專利名稱：硫酸軟骨素鈉的制備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及硫酸軟骨素鈉的制備方法。
背景技術：
硫酸軟骨素鈉是從動物的喉骨、鼻中骨、氣管等軟骨組織提取制得的硫酸化鏈狀粘多糖鈉鹽。硫酸軟骨素鈉主要由N-乙酰半乳糖胺(2-乙酰胺-2脫氧-β -D-吡喃半乳糖)和D-葡萄糖醛酸的共聚物的硫酸酯鈉鹽，共聚物內己糖通過β_1，3及β_1，4糖苷鍵交替連接。目前硫酸軟骨素鈉采用的是堿鹽消化沉淀法，即軟骨經堿化后，酶解、過濾后用酒精直接沉淀，按此方法生產硫酸軟骨素鈉含量低，重金屬、含氮量、熾灼殘渣超標，達不到《中國藥典》2010年版標準及出口標準。
發明內容
為解決現有技術中 硫酸軟骨素鈉含量低，重金屬、含氮量、熾灼殘渣超標的技術難題；從而達到《中國藥典》2010年版標準及(USP)美國藥典、(EP)歐州藥典出口標準，本發明提供了一種硫酸軟骨素鈉的制備方法。本發明所提供的硫酸軟骨素鈉的制備方法，包括以下步驟:(I)酶解:向軟骨原料中加入軟骨重量1% 3.5%的食鹽，用稀堿溶液調節pH值至8 11，加入軟骨重量0.2 0.4%的堿性蛋白酶酶解I 3小時，再用鹽酸調節pH值至7 8，升溫至42 50°C，再加入軟骨重0.4 0.6%的胰酶酶解2 5小時；酶解結束后用鹽酸調節pH值至6 6.5，升溫至80°C，靜置冷卻至50°C左右，過濾，得到濾液；(2)樹脂吸附:向所述步驟(I)得到的濾液中加入強堿性陰離子交換樹脂，在攪拌狀態下吸附I 5小時，后用純化水漂洗樹脂，得到漂洗后的吸附樹脂；(3)洗脫:將所述步驟(2)得到的漂洗后的吸附樹脂用鹽水進行洗脫，收集洗脫液；(4)脫色:將所述步驟(3)得到的洗脫液用氫氧化鈉調節pH值至8 10，升溫至37 40°C,加雙氧水靜置氧化脫色,得到脫色后的溶液；(5)超濾:將所述步驟(4)得到的脫色后的溶液進行超濾，得到超濾液；(6)沉淀:將所述步驟(5)得到的超濾液用鹽酸調節pH值至5.8 6.0，用質量百分比濃度為70% 75%的酒精沉淀3 6小時，得到硫酸軟骨素鈉沉淀；(7)脫水干燥:將所述步驟(6)得到的硫酸軟骨素鈉沉淀用酒精脫水后離心，干燥，即得到硫酸軟骨素鈉。在所述步驟(I)之前還包括將所述軟骨原料進行預處理的步驟；所述預處理的方法為將所述軟骨原料加水浸泡，升溫至80°C，攪拌清洗直至將原料洗凈。所述步驟(I)中所述酶解溫度為30 40°C，所述鹽酸濃度為鹽酸與水體積比是1:1o
所述步驟(2)中所述強堿性陰離子交換樹脂的加入量為軟骨原料質量的80%。所述步驟(3)中所述鹽水的質量百分比濃度為10%_15% ;所述洗脫為兩次洗脫，第一次洗脫中所述鹽水與所述吸附樹脂的質量比為1.5:1，洗脫時間為2-3小時；第二次洗脫中所述鹽水與所述吸附樹脂的質量比為1:1，洗脫時間為1-2小時。所述步驟(4)中所述雙氧水為所述洗脫液重量的0.2%-0.8%，所述脫色的時間為2小時。所述步驟(7)中所述用酒精脫水之前還包括將所述硫酸軟骨素鈉沉淀用質量百分比濃度為80 85%的酒精浸泡的步驟。所述步驟(7)中所述用干燥是采用真空干燥，溫度50 70°C，壓力550 750mm萊柱，干燥8 10小時。采用本發明的制備方法制備得到的硫酸軟骨素鈉，產品干物質收率提高了 2%，硫酸軟骨素鈉含量提高了 10%，從而提升了產品附加值，降低了生產成本，提高了經濟效益。
圖1為硫酸軟骨素鈉的制備工藝流程圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行詳細描述。實施例1、制備硫酸軟骨素鈉一、按照以下步驟制備硫酸軟骨素鈉:(I)原料預處理:將豬、牛喉骨、鼻中骨、氣管等軟骨組織投入洗料罐子中，加水浸泡，至全部淹沒，升溫至80°C左右，反復攪拌清洗，去掉肉渣、浮油、雜質，直至原料洗凈。將洗凈的原料投入到消化罐中，加入純化水至軟骨完全淹沒后加熱煮料，待煮沸后，應關小蒸汽，微開燜油2小時。待原料煮好后，打盡浮油。(2)酶解:將煮好的原料降溫至30°C，加入軟骨重量1%的食鹽，用稀堿溶液(40%的NaOH水溶液:100毫升水加40克氫氧化鈉)調節pH值至8，加入軟骨重量0.3%的堿性蛋白酶(購自石家莊興達酶制劑有限公司)酶解I小時，再用1:1鹽酸(鹽酸與水體積比)調節pH值至7，升溫至42°C，再加入軟骨重0.4%的胰酶(重慶奧力生物制藥有限公司生產)酶解2小時。酶解結束后用鹽酸調節pH值至6，升溫至80 V，靜置冷卻至50°C左右，用V型槽硅藻土作助濾劑過濾，得濾液。( 3)樹脂吸附:將上述酶解后的濾液抽入已清洗干凈的樹脂罐中，加入純化水調比重至1.03，溫度控制在30°C，按軟骨重量50%添加SPN IV大孔強堿性陰離子交換樹脂，在攪拌狀態下吸附I小時。再將第一次吸附后的料液抽入另一樹脂罐中，用純化水調比重至1.01,加入軟骨重30%的樹脂進行第二次吸附,時間為2小時。完成后,應放掉料液,合并兩次樹脂，用純化水漂洗樹脂兩次，得到漂洗后的吸附樹脂。(4)洗脫:將漂洗后的吸附樹脂再用濃度為10%的鹽水按樹脂重量1.5倍量進行第一次洗脫，時間為2小時，收集洗脫液。第一次洗脫放掉鹽水后，再用10%的鹽水按樹脂重量等量進行第二次洗脫，時間為I小時。收集洗脫液，合并兩次洗脫液。洗脫后的樹脂用純化水動態漂洗3次，再用純化水浸泡備用。
(5)脫色:將洗脫液泵入脫色罐中，用氫氧化鈉調節pH值至8，升溫至37°C，加雙氧水0.2%，靜置氧化脫色2小時左右，得到脫色后的溶液。(6)超濾:將上述脫色后的溶液超濾，超濾膜孔徑為10000道爾頓，得到超濾液。(7)沉淀:將超濾液用鹽酸調節pH值至5.8，加純酒精沉淀至濃度為70%左右，沉淀時間為3小時，得到硫酸軟骨素鈉沉淀。(8)脫水干燥:將硫酸軟骨素鈉沉淀用80%的酒精(質量百分比濃度)浸泡2次，每次2小時以上洗鹽，再用95%的酒精(質量百分比濃度)脫水2次，再離心。將離心后的硫酸軟骨素鈉置于雙錐回轉真空干燥機中干燥10小時,真空泵壓力為550 750mm萊柱,溫度為 50。。。(9)粉碎過篩:將干燥完畢的硫酸軟骨素鈉粉碎,過80目篩，即得硫酸軟骨素鈉原粉。(10)包裝:將硫酸軟骨素鈉原粉即時包裝，密封，遮光，于干燥處保存。二、測定制備的硫酸軟骨素鈉的質量指標1、各指標的測定方法:(I)收率:收到的干物質與投料量之百分比，即收率=(硫酸軟骨素鈉粉重量/原料重量)X 100%。(2)比旋度:取本品，精密稱定，用水溶解并定量稀釋制成每Iml中約含40mg的溶液。依法測定(《中國藥典》2010年版二部附錄VI E)，比旋度應-25°至-32°。(3)含氮量:取本品，照氮測定法(《中國藥典》2010年版二部附錄YD D第二法)測定，按干燥品計算，含氮量應為2.5% 3.5%。(4)酸度:取本品0.5g，用水IOml溶解后，依法測定(《中國藥典》2010年版二部附錄VI H)，pH值應為6.0 7.0。(5)氯化物:取本品0.0lg，依法檢查(《中國藥典》2010年版二部附錄VDI A)，與標準氯化鈉溶液5ml制成的對照液比較，不得更濃(0.5%)。(6)硫酸鹽:取本品0.lg，依法檢查(《中國藥典》2010年版二部附錄VDI B)，與標準硫酸鉀溶液2.4ml制成的對照液比較，不得更濃(0.24%)。(7)干燥失重:取本品，在105°C干燥4小時，減失重量不得過10.0% (《中國藥典》2010年版二部附錄VDI L)。(8)熾灼殘渣:取本品1.0g，依法檢查(《中國藥典》2010年版二部附錄VDI N)，按干燥品計算，遺留殘渣應為20.0% 30.0%。(9)重金屬:取熾灼殘渣項下遺留的殘渣，依法檢查(《中國藥典》2010年版二部附錄VDIH第二法)，含重金屬不得過百萬分之二十。 (10)硫酸軟骨素鈉含量:取本品0.lg，精密稱定，置IOml的量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45 μ m的濾膜濾過，精密量取100 μ I，置具塞試管中，加三羥甲基氨基甲烷緩沖液(取三羥甲基氨基甲烷6.06g與三水乙酸鈉8.17g，加水900ml溶解，用稀鹽酸調節pH值至8.0，用水稀釋至1000ml) 800 μ 1，充分混勻，再加入硫酸軟骨素鈉ABC酶液(取硫酸軟骨素鈉ABC酶適量，按標示單位用上述緩沖液稀釋成每100μ I含0.1單位的溶液)100 μ I，搖勻，置于37°C水浴中反應I小時，取出，在100°C加熱5分鐘，用冷水冷卻。以每分鐘10000轉離心20分鐘，取上清液，0.45 μ m的濾膜濾過，作為供試品溶液。精密量取20 μ I注入液相色譜儀，記錄色譜圖。另取硫酸軟骨素鈉對照品適量，精密稱定，同法測定，按外標法以硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素B和硫酸軟骨素C的峰面積之和計算，即得。2、測定結果:收率為10.2%。質量指標:①比旋度:-27.5°②含氮量:2.8%③酸度:6.6④氯化物:< 0.5%
⑤硫酸鹽:<0.24%⑥干燥失重:8.3%⑦熾灼殘洛:23.8%⑧重金屬:<20ppm⑨硫酸軟骨素鈉含量:94.6%實施例2、制備硫酸軟骨素鈉一、按照以下步驟制備硫酸軟骨素鈉:(I)原料預處理:將豬、牛喉骨、鼻中骨、氣管等軟骨組織投入洗料罐子中，加水浸泡，至全部淹沒，升溫至80°C左右，反復攪拌清洗，去掉肉渣、浮油、雜質，直至原料洗凈。將洗凈的原料投入到消化罐中，加入純化水至軟骨完全淹沒后加熱煮料，待煮沸后，應關小蒸汽，微開燜油3小時。待原料煮好后，打盡浮油。(2)酶解:將煮好的原料降溫至40°C，加入軟骨重量3.5%的食鹽，用稀堿溶液(40%的NaOH水溶液:100毫升水加40克氫氧化鈉)調節pH值至11，加入軟骨重量0.4%的堿性蛋白酶(購自石家莊興達酶制劑有限公司)酶解3小時，再用1:1鹽酸(鹽酸與水體積比)調節pH值至8，升溫至50°C，再加入軟骨重0.6%的胰酶(重慶奧力生物制藥有限公司生產)酶解5小時。酶解結束后用鹽酸調節pH值至6.5，升溫至80°C，靜置冷卻至50°C左右，用V型槽硅藻土作助濾劑過濾，得濾液。( 3)樹脂吸附:將上述酶解后的濾液抽入已清洗干凈的樹脂罐中，加入純化水調比重至1.03，溫度控制在40°C，按軟骨重量40%添加SPN IV大孔強堿性陰離子交換樹脂，在攪拌狀態下吸附2小時。再將第一次吸附后的料液抽入另一樹脂罐中，用純化水調比重至1.01,加入軟骨重量40%的樹脂進行第二次吸附,時間為3小時。完成后,應放掉料液,合并兩次樹脂，用純化水漂洗樹脂兩次，得到漂洗后的吸附樹脂。(4)洗脫:將漂洗后的吸附樹脂再用濃度為15%的鹽水按樹脂重量1.5倍量進行第一次洗脫，時間為3小時，收集洗脫液。第一次洗脫放掉鹽水后，再用15%的鹽水按樹脂重量等量進行第二次洗脫，時間為2小時。收集洗脫液，合并兩次洗脫液。洗脫后的樹脂用純化水動態漂洗3次，再用純化水浸泡備用。(5)脫色:將洗脫液泵入脫色罐中，用氫氧化鈉調節pH值至10，升溫至40°C，加雙氧水0.8%，靜置氧化脫色2小時左右，得到脫色后的溶液。(6)超濾:將上述脫色后的溶液超濾，超濾膜孔徑為10000道爾頓，得到超濾液。(7)沉淀:將超濾液用鹽酸調節pH值至6.0,加純酒精沉淀至濃度為70%左右，沉淀時間為6小時,得到硫酸軟骨素鈉沉淀。(8)脫水干燥:將硫酸軟骨素鈉沉淀用85%的酒精(質量百分比濃度)浸泡3次，每次2小時以上洗鹽，再用95%的酒精(質量百分比濃度)脫水2次，再離心。將離心后的硫酸軟骨素鈉置于雙錐回轉真空干燥機中干燥8小時,真空泵壓力為550 750mm萊柱,溫度為70。。。(9)粉碎過篩:將干燥完畢的硫酸軟骨素鈉粉碎,過80目篩，即得硫酸軟骨素鈉原粉。(10)包裝:將硫酸軟骨素鈉原粉即時包裝，密封，遮光，于干燥處保存。二、測定制備的硫酸軟骨素鈉的質量指標1、各指標的測定方法:測定指標分別為:(I)收率、(2 )比旋度、(3 )含氮量、(4 )酸度、(5 )氯化物、(6 )硫酸鹽、(7)干燥失重、(8)熾灼殘渣、(9)重金屬、(10)硫酸軟骨素鈉含量。各指標的測定方法與實施例1中相同。2、測定結果:收率為9.8%質量指標:①比旋度:-27.1°②含氮量:2.9%③酸度:6.5④氯化物:< 0.5%⑤硫酸鹽:<0.24%⑥干燥失重:8.2%⑦熾灼殘洛:25.3%⑧重金屬:<20ppm⑨硫酸軟骨素鈉含量:95.2%。實施例3、制備硫酸軟骨素鈉一、按照以下步驟制備硫酸軟骨素鈉:(I)原料預處理:將豬、牛喉骨、鼻中骨、氣管等軟骨組織投入洗料罐子中，加水浸泡，至全部淹沒，升溫至80°C左右，反復攪拌清洗，去掉肉渣、浮油、雜質，直至原料洗凈。將洗凈的原料投入到消化罐中，加入純化水至軟骨完全淹沒后加熱煮料，待煮沸后，應關小蒸汽，微開燜油2.5小時。待原料煮好后，打盡浮油。(2)酶解:將煮好的原料降溫至35°C，加入軟骨重量2%的食鹽，用稀堿溶液(40%的NaOH水溶液:100毫升水加40克氫氧化鈉)調節pH值至10，加入軟骨重量0.2%的堿性蛋白酶(購自石家莊興達酶制劑有限公司)酶解2小時，再用1:1鹽酸(鹽酸與水體積比)調節pH值至7，升溫至45°C，再加入軟骨重0.5%的胰酶(重慶奧力生物制藥有限公司生產)酶解3小時。酶解結束后用鹽酸調節pH值至6.3，升溫至80°C，靜置冷卻至50°C左右，用V型槽硅藻土作助濾劑過濾，得濾液。( 3)樹脂吸附:將上述酶解后的濾液抽入已清洗干凈的樹脂罐中，加入純化水調比重至1.03，溫度控制在35°C，按 軟骨重量45%添加SPN IV大孔強堿性陰離子交換樹脂，在攪拌狀態下吸附2小時。再將第一次吸附后的料液抽入另一樹脂罐中，用純化水調比重至
1.01,加入軟骨重量35%的樹脂,進行第二次吸附，時間為2小時。完成后,應放掉料液,合并兩次樹脂，用純化水漂洗樹脂兩次，得到漂洗后的吸附樹脂。(4)洗脫:將漂洗后的吸附樹脂再用濃度為12%的鹽水按樹脂重量1.5倍量進行第一次洗脫，時間為2小時，收集洗脫液。第一次洗脫放掉鹽水后，再用10% 15%的鹽水按樹脂重量等量進行第二次洗脫，時間為1.5小時。收集洗脫液，合并兩次洗脫液。洗脫后的樹脂用純化水動態漂洗3次，再用純化水浸泡備用。(5)脫色:將洗脫液泵入脫色罐中，用氫氧化鈉調節pH值至9，升溫至38°C，加雙氧水0.5%，靜置氧化脫色2小時左右，得到脫色后的溶液。(6)超濾:將上述脫色后的溶液超濾，超濾膜孔徑為10000道爾頓，得到超濾液。(7)沉淀:將超濾液用鹽酸調節pH值至5.9，加純酒精沉淀至濃度為70%左右，沉淀時間為5小時,得到硫酸軟骨素鈉沉淀。(8)脫水干燥:將硫酸軟骨素鈉沉淀用83%的酒精(質量百分比濃度)浸泡2次，每次2小時以上洗鹽，再用95%的酒精(質量百分比濃度)脫水2次，再離心。將離心后的硫酸軟骨素鈉置于雙錐回轉真空干燥機中干燥9小時,真空泵壓力為550 750mm萊柱,溫度為60。。。(9)粉碎過篩:將干燥完畢的硫酸軟骨素鈉粉碎,過80目篩，即得硫酸軟骨素鈉原粉。(10)包裝:將硫酸軟骨素鈉原粉即時包裝，密封，遮光，于干燥處保存。
二、測定制備的硫酸軟骨素鈉的質量指標1、各指標的測定方法:測定指標分別為:(1)收率、(2)比旋度、(3)含氮量、(4)酸度、(5)氯化物、(6)硫酸鹽、(7)干燥失重、(8)熾灼殘渣、(9)重金屬、(10)硫酸軟骨素鈉含量。各指標的測定方法與實施例1中相同。2、測定結果:收率為10.4%質量指標:①比旋度:-27.8。 -32。②含氮量:3.0%③酸度:6.4④氯化物:<0.5%⑤硫酸鹽:<0.24%⑥干燥失重:8.0%⑦熾灼殘渣:26.2%⑧重金屬:<20ppm⑨硫酸軟骨素鈉含量:94.5%。
權利要求
1.硫酸軟骨素鈉的制備方法，包括以下步驟: (1)酶解:向軟骨原料中加入軟骨重量1% 3.5%的食鹽，用稀堿溶液調節pH值至8 11，加入軟骨重量0.2 0.4%的堿性蛋白酶酶解I 3小時，再用鹽酸調節pH值至7 8，升溫至42 50°C，再加入軟骨重0.4 0.6%的胰酶酶解2 5小時；酶解結束后用鹽酸調節pH值至6 6.5，升溫至80°C，靜置冷卻至50°C左右，過濾，得到濾液； (2)樹脂吸附:向所述步驟(1)得到的濾液中加入強堿性陰離子交換樹脂，在攪拌狀態下吸附，后用純化水漂洗樹脂，得到漂洗后的吸附樹脂； (3)洗脫:將所述步驟(2)得到的漂洗后的吸附樹脂用鹽水進行洗脫，收集洗脫液； (4)脫色:將所述步驟(3)得到的洗脫液用氫氧化鈉調節pH值至8 10，升溫至37 40°C，加雙氧水靜置氧化脫色，得到脫色后的溶液； (5)超濾:將所述步驟(4)得到的脫色后的溶液進行超濾，得到超濾液； (6)沉淀:將所述步驟(5)得到的超濾液用鹽酸調節pH值至5.8 6.0，用質量百分比濃度為70% 75%的酒精沉淀3 6小時，得到硫酸軟骨素鈉沉淀； (7)脫水干燥:將所述步驟(6)得到的硫酸軟骨素鈉沉淀用酒精脫水后離心，干燥，即得到硫酸軟骨素鈉。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:在所述步驟(I)之前還包括將所述軟骨原料進行預處理的步驟；所述預處理的方法為將所述軟骨原料加水浸泡，升溫至80°C，攪拌清洗直至將原料洗凈。
3.根據權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中所述酶解溫度為30 40°C，所述鹽酸濃度為鹽酸與水體積比是1:1。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中所述強堿性陰離子交換樹脂的加入量為軟骨原料質量的40%-50%，吸附2 5小時。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中所述鹽水的質量百分比濃度為10%-15% ;所述洗脫為兩次洗脫，第一次洗脫中所述鹽水與所述吸附樹脂的質量比為1.5:1，洗脫時間為2-3小時；第二次洗脫中所述鹽水與所述吸附樹脂的質量比為1:1，洗脫時間為1_2小時。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中所述雙氧水為所述洗脫液重量的0.2%-0.8%，所述脫色的時間為2小時。
7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于:所述步驟(7)中所述用酒精脫水之前還包括將所述硫酸軟骨素鈉沉淀用質量百分比濃度為80 85%的酒精浸泡的步驟。
8.根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于:所述步驟(7)中所述干燥是采用真空干燥，溫度50 70°C，壓力550 750mm汞柱，干燥8 10小時。
全文摘要
本發明公開了硫酸軟骨素鈉的制備方法。本發明所提供的硫酸軟骨素鈉的制備方法，包括以下步驟(1)酶解；(2)樹脂吸附；(3)洗脫；(4)脫色；(5)超濾；(6)沉淀；(7)脫水干燥。采用本發明的制備方法制備得到的硫酸軟骨素鈉，產品干物質收率提高了2%，硫酸軟骨素鈉含量提高了10%，從而提升了產品附加值，降低了生產成本，提高了經濟效益。
文檔編號C08B37/08GK103214595SQ20131012493
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月11日 優先權日2013年4月11日
發明者冉崇榮, 朱占權, 陳曾, 蘭乾友 申請人:重慶奧力生物制藥有限公司