利用生物法與化學法相結合的從蝦蟹殼提取甲殼素和蛋白質的方法
【專利摘要】本發明公布一種綜合利用微生物發酵法、酶法和傳統的酸堿法從蝦蟹殼提取甲殼素的方法。具體工藝包括：在發酵池中按照比例和次序添加培養基、無機酸(或有機酸)、蝦蟹殼原料、蛋白酶、微生物菌種發酵液。其中無機酸用量不超過蝦蟹殼中碳酸鈣總當量的15％。在控溫、鼓氣或攪拌的條件下，發酵10-30小時。經壓榨分離，回收蛋白質和有機鈣。粗品甲殼素中殘余的碳酸鈣經有機酸或者無機酸繼續脫鈣，壓榨分離處理，得到脫鈣率達95％以上的甲殼素成品。兩次壓榨分離所產生的弱酸性廢水經處理后排放。該發明所公布的方法兼顧了可行性和經濟性，整個工藝易于產業化推廣。
【專利說明】利用生物法與化學法相結合的從蝦蟹殼提取甲殼素和蛋白 質的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種從蝦蟹殼提取甲殼素和蛋白質的方法。更具體地說，本發明涉及 綜合利用乳酸菌發酵法、蛋白酶法、酸堿處理法等方法，從蝦蟹殼提取甲殼素，并回收可利 用的蛋白質的方法。 技術背景
[0002] 甲殼素（Chitin)是自然界中唯一帶正電荷的天然高分子聚合物，學名為（1， 4)-2-乙酰氨基-2-脫氧-0-〇-葡萄糖，分子式為 ：((：8!113腸5)11。甲殼素的來源極為廣泛，主 要存在于甲殼動物外殼、軟體動物內骨骼、昆蟲表皮、菌類及藻類等微生物的細胞壁中。每 年地球上的生物合成量約為100億噸，是產量僅次于纖維素的第二大可再生資源，也是除 蛋白質外數量最大的含氮天然有機高分子。甲殼素及其衍生物屬于性能獨特、組織相容性 良好、可生物降解、符合環保要求的綠色材料，可廣泛應用于食品、日化、醫藥、化工、美容、 保健、生物、農業、水處理、紡織等多個領域。目前在日本、歐美等地區，甲殼素及其衍生物在 保健食品、生物醫藥、植物生長促進、日用化妝品等領域已形成穩定的產業，逐步開發出食 品級、藥品級、試劑級等不同類型的產品，市場前景十分廣闊。
[0003] 全球行業分析公司（Global Industry Analysts, Inc.)預測，甲殼素的新應用領 域將不斷開辟，會大力促進甲殼素/殼聚糖的市場需求。預計到2018年，全球甲殼素/殼聚 糖市場將達到11. 8萬噸。其中新增需求主要來自新的應用領域，尤其在亞太地區的新興市 場。除了傳統的應用領域，如藥品、保健食品、化妝品和水處理等應用以外，亞太地區在農用 化學品，如農藥、肥料、飼料等領域的應用需求的增加將進一步擴大甲殼素/殼聚糖市場。
[0004] 傳統上用來生產甲殼素的主要原料是水產加工廠廢棄的蝦殼和蟹殼，其甲殼素的 含量一般在15% ~40%，蛋白質含量為20% ~40%，碳酸鈣含量為20%?50%。提取甲殼素 的步驟一般包括脫碳酸鈣、脫蛋白質和脫色等。主要的甲殼素提取方法包括化學法（酸堿 法）、蛋白酶法（包括中性蛋白酶和酸性蛋白酶法）和微生物發酵法。
[0005] 酸堿法是甲殼素提取的傳統工藝，主要包括：使用稀鹽酸溶液（1-10% )在室溫下 脫鈣；使用氫氧化鈉稀溶液（1-10% )在高溫（85-100°C )下去除蛋白質和脂類物質；以及 使用次氯酸鈉或乙醇溶液脫除色素的過程。酸堿法的工藝操作簡單方便、效率高，但能源和 資源消耗較大，污染嚴重。目前我國企業所采用甲殼素提取工藝基本上仍然是傳統的酸堿 法。每30-35噸蝦殼只能提取1噸甲殼素，而每生產1噸甲殼素卻會產生400?600噸含 有高氯、鹽分以及高C0D(廢蛋白）等的廢水。處理這些廢液難度大，成本高，甚至達到甲 殼素生產成本的5倍以上。同時，由于工藝過程中含有高濃度氯離子，作為副產品回收的蛋 白質營養性差，只能作為廢棄物處理，不但造成資源浪費而且也增加了處理成本。
[0006] 蛋白酶法提取甲殼素主要采用了 Alcalase酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白 酶、胰蛋白酶等商業酶。蛋白酶法處理雖然大大降低了污染物的產生，減少了能耗，但卻存 在耗時長、效率低、成本高、脫蛋白不充分等不足。
[0007] 微生物發酵法是以蝦蟹廢棄物為底料，利用微生物在生長繁殖過程中產生有機酸 去除礦物質，產蛋白酶去除蛋白質，來完成脫鈣和脫蛋白的目的。相比傳統的酸堿法，微生 物發酵法不僅反應條件溫和，耗能少，不會產生酸堿廢液，對環境友好，同時還可大量降低 生產用水，其副產物也能被有效回收利用。微生物發酵產有機酸的速度與總量受到接種量、 碳源及其濃度、原料在發酵液中的濃度、原料的外形大小以及發酵溫度等多重因素的影響。 但是，微生物脫蛋白質的效率比較低，并且耗時長，理想狀態下36-144小時的蛋白去除率 只能達到40% -88%，在生產上不利于大規模生產。
[0008] 隨著近年來政府對減排降耗、環境治理等方面所制定的明確任務和要求，中小型 甲殼素生產企業面臨著巨大的生存壓力。生產工藝升級換代，采用清潔生產技術已經迫在 眉睫。如何盡可能地減少酸堿用量、提高蛋白質的可回收性，是目前甲殼素生產企業急需解 決的共性問題。
[0009] 專利（200710159248. 2)公布了 一種利用革蘭氏陰性桿菌鄰單胞桿 菌（Plesiomonas)發酵，從蝦殼中提取蝦青素、蛋白質以及甲殼素的方法。專利 (200710115507. 1)公布了一種采用復合酶法，以蝦、蟹為原料提取甲殼素、脂肪、蛋白粉的 方法。專利（200710168572. 0)公布了一種采用微波加熱，配合NaOH和HC1處理的工藝，從 蝦殼中提取甲殼素及其生物活性物質的方法。專利（02122565.6)公布了一種利用有機酸 和有機溶劑從鮮蝦殼提取甲殼素、蝦青素和蛋白質的方法。專利（200910069014.8)公布了 一種使用固體發酵技術提取甲殼素的方法。專利（201010181224. 9)、（201010181245. 0)、 (200910040121. 8)、（201110061309. 8)分別公布了使用乳酸片球菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿 菌等乳酸菌發酵從蝦頭和蝦殼中提取蛋白質和甲殼素的方法。
[0010] 與上述專利相比，本專利綜合使用了微生物發酵法、酶法和傳統的酸堿法，充分發 揮了各種方法的優勢，兼顧了可行性、方便性和經濟性，使得整個工藝更加方便和易于產業 化推廣。傳統的酸堿法操作最簡單方便、并且效率高，但能源和資源消耗較大，污染嚴重。而 不管是單獨使用酶法或者單獨使用微生物發酵法，都存在著耗時長，脫碳酸鈣和脫蛋白效 率低的不足，難以真正在生產上推廣應用。本發明所公布的方法比傳統的酸堿法降低HC1 用量60%以上，降低NaOH用量80%以上。同時，副產品蛋白質和有機鈣可以得到很好的回 收。所產生的廢水不僅量小，而且為弱酸性，易于處理達標。
【發明內容】
[0011] 本發明的目的是公布一種利用生物法與化學法相結合的從蝦蟹殼提取甲殼素和 蛋白質的方法。
[0012] 本發明所述的方法是通過下述技術方案予以實現的：
[0013] 本技術工藝分2個主要環節，即發酵脫除碳酸鈣的蛋白質階段、酸處理脫除殘余 碳酸鈣階段。前者在發酵池中完成，發酵池中的發酵預混物包括（按照添加次序）：微生物 發酵培養基、有機酸或無機酸、蝦蟹殼原料、蛋白酶、微生物菌種發酵液。其中無機酸用量 (按照當量計算）不超過蝦蟹殼原料中碳酸鈣總當量的15%。發酵預混物在特定溫度和通 氧量的情況下，發酵培養10-30小時。經壓榨分離，回收蛋白質和有機鈣。粗品甲殼素經再 次使用酸（有機酸或者無機酸）脫鈣和壓榨分離處理，得到脫鈣率達95%以上的甲殼素成 品。兩次壓榨分離所產生的弱酸性廢水經處理后排放。
[0014] 本發明所述的技術工藝流程如附圖1所示。
[0015] 本發明所述的發酵池，是具有加氣、保溫功能的水泥池或者金屬罐，以保證發酵溫 度可控。
[0016] 本發明所述的發酵過程，其溫度控制在20-40°C，其充氣量為2-80立方米/小時。
[0017] 本發明所述的微生物發酵培養基，其特征在于，充分利用蝦蟹殼中自身所帶的各 種鹽類和殘余蛋白質（氮源）作為微生物菌種培養的營養，同時補充微生物所需的碳源，以 及控制乳酸菌噬菌體生長所需的檸檬酸鹽。
[0018] 本發明所述的有機酸或者無機酸，是指工業鹽酸、乙酸、檸檬酸等。
[0019] 本發明所述的蛋白酶，是指來自于霉菌、細菌、酵母菌或者放線菌的酸性蛋白酶、 中性蛋白酶或堿性蛋白酶中的一種，或多種混合使用。本發明所述的蛋白酶尤其是指酸性 蛋白酶。
[0020] 本發明所述的微生物菌種，是指能夠產生有機酸和蛋白酶的微生物，包括乳桿菌 屬、乳球菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、沙雷菌屬和曲霉屬微生物等。本發明所述的微生物 酶種尤其是指乳桿菌屬細菌。
[0021] 更具體地，乳桿菌屬微生物指干酪乳桿菌（Lactobacillus casei)、卷曲乳桿菌 (Lactobacillus crispatus)、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus)、德氏乳桿 菌（Lactobacillus delbrueckii)、發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentium)、格氏乳 桿菌（Lactobacillus gasseri)、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus)、約氏乳桿 菌（Lactobacillus johnsonii)、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei)、植物乳桿 菌（Lactobacillus plantarum)、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳桿菌 (Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius)等。乳球菌屬微生 物指乳酸乳球菌（Laclococcus lactis)。芽孢桿菌屬微生物是指枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus)、左旋乳酸芽孢桿菌 (Bacillus laevolacticus)、消旋乳酸芽抱桿菌（Bacillus racemilacticus)等。假單胞菌 屬微生物是指突光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens)。沙雷菌屬微生物是指粘質沙雷 氏菌（Serratia marcescens)。曲霉屬微生物是指煙曲霉（Aspergillus fumigatus)、灰綠 曲霉（Aspergillus glaucus)、構巢曲霉（Aspergillus nidurans)、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus)、土曲霉（Aspergillus terreus)和雜色曲霉（Aspergillus versicolor) 等。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合具體實例，對本發明做進一步說明。本發明的保護范圍并不限定于下列 實例。
[0023] 實施例1 :微生物菌種的發酵培養
[0024] 本實施例以保加利亞乳桿菌為例，說明微生物菌種發酵的方法。
[0025] 保加利亞乳桿菌菌種以甘油凍管形式儲存于低溫冰箱，取出后經逐級放大培養， 用做蝦蟹殼發酵池菌種。培養溫度為37°C，充氣或者在搖床以50-150轉/分鐘速度培養， 一般每級放大倍數為10-50倍，每級的培養時間為5-10小時。為了節約能源，降低成本，當 發酵體積大于200升時，培養基即可不做滅菌處理，而是將培養基的各種配料新鮮混合后， 直接接種上一級的微生物培養液繼續培養。
[0026] 本發明所述的技術工藝，最后產出可以回收用作飼料原料的蛋白質粉。此蛋白質 粉同時可以用做本工藝中的微生物培養基的成分（氮源）。
[0027] 參考培養基組分如下（克/1000毫升）：
[0028] 蝦殼回收蛋白（或蛋白胨） 20 葡萄糖 5 玉米淀粉 10-15 乙酸鈉 5 檸檬酸二銨 2 硫酸鎂 〇. 5 硫酸錳 〇. 25 純凈水 加至1000毫升
[0029] 實施例2 :蝦蟹殼原料的發酵
[0030] 由于發酵池的設計體積一般超過10噸以上，使用培養基的體積也很大。為了節約 能源和降低生產成本，在發酵池中蝦蟹殼原料的發酵處理時，培養基不做滅菌處理。同時， 蝦蟹殼原料自身攜帶大量微生物。因此，如果要保證發酵成功，則必須投放高濃度的發酵微 生物菌種培養液，以使其迅速成為發酵池中的絕對優勢菌種。
[0031] 發酵池中的發酵預混物包括（按照添加次序）：培養基、有機酸或無機酸、蝦蟹殼 原料、蛋白酶、微生物菌種發酵液。
[0032] 各組分的比例如下：
[0033] 蝦蟹殼原料濃度為200-1000克/升液體發酵（重量體積比）。
[0034] 無機酸用量（按照當量計算）不超過蝦蟹殼原料中碳酸鈣總當量的15%。有機酸 用量（按照當量計算）為蝦蟹殼原料中碳酸鈣總當量的0-15%。
[0035] 蛋白酶活性單位和蝦蟹殼原料中蛋白質的含量不同，蛋白酶的用量為0.1-1% (體積：體積）。
[0036] 微生物菌種發酵液的添加比例為發酵池發酵總體積的1/20-1/8,典型的為1/10。
[0037] 由于蝦蟹殼原料中，自身就帶有大量的殘余肉屑蛋白質，可以為微生物生長提供 充足的氮源。
[0038] 需要添加的培養基配料為（克/1000毫升）：
[0039] 葡萄糖 5-15
[0040] 玉米粉 10-20
[0041] 蒸溜水 加至1000ml
[0042] 發酵溫度為20_40°C，鼓氣或者攪拌發酵培養10-30小時。經壓榨分離，回收蛋白 質和有機鈣。粗品甲殼素經再次使用酸（有機酸或者無機酸）脫鈣和壓榨分離處理，得到 脫鈣率達95%以上的甲殼素成品。 圖1是利用生物法與化學法相結合的從蝦蟹殼提取甲殼素和蛋白質的工藝流程圖。
【權利要求】
1. 一種利用生物法與化學法相結合的從蝦蟹殼提取甲殼素和蛋白質的方法，其特征在 于：整個工藝分兩步完成，即：第一步，微生物發酵脫除蛋白質和大部分碳酸鈣，經壓榨分 離，回收蛋白質和有機鈣；第二步，使用鹽酸或者其它有機酸脫除甲殼素粗品中殘余的碳酸 鈣。
2. 根據權利1的要求，微生物發酵過程在發酵池或者發酵罐中進行。發酵混合物料包 括蟲下蟹殼原料、培養基、有機酸或無機酸、蛋白酶和微生物菌種發酵液。在控溫20-40°C，鼓 氣或攪拌的條件下，持續發酵10-30小時。
3. 根據權利2的要求，無機酸用量（按照當量計算）不超過蝦蟹殼原料中碳酸鈣總當 量的15%，有機酸用量（按照當量計算）為蝦蟹殼原料中碳酸鈣總當量的0-15%。
4. 根據權利2的要求，所述的蛋白酶，是指來自于霉菌、細菌、酵母菌或者放線菌的酸 性蛋白酶、中性蛋白酶或堿性蛋白酶中的一種，或多種混合使用。本發明所述的蛋白酶尤其 是指酸性蛋白酶。
5. 根據權利2的要求，所述微生物是指能夠產生有機酸和蛋白酶的微生物，包括乳桿 菌屬、乳球菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、沙雷菌屬和曲霉屬微生物等。本發明所述的微 生物菌種尤其是指乳桿菌屬細菌。其中，乳桿菌屬微生物是指干酪乳桿菌（Lactobacillus casei)、卷曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus)、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus)、德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii)、發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentium)、格氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)、瑞 士乳桿菌(Laclobacillus helveticus)、約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii)、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei)、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius)等。乳球菌屬微生物是指乳酸乳球菌（Lactococcus lactis)。芽孢桿 菌屬微生物是指枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus)、左旋乳酸芽抱桿菌（Bacillus laevolacticus)、消旋乳酸芽抱桿 菌（Bacillus racemilacticus)等。假單胞菌屬微生物是指突光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens)。沙雷菌屬微生物是指粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens)。曲霉屬微 生物是指煙曲霉（Aspergillus fumigatus)、灰綠曲霉（Aspergillus glaucus)、構巢曲霉 (Aspergillus nidurans)、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus)、土曲霉（Aspergillus terreus)和雜色曲霉（Aspergillus versicolor)等。
6. 根據權利1的要求，所述的無機酸為工業鹽酸，所述的有機酸為乙酸、檸檬酸、蘋果 酸、酒石酸、水楊酸等。
【文檔編號】C08B37/08GK104250311SQ201310260521
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2013年6月25日 優先權日:2013年6月25日
【發明者】劉占良, 胡道亨, 沈冬, 傅鵬程, 吳學強, 劉戰征 申請人:杭州駝王科技有限公司, 舟山市普陀新興醫藥化工有限公司