專利名稱：滅活微生物傳染性的安全套的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種滅活微生物傳染性的安全套。
技術背景 人類免疫缺陷病毒I型(HIV-1)感染和其他性傳播疾病(性病)感染是影響全球健康問題的主要原因。世界衛生組織估計，每年有3. 4億可治愈的性傳播感染的新病例。HIV-I病毒感染率已達到流行病水平，2009年估計有3330萬艾滋病毒感染者的人的數量，傳播疾病新發病例被治愈。有3330萬人群與艾滋病感染者共同生活，其中將近一半人的年齡在15-24歲。成年人感染HIV-I超過90%的是由異性傳播。由于大量的黏膜接觸到精液，導致女性特別容易通過異性傳播而感染HIV-I。雖然避孕套能預防HIV-I感染，但是存在有人對乳膠過敏的問題、較高的避孕套破損或者滑脫問題、即使是使用避孕套性交，仍然有1-2%的女性精液殘留檢測結果呈陽性的問題。此外，安全套仍有不能覆蓋到的黏膜區域從而對生殖器人乳頭狀瘤病毒(HPV)、單純皰疹病毒(HSV)、細菌和真菌感染的保護較弱。因此，研發出不僅能機械隔離宿主和病原體，還能直接破壞病原體傳染性的新型避孕套，是有效控制包括HIV-I和生殖器皰疹等病毒性感染疾病的好方法。最近大量研究表明，這項新興的跨多學科領域的納米技術將有助于克服治療的局限性，特別是將無機材料，如金，銀，鐵，鈦，銅，二氧化硅和氧化鋅與納米粒子組合到應用藥物中，包括癌癥治療，細胞和生物分子的標記和生物傳感器的制作。納米銀粒子(納米銀)由于具有強大的抗細菌，抗真菌和抗病毒藥物作用，受到了相當大的重視。納米銀粒子已被證明對幾種類型的病毒具有抗病毒活性，包括乙型肝炎病毒，單純皰疹病毒，呼吸道合胞病毒和痘病毒。此外，多項研究表明，納米銀粒子在體外具有抗HIV-I病毒活性，能夠在體外有效的抵抗各種不同的HIV-I型病毒株，包括實驗室株和臨床分離株，巨噬細胞-和T細胞-嗜株，還有逆轉錄病毒耐藥株。通過結合HIV-lgpl20，納米銀粒子能夠阻止⑶4細胞介導的病毒膜融合，從而抑制病毒的穿入和感染性。同時，研究表明納米銀粒子還能抑制HIV-I其他階段，表明納米銀粒子能作用于HIV-I病毒的生命周期的多個階段。這將降低病毒對納米銀粒子出現耐藥性的突變機率。使用安全套雖然是預防性病的重要手段，但是并不能徹底抵抗異性性傳播HIV-1，HSV-2，人類乳頭狀瘤病毒和細菌、真菌的感染。因此，使用壬苯醇醚9涂層安全套，曾被認為能提供抵抗性病的額外保護作用，但是最近的研究顯示，使用壬苯醇醚_9涂層安全套會導致生殖器粘膜炎癥和潰瘍，從而增加傳播感染性病的概率。到目前為止，市場上還沒有一種安全套能夠有效的直接破壞病原體傳染性。以往的研究表明，納米銀粒子具有抗炎性、廣譜抗菌和抗病毒活性作用。因此，在這項研究中，我們結合納米銀粒子和聚氨酯安全套各自優勢，研究他們抗病毒活性的潛能，包括有效的滅活HIV-I和HSV-1/2感染性。
實用新型內容本實用新型的目的是提供一種滅活微生物傳染性的安全套，該安全套制備方法簡單，能夠抑制病毒的穿入和感染性，而且對人體細胞沒有毒害。一種滅活微生物傳染性的安全套，是在安全套內外表面包被有納米銀粒子層；所述的包被的納米銀粒子層厚度為10-200納米。所述的安全套為聚氨酯安全套。所述的納米銀粒子的粒徑大小范圍是10至200納米之間。所述的納米銀粒子層是將聚氨酯安全套在納米銀粒子溶液中浸泡6個小時-過夜；接著將納米銀粒子包被的聚氨酯安全套用蒸餾水至少沖洗5次，每次5分鐘，然后在空氣中干燥形成的。所述的納米銀粒子溶液的制備過程如下硝酸銀水溶液中加入檸檬酸鈉溶液；觀察反應液的顏色改變，從無色到黃色然后渾濁，表明反應已經完成。具體是將100毫升7. OmM的檸檬酸鈉水溶液，在攪拌條件下慢慢煮沸，然后加入I. OmLO. IM的硝酸銀水溶液開始反應；觀察反應液的顏色改變，從無色到黃色然后渾濁，表明反應已經完成，制備成的納··米銀粒子的粒徑大小范圍是10至200納米之間。所述的滅活微生物傳染性的安全套的制備方法將聚氨酯安全套在納米銀粒子溶液中浸泡6個小時-過夜；接著將納米銀粒子包被的聚氨酯安全套用蒸餾水反復沖洗，然后在空氣中干燥即可。本實用新型的納米銀包被的聚氨酯避孕套有廣譜滅活微生物的活性，包括滅活HIV-I和HSV。本產品的一個最重要的特點是不僅能機械隔離宿主細胞和病原體，也能滅活微生物的感染能力，開啟了性病防御的另一道防線。此外，由于這些具有生物活性的納米銀粒子緊密結合在避孕套上，避免出現使用避孕套后納米銀粒子殘留體內，減少了使用后產生副作用的可能性。這種包被抗菌劑的安全套能安全和有效的阻止能通過粘膜表面的不同性傳播疾病。
圖1，納米銀包被PUC的能量色散X射線譜儀圖；分析確認PUC表面的銀元素的存在；圖2，聚氨酯安全套(Control,對照組)與納米銀包被聚氨酯安全套(Coated)的反射光譜分析圖；圖3，無納米銀粒子層聚氨酯安全套(對照組)和納米銀包被聚氨酯安全套(PUC)的紅外光譜分析圖；銀納米包被后的N-H高峰輕微移位明確表示納米銀粒子和聚氨酯NH鍵中氮之間的相互作用；圖4，納米銀包被I3UC的細胞毒性試驗結果圖；相同數量的人宮頸癌細胞(HeLa細胞)與納米銀包被的PUC或無納米銀粒子層的PUC接觸不同的時間(10，30和180分鐘)，然后將HeLa細胞在正常條件下進行培養I天，2天和4天，4天后通過細胞增殖實驗(WST-I)檢測細胞群的增長；圖5，納米銀包被的PUC對艾滋病毒感染10分鐘的抑制作用結果圖；圖6，納米銀包被的PUC對艾滋病毒感染30分鐘的抑制作用結果圖；圖7，納米銀包被的PUC對艾滋病毒感染60分鐘的抑制作用結果圖；圖8，納米銀包被的PUC對艾滋病毒感染120分鐘的抑制作用結果圖；[0022]HIV病毒(pNL4. 3)在含有納米銀包被PUC或無納米銀粒子層包被PUC (I平方厘米)的培養基中分別培養10，30，60和120分鐘(始終晃動)；然后，收集含有病毒的上清感染⑶4+C8166T細胞用于測量病毒感染能力；圖9，納米銀包被PUC對巨噬細胞(M)嗜性的HIV-I感染性的抑制作用結果圖；圖10，控制HIV-I的傳染必須通過病毒與納米銀包被PUC的直接接觸的證明結果圖；圖11，納米銀粒子包被PUC對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、微球菌、肺炎克雷伯菌的抑制作用結果圖；圖12，納米銀粒子包被PUC對熱帶念珠菌，克柔念珠菌，光滑念珠菌，白色念珠菌的抑制作用結果圖；納米銀粒子包被PUC或未包被PUC對細菌(A)和真菌的抑制作用；將一小塊納米銀包被的PUC或無包被的PUC (2平方厘米)浸泡在3mL含有IO5菌落形成單位每毫升(CFU/毫升)的金黃色葡萄球菌，或大腸桿菌，或微球菌，或肺炎克雷伯菌，或熱帶念珠菌，或克柔念珠菌，或光滑念珠菌，或白色念珠菌的穆勒希爾頓肉湯中.經過10分鐘搖動孵化，從試管中取出納米銀包被PUC或無納米銀粒子層PUC ;細菌繼續培養。用沒有浸泡安全套材料的含菌穆勒希爾頓肉湯作為陽性對照(PC);在371培養24h。然后使用ELISA酶標儀在600nm處測定光密度記錄細菌或真菌的生長率；圖13，本實用新型制備的滅活微生物傳染性的安全套的結構示意圖；I為聚氨酯安全套，2為包被的納米銀粒子層。
具體實施方式
以下結合實施例旨在進一步說明本實用新型，而非限制本實用新型。實施例I :制備納米銀包被聚氨酯安全套首先，我們將100毫升水檸檬酸鈉溶液(7. OmM)慢慢煮沸同時攪拌，然后加入
I.OmLO. IM的硝酸銀水溶液開始反應。觀察反應液的顏色改變,一般從無色到黃色然后渾濁，表明形成納米銀粒子的反應已經完成。然后，將聚氨酯安全套(PUCs)在納米銀粒子溶液中浸泡6個小時或過夜。接著將納米銀包被聚氨酯安全套用蒸餾水反復沖洗5次，每次5分鐘，洗刷掉任何離子的吸附，然后在空氣中干燥，最后形成聚氨酯安全套I內外表面均為包被的納米銀粒子層2的安全套。納米銀粒子結合聚氨酯顯示出金黃色。將納米銀包被聚氨酯安全套用高分辨率掃描電子顯微鏡、漫反射光譜和紅外光譜進行形態學分析(圖1，圖2和3)。高分辨率掃描電子顯微鏡照片顯示納米銀粒子結合的安全套表面能保持PUC的原有形態。納米銀粒子的大小在30-60納米范圍。對納米銀包被安全套的組成元素進行能量色散X射線光譜分析。分析顯示光吸收峰大約在3千電子伏。這是典型的金屬銀納米晶的吸收峰，從而證實了納米銀元素的存在。聚氨酯涂層與納米銀粒子的擴散反射光譜顯示峰值在430nm處，這是由于激發納米銀粒子形成了表面等離子體共振(圖2)。納米銀包被和非包被樣品的相關區域的紅外光譜如圖3所示。包被納米銀粒子后，在N峰有一個輕微的移位，而所有其他峰保持不變。結合力來自納米銀粒子和聚氨酯NH鍵中氮之間的相互作用。此外，涂層的方法不影響材料的化學性質。紅外光譜分析表明，在和納米銀粒子結合后，聚氨酯官能團保持完好(圖3)。因此，這種方法制造的避孕套保留其本質，重要的是，安全套的內外表面需要的地方已全部涂層，從而提供了隔離和滅活病原體的雙重功效。納米銀包被PUC的細胞毒性在進行抗菌性測試之前，要求對納米銀包被PUC接觸人體細胞會不會引起任何損害效果進行評估。首先，在不同的時間(10，30和180分鐘)內，相同數量的人宮頸癌細胞(HeLa細胞)與納米銀包被PUC或無包被的PUC接觸，然后將HeLa細胞在正常條件下進行培養，4天后通過細胞增殖實驗(WST-I)檢測分析。結果顯示，HeLa細胞接觸納米銀包被PUC 3小時內，對其生長沒有影響(圖4)。表明納米銀包被PUC沒有明顯影響HeLa細胞的存活和生長。研究還表明納米銀粒子不會被釋放出來，這是因為納米銀粒子和聚氨酯安全套上的氮原子結合很穩定。納米銀包被的PUC對HIV-I感染性的抑制作用我們還對包被在安全套上的納米銀粒子是否能夠直接滅活HIV-I的感染性進行了研究。首先讓HIV-1 (pNL4. 3)在含有納米銀包被PUC或無包被PUC (I平方厘米)的培養基中分別培養10，30，60和120分鐘(需不斷晃動含有病毒和納米銀包被PUC或無涂層I3UC的培養基，以確保病毒與PUC之間充分接觸)。同時，用沒有與PUC接觸的pNL4. 3-GFP+病毒作為陽性對照。孵化后，收集含有病毒的上清用于測量病毒感染CD4+C8166T細胞的能力。結果表明與陽性對照相比，暴露于正常PUC的HIV病毒的感染性沒有明顯變化(圖5，6，7，8)。然而，暴露于納米銀包被I3UC的HIV病毒的感染性被明顯抑制(圖5，6，7，8)。結果明確提示，即使接觸時間在10分鐘內，絕大多數pNL4. 3病毒會失去感染CD4+T細胞的能力(圖5,6,7,8)。光學顯微鏡檢查艾滋病毒誘導合胞體的形成和突光顯微鏡檢查艾滋病毒感染的細胞(綠色熒光蛋白+細胞)也能進一步證明納米銀包被的PUC對HIV-I感染有抑制作用。當PNL4. 3病毒接觸納米銀包被的PUC 30分鐘后，所有艾滋病毒已經失去感染力(圖5，6，7，8)。相反，HIV-1 (pNL4. 3)和無包被PUC接觸10或30分鐘不影響病毒的感染力，HIV-I仍能大規模的感染C8166T細胞(圖5，6，7，8)。納米銀包被的PUC對巨噬細胞(M)嗜性的HIV-I感染性的抑制作用我們進一步評估了納米銀包被的聚氨酯安全套(TOC)對巨噬細胞(M)嗜性的HIV-I感染性的抑制作用。將包被或未包被納米銀粒子的PUC放入含有M-嗜性的HIV-I病毒(pNL4. 3-BAL病毒株)的培養液。10, 30或60分鐘后，用含有病毒的培養液感染HeLaii -gal-CD4+-CCR5+細胞。同時，用等量的含未與PUC接觸的pNL4. 3-BAL病毒株的培養液感染HeLa β -gal_CD4+-CCR5+細胞作為陽性對照。感染48小時后，用MAGI法檢測病毒感染的陽性細胞(β_半乳糖苷酶陽性細胞)。如預期所料，病毒的感染性在接觸無納米銀粒子包被的PUC后沒有受到影響(圖9，比較4-6與7-9)。然而，病毒的感染性在接觸了納米銀包被的PUC后受到顯著抑制。30分鐘的接觸就可導致病毒完全失去感染性(圖9，比較1-3與4-6)。這個實驗表明，納米銀包被的PUC不僅對T-嗜性病毒有效，而且對M-嗜性病毒也非常有效。眾所周知，不同的HIV病毒株的致病性、毒力和對抗病毒藥的敏感性明顯不同，因此進一步評估納米銀粒子包被的PUC對不同的HIV-I病毒株以及耐藥株病毒株的廣譜抗病毒活性有很重要的意義。控制HIV-I的傳染必須通過病毒與納米銀包被PUC的直接接觸上述結果表明，當HIV-I與納米銀粒子包被的PUC共同孵育時，病毒的感染性顯著降低。然而，我們仍需進一步證實是附著于PUC的納米銀粒子具有抗HIV活性，或者是由于釋放到上清中的納米銀粒子的作用。因此,我們將納米銀粒子包被的PUC放入含200ul的RPMI-1640培養液的孔內(24孔板)并不斷搖晃30分鐘。然后，收集這200ul培養液到另外一干凈孔內，并加入等量的新鮮的RPMI-1640培養液到裝有納米銀粒子包被的PUC的孔內。HIV-lpNL4. 3GFP+病毒株被分別加入裝有這兩種不同培養液的孔內。孵育30分鐘后，含有病毒的培養液被用于感染⑶4+C8166T細胞。感染48小時后，通過測量上清液中GAG-P24水平來監測感染水平(圖10)。我們發現，直接接觸納米銀包被的PUC的病毒失去了感染能力(圖10)。然而僅接觸與納米銀粒子包被PUC孵育30分鐘的培養液的病毒仍顯示高感染能力。上述實驗表明，主要的抗病毒活性來源于附著于PUC的納米銀粒子。納米銀粒子包被PUC對單純皰疹病毒傳染性的抑制作用單純皰疹病毒(HSV)是另一種常見的傳染性病原體，能感染全球不同年齡范圍的人類群體。HSV-I感染的臨床表現多種多樣，從無癥狀感染，口腔唇皰疹到嚴重的腦炎不等，而HSV-2導致生殖器皰疹。有報道，過去十年中，由于免疫功能低下患者的增長和艾滋病毒感染的蔓延，HSV感染急劇增加。此外，大量的觀測數據表明，HSV-2感染生殖器能促進艾滋病毒通過陰道粘膜。因此，有必要測試納米銀包被PUC能否能阻止單純皰疹病毒的感染。首先，我們將200微升的含HSV-I或HSV-2病毒(50-500PFU)與納米銀包被的PUC或無涂層的PUC混合30分鐘。然后，收集含有病毒的上清感染Veix)-E6細胞，感染48小時后，記錄病毒引起的細胞病變效應(表I)。結果表明，暴露在無涂層PUC的HSV-I和HSV-2保持其感染力。有趣的是，當HSV-I和HSV-2病毒暴露于納米銀包被安全套后，完全喪失了感染能力。這些結果明確表明，納米銀包被的安全套對HSV-I和HSV-2具有較強的滅活能力。表I
權利要求1.一種滅活微生物傳染性的安全套，其特征在于，是在安全套內外表面包被有納米銀粒子層。
2.根據權利要求I所述的滅活微生物傳染性的安全套，其特征在于，所述的包被的納米銀粒子層厚度為10-200納米。
3.根據權利要求I所述的滅活微生物傳染性的安全套，其特征在于，所述的安全套為聚氨酯安全套。
4.根據權利要求I所述的滅活微生物傳染性的安全套，其特征在于，所述的納米銀粒子的粒徑大小范圍是10至200納米之間。
專利摘要本實用新型公開了一種滅活微生物傳染性的安全套；是在聚氨酯安全套(PUC)內外表面包被有納米銀粒子層。數據提示納米銀粒子通過與氮原子的相互作用而穩定地附著于PUC表面。而且HeLa細胞接觸納米銀包被PUC 3小時內沒有毒副作用。與HIV-1或者與HSV-1/2接觸，能夠有效地滅活這些病毒的傳染性，其抗病毒作用主要是通過PUC表面的納米銀粒子介導。此外，巨噬細胞嗜性HIV-1和T細胞嗜性HIV-1的病毒株對PUC表面的納米銀粒子都高度敏感。納米銀包被PUC還能夠抑制細菌和真菌的生長。研究表明，納米銀包被PUC能夠直接滅活微生物的感染，從而為安全套抵抗性傳播疾病提供另一道防線。
文檔編號C08L75/04GK202754933SQ201220183009
公開日2013年2月27日 申請日期2012年4月26日 優先權日2012年4月26日
發明者姚小劍, 肖獻忠, 穆罕默德·法亞茲, 敖竹君, 陳利玉 申請人:中南大學