精品肝素和制備精品肝素的方法
【專利摘要】本文涉及一種精品肝素和制備精品肝素的方法。其中制備精品肝素的方法包括：將粗品肝素溶解到水中，制備肝素溶液，向肝素溶液中加入硫酸軟骨素酶AC和/或硫酸軟骨素酶B，與半乳糖胺雜質進行酶反應；除去肝素溶液中的硫酸軟骨素酶AC和/或硫酸軟骨素酶B。
【專利說明】精品肝素和制備精品肝素的方法
【技術領域】
[0001] 本文涉及精品肝素和制備所述精品肝素的方法。
【背景技術】
[0002] 肝素是由己糖醛酸（L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸）和D-硫酸氨基葡萄糖以 1 - 4糖苷鍵交替形成的粘多糖，具有六糖或八糖的重復單位的線性鏈狀結構，其分子量 為3000-37000Da之間，在醫藥方面作為抗凝試劑和抗栓試劑使用。此外，肝素還具有抗 炎、抗過敏、抗病毒、抗癌、調血脂等多種生物學功能（Maurice Petitou, Benito Casu，Ulf Lindah. 1976 - 1983,a critical period in the history of heparin:the discovery of the antithrombin binding site. Biochimie85(2003)83 - 89)〇
[0003] 粗品肝素經過純化之后可以藥用，純化過程包括一系列的一般分離步驟以及使 外來物質失活的步驟。其中分離步驟利用了肝素的物化性質，比如高陰離子密度，水溶性 以及對于熱、酸、堿和氧化劑的相對高活性（Marco Guerrini，Zhenqing Zhang, Zachary Shriver, etc. Orthogonal analytical approaches to detect potential contaminants in h印arin.PNAS，2009,106 (40) :16956 - 16961)。
[0004] 在歷史上藥品級別的肝素是基于血漿凝固試驗來定義的，而不是其分子性質。目 前這種狀態已經改變，這是因為肝素污染危機和更加精妙的多糖分析手段的出現。世界 上的多家標準品機構，包括美國藥典和歐洲藥典，已經開始用基于規定的生化方法，比如 核磁共振（NMR)、毛細管電泳（CE)、高效液相色譜（HPLC)來測定肝素的結構和電荷性質。 2007年末到2008年初的硫酸軟骨素污染肝素鈉事件，導致了很多國家的肝素在血液透析 的過程中出現過敏反應，比如急性低血壓，并導致超過140位病人死亡（Kishimoto TK， 等人(2008)Contaminated heparin associated with adverse clinical events and activation of the contact system. N Engl J Med358:2457 - 2467 ；Guerrini M,等人 (2008)Oversulfated chondroitin sulfate is a contaminant in heparin associated with adverse clinical events.Nat Biotechnol26:669 _ 675;Blossom DB,等人（2008) Outbreak of adverse reactions associated with contaminated heparin. N Engl J Med359:2674 - 2684)。
[0005] 肝素中另一種雜質為過硫酸軟骨素。過硫酸軟骨素（0SCS)每個雙糖單位含有4個 硫，如下式1所示，到目前為止，雙糖含有4個硫元素在自然界中還沒有發現，結構也不同于 其他的粘多糖（GAG)不純物質。0SCS的出現也開始使各國重視肝素的其他污染物，如硫酸 皮膚素（DS)、透明質酸（HA)和所謂的邊角料，這些也可以被過硫酸化而出現在肝素中。所 以肝素粗品的精制工藝顯得越來越重要。
[0006]
【權利要求】
1. 一種精制的精品肝素，其中，所述精品肝素所含的半乳糖胺的雜質為5質量％以下、 優選為3質量％以下、進一步優選為1質量％以下，再進一步優選為0. 8質量％、0. 5質量％、 〇. 3質量％、優選為0. 1質量％以下。
2. 根據權利要求1所述的精品肝素，其中，所述精品肝素的羊血漿效價為150IU/mg以 上、優選為160IU/mg以上、進一步優選為170IU/mg以上。
3. 根據權利要求1或2所述的精品肝素，其中，所述精品肝素配制為4mg/mL的肝素溶 液時，在260nm處的吸光度為0· 1以下，在280nm處的吸光度為0· 1以下。
4. 一種制備精品肝素的方法，其包括： 向含粗品肝素的肝素溶液中加入下列酶中的至少一種與半乳糖胺雜質進行酶反應，上 述酶為硫酸軟骨素酶AC和硫酸軟骨素酶B。
5. 根據權利要求4所述的方法，其中，所述硫酸軟骨素酶AC是與MBP融合的硫酸軟骨 素酶AC，即MBP-ChonAC(SEQ ID NO: 1)，所述硫酸軟骨素酶B是與MBP融合的硫酸軟骨素酶 B，即 MBP-ChonB(SEQ ID N0:2)。
6. 根據權利要求4所述的方法，其中向肝素溶液中添加胰酶停止酶反應。
7. 根據權利要求4所述的方法，其中，還包括下列的提純步驟： 除雜質步驟； 乙醇沉淀步驟； 氧化步驟； 冷凍干燥。
8. 根據權利要求7所述的方法，其中，所述除雜質步驟和乙醇沉淀步驟重復進行兩次 或三次以上。
9. 根據權利要求7所述的方法，其中，在最后一次乙醇沉淀之前進行氧化并脫色。
10. 根據權利要求7所述的方法，其中，除雜質步驟包括向肝素溶液中添加氯化鈣以除 去雜質，并進一步添加無水碳酸鈉以除去鈣離子。
11. 根據權利要求9所述的方法，其中，利用H202對肝素溶液進行氧化并脫色。
12. 根據權利要求4?11中任一項所述的方法，其中， 所述硫酸軟骨素酶B和粗品肝素的比例為：500IU-50000IU硫酸軟骨素酶B/kg 粗品肝素，優選的比例為1000IU-20000IU硫酸軟骨素酶B/kg粗品肝素，進一步優選 3000IU-12000IU硫酸軟骨素酶B/kg粗品肝素，最優選為5000IU-10000IU硫酸軟骨素酶B/ kg粗品肝素； 所述硫酸軟骨素酶AC和粗品肝素的比例為：300IU-30000IU硫酸軟骨素酶AC/kg 粗品肝素，優選的比例為1 〇〇〇IU-15000IU硫酸軟骨素酶AC/kg粗品肝素，進一步優選 2000IU-10000IU硫酸軟骨素酶AC/kg粗品肝素，最優選為3000IU-6000IU硫酸軟骨素酶 AC/kg粗品肝素。
13. 根據權利要求4?12中任一項所述的方法，其中，獲得所述粗品肝素的肝素原料為 來自動物組織的基本上含有肝素的原料，優選來源于豬、牛、羊組織的肝素，更優選來源于 豬小腸粘膜的肝素。
【文檔編號】C08B37/10GK104140478SQ201310165701
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2013年5月8日 優先權日:2013年5月8日
【發明者】邢新會, 吳敬君, 張翀 申請人:清華大學