干支架的制備方法，包括以下步驟:
[0030]I)將上述得到的絲膠蛋白水凝膠置于零度以下冷凍；
[0031]2)將冷凍的絲膠蛋白水凝膠真空冷凍干燥，得到絲膠蛋白凍干支架。
[0032]本發明還提供了一種絲膠蛋白凍干支架在生物醫用材料中的應用。
[0033]本發明還提供了一種絲膠蛋白水凝膠在熒光標記探針材料中的應用。
[0034]本發明還提供了一種絲膠蛋白水凝膠以任何形態或形式存在并應用于生物醫用材料。
[0035]本發明的有益效果在于:
[0036]I)保持了絲膠蛋白良好的天然特性(傳統的絲膠蛋白取自野生型蠶繭，采用傳統提取方法如，高溫高壓法或堿法獲得的絲膠蛋白降解嚴重，成膠性差，而采用溴化鋰溶液提取法又無法將絲膠與絲素分離)，克服了傳統提取方法無法得到非降解的高生物特性絲膠蛋白的難題。
[0037]2)本發明采用的方法絲膠蛋白的提取效率在90%以上。
[0038]3)本發明首次使用非降解的絲膠蛋白水溶液與醛類或京尼平等交聯劑制作水凝膠，制備方法簡便易行。
[0039]4)本發明首次制備了三維的具有良好機械性能的純絲膠蛋白支架，同時也是首次制備了可注射型的純絲膠蛋白水凝膠(目前世界上仍無可注射純絲膠蛋白三維水凝膠，通常使用絲膠蛋白與其他材料簡單混合制備復合生物材料，如明膠、聚乙烯醇、殼聚糖等)。
[0040]5)本發明制備的絲膠蛋白水凝膠具有獨特的性質。本發明提取的完整的絲膠多肽保持了絲膠蛋白良好的天然特性，該絲膠蛋白水溶液在交聯劑(醛類、京尼平等)的作用下易交聯成膠。本發明研制的絲膠蛋白水凝膠不僅具有傳統水凝膠的特點(多孔性，可降解性等)，而且具有諸多自身的優良特性:(I)具有良好的生物相容性，可以搭載多種細胞并支持細胞粘附和增殖；(II)具有可注射性及原位成膠特性，可通過注射的方式將該材料移植到體內，該方法對機體的創傷明顯小于手術；(ΠΙ)具有自熒光特性，可以在體內被實時跟蹤；(IV)具有良好的機械性能(絲膠水凝膠具有比廣泛用于組織工程的海藻酸鹽水凝膠更優異的機械性能);(V)降解產物具有很強的近中性PH的緩沖能力，在用該材料作為藥物或生長因子載體時有利于避免藥物或生長因子等因環境PH影響而變性失活；(VI)降解速度具有PH響應性；(W)具有良好的藥物緩釋能力，是良好的藥物載體等。
[0041]6)本發明所獲得的絲膠蛋白水凝膠交聯率和成膠時間均可控(可根據需要實現原位成膠)，通過改變交聯劑的用量、種類或絲膠蛋白水溶液的濃度等條件調控水凝膠的交聯率與成膠速度。
[0042]7)本發明獲得的絲膠蛋白水凝膠用途廣，可制作成為各種形狀的凝膠，并可經凍干獲得不同形狀和孔徑的多孔生物支架。[0043]8)該絲膠蛋白水凝膠有良好的生物相容性和細胞粘附性，可支持多種細胞的存活和增殖；對藥物具有良好的控釋作用；絲膠蛋白水凝膠及其經過凍干得到的三維多孔絲膠蛋白生物支架，可作為細胞外基質支持細胞生長和促進營養物質交換。相關實驗結果表明該絲膠蛋白水凝膠可應用于包括但不限于血管、表皮、肌肉、皮膚、神經等組織損傷的修復和疾病的治療。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]圖1為絲膠蛋白水凝膠在不同溫度情況冷凍并低溫真空干燥得到的凍干支架和絲膠蛋白神經導管；
[0045]圖2為絲膠蛋白濃度與成膠時間(在室溫)關系圖；
[0046]圖3為37°C下絲膠蛋白水凝膠的交聯率曲線圖
[0047]圖4為絲膠蛋白水凝膠和海藻酸鹽水凝膠的彈性模量柱狀圖，
[0048]其中，A:壓縮強度，B:壓縮模量；
[0049]圖5為絲膠蛋白水凝膠在不同pH環境下的吸水膨脹率(37°C)曲線圖；
[0050]圖6為絲膠蛋白水凝膠在PBS中的降解(37 °C )曲線圖
[0051]圖7為絲膠蛋白水凝膠降解產物對降解液pH值的影響
[0052]圖8為絲膠蛋白水凝膠在不同的pH值(3.0、7.4、11.0)條件下的水飽和度；
[0053]圖9為絲膠蛋白差示掃描量熱法分析圖譜
[0054]其中，(I )絲膠蛋白，(II)戊二醛交聯的絲膠蛋白水凝膠，(III)戊二醛和濃鹽酸處理的絲膠蛋白，(IV)乙醇處理的絲膠蛋白
[0055]圖10為絲膠蛋白水凝膠和絲膠蛋白的紅外光譜圖
[0056]其中，(a)乙醇處理的絲膠，(b)戊二醛和濃鹽酸處理的絲膠蛋白，(C)戊二醛交聯的絲膠水凝膠，(d)絲膠蛋白
[0057]圖11為熒光顯微鏡下觀察到的絲膠導管和凍干水凝膠圖(A-H為導管，1-L為絲膠水凝膠凍干支架，標尺為200 μ m)
[0058]圖12為小動物成像系統對小鼠體內注射的絲膠水凝膠進行示蹤
[0059]圖13為絲膠蛋白水凝膠辣根過氧化物酶(HRP)釋放曲線圖
[0060]圖14為人臍靜脈內皮細胞絲膠蛋白水凝膠組與對照組細胞粘附性與細胞活力檢測；
[0061]其中，A為細胞對絲膠蛋白水凝膠的粘附性檢測圖(所用細胞系為ECV304)，B為細胞活力檢測圖(所用細胞系為EA.hy926)
[0062]圖15為人臍靜脈內皮細胞(ECV304)絲膠蛋白水凝膠組與人靜脈內皮細胞對照組圖
[0063]其中，A為普通電子顯微鏡圖，B為共聚焦電子顯微鏡圖
[0064]圖16為人皮膚表皮 細胞(HaCaT)絲膠蛋白水凝膠組與人皮膚表皮細胞對照組圖
[0065]圖17為小鼠肌細胞(C2C12)絲膠蛋白水凝膠組與小鼠肌細胞對照組圖
[0066]圖18為人胚胎腎細胞(HEK293)絲膠蛋白水凝膠組與人胚胎腎細胞對照組圖
[0067]圖19為人胚胎皮膚成纖維細胞(CCC-ESF-1)絲膠蛋白水凝膠組與人胚胎皮膚成纖維細胞對照組圖[0068]圖20為小鼠小膠質細胞(BV2)絲膠蛋白水凝膠組與小鼠小膠質細胞對照組圖
[0069]圖21為小鼠胰島內皮細胞(MSl)絲膠蛋白水凝膠組與小鼠胰島內皮細胞對照組圖；
[0070]圖22為大鼠雪旺氏細胞(RSC926)絲膠蛋白水凝膠組與大鼠雪旺氏細胞對照組圖
[0071]圖23為大鼠心肌細胞(H9C2)絲膠蛋白水凝膠組與大鼠心肌細胞對照組圖
【具體實施方式】
[0072]為了更好地解釋本發明，以下結合具體實施例進一步闡明本發明的主要內容，但本發明的內容不僅僅局限于以下實施例。
[0073]實施例1
[0074]絲膠蛋白水凝膠的制備方法，包括以下步驟:
[0075]一、蠶繭的選擇:
[0076]選用家 蠶絲素缺失變品種蠶繭(購于中國農業科學院蠶業研究所，該類品種資源保存于中國農業科學院蠶業研究所國家蠶資源保存中心)為原材料，主要的化學成分為:絲膠蛋白
[0077]二、絲膠的提取與分離
[0078]I)稱取家蠶突變品種蠶繭(購于中國農業科學院蠶業研究所提供)Ig并剪成Icm2的碎片，后置于潔凈的燒杯中，用超純水清洗3次，3500rpm離心5分鐘去除水份；
[0079]2)向步驟I)中得到的蠶繭碎片中加入30~60mL的濃度為6mol/L的LiBr水溶液，將該燒杯放入恒溫水浴鍋內35°C水浴24小時，溶解絲膠蛋白；
[0080]3)將步驟2)得到溶液轉入離心管內3500rpm離心5分鐘，去除不溶性物質，得到澄清的溶液；
[0081]4)向步驟3)得到的澄清溶液中加入四分之一體積的Tris-HCl緩沖液(lmol/L，ρΗ9.0)；
[0082]5)將步驟4)中的溶液轉入到預處理好的透析袋(MWC03500)中，然后將透析袋兩端用夾子夾緊，放置于含有超純水的燒杯中；將該燒杯置于攪拌器上慢速攪拌透析，每隔3小時換一次水，共透析48小時；
[0083]6)將5)中透析后的絲膠蛋白水溶液轉到離心管中，4000rpm離心5分鐘，去除沉淀；
[0084]7)將絲膠蛋白水溶液再裝入到透析袋中并將透析袋兩端用夾子夾緊，再將透析袋置于質量百分濃度為20%的PEG6000溶液中濃縮；將絲膠蛋白水溶液濃縮到需要的濃度為止(質量百分濃度為2.0%以上)；
[0085]8)蛋白濃度檢測采用BSA法和絲膠蛋白水溶液干燥法；
[0086]9)蛋白質分子量檢測(參照SDS-PAGE)。取10~15 μ L用于分子量檢測，其余置于4°C冰箱保存備用。
[0087]三、水凝膠的制備
[0088]1.將濃縮后的絲膠蛋白水溶液用超純水調整到2.0% (絲蛋白水溶液濃度為質量百分濃度);
[0089]2.每ImL絲膠蛋白水溶液中加入22 μ L質量百分濃度為25%的戊二醛；[0090]3.充分混勻后置于37°C下5分種，得到水凝膠。
[0091]四、實驗分析
[0092]1、絲膠蛋白的成膠時間和交聯率分析
[0093]該絲膠蛋白水凝膠由絲膠蛋白水溶液與質量百分濃度為25%的戊二醛在室溫下按體積比(100: 2.2)制備，觀察并記錄其成膠時間與測試交聯程度。
[0094]如圖2所示:隨著絲膠蛋白濃度的下降，所需的交聯時間越長，說明可利用絲膠蛋白濃度調節成膠時間
[0095]如圖3所示:絲膠蛋白水溶液經戊二醛交聯，可在0.5小時后基本完全交聯，此后交聯率保持在比較穩定的狀態
[0096]2.絲膠水凝膠具多孔的結構
[0097]將絲膠蛋白水凝膠在三種不同的溫度(分別為-201:、-801:、-196°0下凍干，并在掃描電子顯微鏡下觀察。如圖1所示:絲膠蛋白水凝膠經-196°C、-80°C、-2(TC冷凍溫度處理后再凍干獲得的絲膠蛋白三維多孔生物支架孔徑分別約為20 μ m, 300 μ m,和700 μ m。當冷凍溫度降低時，三維多孔生物支架的孔徑相應變小。此外，三維多孔生物支架存在大量微孔，可作為細胞外基質很好地支持細胞生長和促進營養物質交換。
[0098]3、絲膠蛋白水凝膠和海藻酸鹽水凝膠的力學性能對比分析
[0099]制作一定規格的 圓柱型水凝膠±夾，利用微型萬能測試機(Instron5848MicroTester, Instron, USA))在常溫下測試絲膠蛋白水凝膠的力學性能。
[0100]如圖4A和圖4B所示:絲膠蛋白水凝膠(質量百分濃度為2%)相對于廣泛應用于組織工程研究的材料海藻酸鹽水凝膠(質量百分濃度分別為2%和4%，水凝膠中含有等質量的高分子量和低分子量的海藻酸鹽)有著更優異的機械性能。海藻酸鹽水凝膠的配方為，ImL海藻酸鹽水溶液加入40 μ L Ca2SO4 (0.21g/mL)懸濁液混勻。
[0101]4、絲膠蛋白水凝膠在不同pH環境下的降解速率
[0102]對于測試pH環境對降解的影響，將絲膠蛋白水凝膠浸泡于不同pH值(pH3.0、pH5.0、pH7.4、pHll.0)的PBS溶液中，每日更換一次PBS溶液，在不同時間點，取出、干燥、稱重,結果見圖5。
[0103]如圖5所示:絲膠蛋白水凝膠在前5天內降解速率較快，5天后絲膠蛋白水凝膠的降解速率變緩慢。水凝膠降解具有pH響應性，其中在pHll.0的堿性條件下降解速率最快，15天即可完全降解；在pH3.0的酸性條件下降解速率最慢，53天降解率僅為30%左右。
[0104]在測試絲膠水凝膠降解產物對環境pH的影響時，不更換凝膠外部緩沖溶液，并在相應時間點測量該緩沖液的PH值，結果見圖6。
[0105]如圖6所示:絲膠蛋白水凝膠降解產物能夠使外部緩沖溶液pH值趨于中性的特性。
[0106]5、pH值對絲膠蛋白水凝膠的膨脹率的影響
[0107]將絲膠蛋白水凝膠凍干、稱重、浸泡于三種不用pH值(pH3.0、pH7.4、pHll.0)的PBS溶液中，在不同時間點，取出按以下公式測定其吸水膨脹率。(其中Ws為膨脹狀態下的重量，Wd為干重)
【權利要求】
1.一種絲膠蛋白水凝膠的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)稱取家蠶絲素缺失型突變品種蠶繭，經過LiBr或LiCl水溶液提取，透析純化得到非降解的質量百分濃度為0.1~4%的絲膠蛋白水溶液； 2)將步驟I)中得到的絲膠蛋白水溶液濃縮至1.5~10%，向濃縮后的水溶液中加入交聯劑，充分混勻后置于4~45°C、5秒~36小時，得到水凝膠，其中，每毫升絲膠蛋白水溶液加入2~500 μ L交聯劑。
2.根據權利要求1所述的絲膠蛋白水凝膠制備方法，其特征在于:所述交聯劑為戊二醛、丙二醛或京尼平中的任意一種。
3.根據權利要求1或2所述的絲膠蛋白水凝膠的制備方法，其特征在于:所述交聯劑的質量百分濃度為I~25%。
4.根據權利要求1或2所述的絲膠蛋白水凝膠的制備方法，其特征在于:所述步驟I)中，絲膠蛋白水溶液的制備方法，包括以下步驟: 1)稱取家蠶絲素缺失型突變品種蠶繭，并將其剪碎，用水清洗，去除水份，備用； 2)將步驟I)的蠶繭碎片浸泡于LiBr或LiCl水溶液中，25~50°C，溶解絲膠蛋白，其中，每克蠶繭碎片加入20~100mL6~8mol/L的LiBr或LiCl水溶液； 3)然后將步驟2)中的 溶液離心，去除不溶性物質，得到澄清溶液； 4)向步驟3)已離心的溶液中加入四分之一體積lmol/L、pH8.0~11.0的Tris-HCl緩沖液，并將其透析，得到絲膠蛋白水溶液； 5)將步驟4)得到絲膠蛋白水溶液離心去除沉淀，濃縮得到質量百分濃度為1.5~10%的絲膠蛋白水溶液，置于冰箱保存備用。
5.根據權利要求1或2所述的絲膠蛋白水凝膠的制備方法，其特征在于:絲膠蛋白水凝膠的制備方法包括以下步驟: 1)稱取家蠶絲素缺失型突變品種蠶繭，并將其剪成Icm2碎片，清洗3次，去除水份，備用； 2)將步驟I)的蠶繭碎片浸于6mol/L的LiBr水溶液中，于35°C，溶解絲膠蛋白24小時，每克蠶繭碎片加入40mL的濃度為6mol/L的LiBr水溶液； 3)然后將步驟2)中的溶液以3500rpm離心，去除不溶性物質，得到澄清溶液； 4)向步驟3)的澄清溶液中加入四分之一體積lmol/L，pH9.0的Tris-HCl緩沖液，并將其進行透析，得到絲膠蛋白水溶液； 5)將步驟4)得到絲膠蛋白水溶液離心去除沉淀，再將絲膠液透析得到質量百分濃度為0.1~4%的絲膠蛋白水溶液，再濃縮至質量百分濃度為1.5~10.0%，置于4°C冰箱保存備用； 6)將上述得到的絲膠蛋白水溶液加入戊二醛，將二者混勻，置于37°C，5分鐘，得到水凝膠，其中，每ImL絲膠蛋白水溶液加入2~100 μ L質量百分濃度為20~25%戊二醛。
6.一種權利要求按I~5中任一項所述制備得到的絲膠蛋白水凝膠在生物醫用材料中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于:該絲膠蛋白水凝膠用于以下方面: I)該絲膠蛋白水凝膠應用于多種損傷修復及疾病的治療，包括但不限于皮膚損傷，肌肉損傷，血管損傷，神經損傷，心肌損傷等；2)該絲膠蛋白水凝膠結合工具細胞包裝相應的治療因子應用于組織修復； 3)該絲膠蛋白水凝膠作為生長因子、藥物以及細胞的載體或支架。
8.—種絲膠蛋白凍干支架的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)將上述得到的絲膠蛋白水凝膠置于零度以下冷凍； 2)將冷凍的絲膠蛋白水凝膠 真空低溫干燥，得到絲膠蛋白凍干支架。
9.一種權利要求8制備得到絲膠蛋白凍干支架在生物醫用材料中的應用。
10.一種權利要求1~5中任意一項制備得到的絲膠蛋白水凝膠在熒光標記探針材料中的應用。
11.一種權利要求1~5中任意一項所述方法制備得到的絲膠蛋白水凝膠以任何形態或形式存在并應用于生物醫用材料。
【文檔編號】C08J3/24GK103951831SQ201410071402
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年2月28日 優先權日:2014年2月28日
【發明者】王琳, 張業順, 黃雷, 劉佳, 王征, 李永奎, 楊文 , 乞超 申請人:華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院