專利名稱：一種靈芝菌絲體多糖鍺的提取方法
一種靈芝菌絲體多糖鍺的提取方法技術領域
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種靈芝菌絲體多糖鍺的提取方法。
背景技術：
靈芝是一種藥用價值很高的大型真菌，具有免疫調節、抗腫瘤、抗癌等功效，并且對心腦血管疾病具有較高的藥理活性。近年來國內外學者已從靈芝中分離出150余種化合物，可分為十大類多糖類、有機鍺、生物堿類、氨基酸蛋白質類、三萜類、油脂類、無機離子等。靈芝的藥理活性與靈芝中含有的高分子免疫多糖、有機鍺等有效化學成分密切相關。因此，研究靈芝有效化學成分具有重要意義。
靈芝多糖是靈芝主要活性成分之一，是抗衰老、扶正固本的主要有效成分之一，它能增強細胞的免疫調節作用，調節核酸和蛋白質的代謝平衡，清除氧自由基，提高體外傳代細胞分裂代數的能力。靈芝多糖能提高白細胞介素II產生，增強毒T細胞的功能，對小白鼠細胞內的SOD的活性有明顯的增強作用，可增強老年小鼠脾細胞內DNA多聚酶的活性，具有一定的抗衰老能力。靈芝多糖的免疫調節作用是廣泛的，不僅包括提高抗原提呈細胞、單核細胞吞噬系統的活性，而且包括增強細胞免疫和體液免疫功能，作用位點涉及從免疫前體細胞增生、分化到效應細胞的各個過程。靈芝多糖還具有抗腫瘤、增強機體耐缺氧能力、 抗疲勞、抗輻射、增加記憶力等作用，其具有的保健和藥用價值已得到研究人員和學術界普遍認可。
稀有元素鍺，是1866年德國學者文克列爾用光譜分析礦物時，首先發現的。100多年來的研究證明，元素鍺分為無機鍺和有機鍺兩類，無機鍺作為電子材料，人體腸道無法吸收，而有機鍺的種類可分為(I)合成有機鍺羥乙基鍺倍半氧化物、螺鍺等一類抗病毒、抗炎、抗癌有機鍺，具有廣泛的藥理作用的化合物，但服用過多會引起缺鈣。1967年日本醫學博士淺井一彥，首次研制成功了具有生物學活性的人工合成有機鍺氧化物Ge-182。(2)天然有機鍺由天然植物、真菌中提取或直接食用，對人體無任何毒副作用。許多名貴的中草藥人參、枸杞子、猢猻眼等及靈芝、山豆根、土豆等有色蔬菜等食用植物中都含有大量的天然有機鍺。(3)生物有機鍺是將鍺化合物植入生物體內，如酵母、細菌、大型真菌、蔬菜等， 使其與細胞某部位結合，轉化為大分子化合物，制成富鍺酵母、富鍺靈芝等。
有機鍺被譽為“人類疾病的克星”、“21世紀救命鍺”，其參與體內代謝，具有很強的氧化脫氫能力；有生血刺激作用，表現在增加紅細胞和血紅蛋白數量，刺激血小板生成，消除血管壁上的脂類附著物，所以對貧血和高膽固醇血脂及糖尿病有一定的療效；對某些癌腫、免疫功能低下、骨質疏松、早衰、高血壓癥等，有一定的保健效用。
國外對有機鍺研究的較早，研究最多的有日本、美國、前蘇聯等國家。當前，日本、 歐美各國學者對有機鍺化合物的研究和應用相當活躍，不少學者利用構效關系，設計了不同類型有機鍺化合物，進一步加強有機鍺化合物具有免疫，抗癌，抗衰老等功能的研究，從分子水平、電子水平探索其藥理機理。可以預期，隨著有機鍺藥理作用及其機理的進一步了解，它在防治人類及動物的疾病領域必將出現重大突破。
我國有機鍺的研究起步較晚，但近幾十年來，我國科研工作者在有機鍺，特別是在 Ge-132衍生物及其類似物的合成與生物活性研究上，做了大量的工作，發表了許多研究論文，在某些研究領域已經走在世界的前列，尤其是關于抗腫瘤作用方面的研究。
目前國內外臨床上使用的鍺大多為合成有機鍺，不少學者提出，合成有機鍺可能對身體造成一定的危害，而天然有機鍺具有對人體不會造成毒副作用，且不會在人體內存留等特性，因此，研究人體能自然吸收的天然有機鍺十分必要。
靈芝多糖和鍺都具有非常重要的生物學意義，因此有必要把兩者有機結合起來， 使其功能得到進一步強化。發明內容
本發明的目的是針對合成有機鍺可能會對人體造成損害及人們對天然有機鍺的需求不斷上漲等問題，克服現有技術缺點，提供一種把靈芝多糖和鍺有機結合，提取獲得靈芝菌絲體多糖鍺的方法。
本發明的特點是采用超聲波提取技術，從富鍺靈芝菌絲體中提取得到靈芝多糖鍺，具有純天然、無毒性、安全可靠、制備簡便等特性。
本發明靈芝菌絲體多糖鍺的提取方法，具體步驟如下
I.菌絲體預處理稱取富鍺靈芝菌絲體500. 0g，用O. 6-0. 9% NaCl溶液洗滌3_5 次，經布氏漏斗抽干，并吸去表面水分，獲得純凈菌絲體。
2.超聲波提取靈芝菌絲體中加入8-12L蒸餾水，40_60°C下超聲波提取 20-40min,低速離心10-20min,旋轉蒸發儀6(TC以下濃縮至一定體積。
3.乙醇沉淀靈芝菌絲體提取液中加入無水乙醇使乙醇終濃度達到80%，放置冰箱中過夜，低速離心10-20min,得粗多糖鍺。
4.去蛋白粗多糖鍺溶于6L蒸懼水中，于60°C下保溫5h溶解，3000rpm離心 IOmin,除去沉淀,采用Sevag法除蛋白，氯仿/正丁醇(體積比)和(氯仿+正丁醇)/樣品(體積比)分別為I : 0.2-0.4和I : O. 2-0. 5，攪拌，靜置分層，除去有機層，將蛋白質除去。、
5.精制將上述多糖鍺溶液加入無水乙醇使乙醇終濃度達到80%，沉淀多糖，離心，棄上清液，進行3-5次，干燥，得靈芝菌絲體多糖鍺成品。
本發明的有益之處在于采靈芝的生長過程可分為孢子期、菌絲體、原基、子實體， 其中菌絲體鍺含量最高。本發明利用富鍺靈芝菌絲體，采用超聲波提取技術，融靈芝多糖和鍺于一體，獲得了天然靈芝多糖鍺，可用于保健食品、化妝品及醫藥等領域，推進了多糖鍺類產品的發展。
圖I是靈芝菌絲體多糖鍺的一種提取方法的工藝路線圖，富鍺靈芝菌絲體經預處理、超聲波提取、乙醇沉淀、去蛋白、精制、干燥，得到含多糖和含鍺的靈芝多糖鍺。
具體實施方式
實施例I.
I.菌絲體預處理稱取富鍺靈芝菌絲體500. 0g，用O. 8% NaCl溶液洗滌3次，經布氏漏斗抽干，并吸去表面水分，獲得純凈菌絲體。
2.超聲波提取靈芝菌絲體中加入9L蒸餾水，40°C下超聲波提取25min，以 4500rpm離心IOmin,旋轉蒸發儀60°C以下濃縮至一定體積。
3.乙醇沉淀靈芝菌絲體提取液中加入無水乙醇使乙醇終濃度達到80%，放置冰箱中過夜，4500rpm離心IOmin,得粗多糖鍺。
4.去蛋白粗多糖鍺溶于6L蒸餾水中，于60°C下保溫5h溶解，3000rpm離心 IOmin,除去沉淀,采用Sevag法除蛋白，氯仿/正丁醇(體積比)和(氯仿+正丁醇)/樣品(體積比)分別為I : 0.2和I : O. 24，攪拌，靜置分層，除去有機層，將蛋白質除去。
5.精制將上述多糖鍺溶液加入無水乙醇使乙醇終濃度達到80%，沉淀多糖，離心，棄上清液，進行4次，干燥，得靈芝菌絲體多糖鍺精品。
實施例2.
I.菌絲體預處理稱取富鍺靈芝菌絲體500. 0g，用O. 7% NaCl溶液洗滌3次，經布氏漏斗抽干，并吸去表面水分，獲得純凈菌絲體。
2.超聲波提取靈芝菌絲體中加入IOL蒸餾水，45°C下超聲波提取25min，以 4000rpm離心15min,旋轉蒸發儀60°C以下濃縮至一定體積。
3.乙醇沉淀靈芝菌絲體提取液中加入無水乙醇使乙醇終濃度達到80%，放置冰箱中過夜，4000rpm離心1 2min,得粗多糖鍺。
4.去蛋白粗多糖鍺溶于6L蒸餾水中，于60°C下保溫5h溶解，3000rpm離心 IOmin,除去沉淀,采用Sevag法除蛋白，氯仿/正丁醇(體積比)和(氯仿+正丁醇)/樣品(體積比)分別為I : 0.3和I : O. 4，攪拌，靜置分層，除去有機層，將蛋白質除去。
5.精制將上述多糖鍺溶液加入無水乙醇使乙醇終濃度達到80%，沉淀多糖，離心，棄上清液，進行4次，干燥，得靈芝菌絲體多糖鍺精品。
實施例3.
I.菌絲體預處理稱取富鍺靈芝菌絲體500. 0g，用O. 9% NaCl溶液洗滌3次，經布氏漏斗抽干，并吸去表面水分，獲得純凈菌絲體。
2.超聲波提取靈芝菌絲體中加入IlL蒸餾水，40°C下超聲波提取25min，以 3500rpm離心IOmin,旋轉蒸發儀60°C以下濃縮至一定體積。
3.乙醇沉淀靈芝菌絲體提取液中加入無水乙醇使乙醇終濃度達到80%，放置冰箱中過夜，3500rpm離心15min,得粗多糖鍺。
4.去蛋白粗多糖鍺溶于6L蒸懼水中，于60°C下保溫5h溶解，3000rpm離心 IOmin,除去沉淀,采用Sevag法除蛋白，氯仿/正丁醇(體積比)和(氯仿+正丁醇)/樣品(體積比)分別為I : 0.25和I : O. 3，攪拌，靜置分層，除去有機層，將蛋白質除去。
5.精制將上述多糖鍺溶液加入無水乙醇使乙醇終濃度達到80%，沉淀多糖，離心，棄上清液，進行4次，干燥，得靈芝菌絲體多糖鍺精品。
實施例4.靈芝多糖純度的測定(苯酚-硫酸法)
I.標準曲線的制備
準確稱取葡聚糖標準應用液O. 0、0. 10、0· 20、0· 40、0· 80、1· OOmL于25mL比色管中，加水至2mL,加入苯酹溶液I. OmL,濃硫酸IOmL,沸水浴放置2min,冷卻至室溫,在485nm處，Icm比色皿測定吸光度值，繪制標準曲線。
2.樣品溶液的制備
取上述靈芝菌絲體多糖鍺精品O. 5mg,用2mol/L硫酸IOmL溶解后，加水定容至 50mLo
3.多糖含量測定
吸取樣品溶液ImL,于25mL比色管中，加水至2. OmL,加入苯酹溶液I. OmL,濃硫酸 IOmL,沸水浴放置2min,冷卻至室溫,在485nm處，Icm比色皿測定吸光度值。依據標準曲線， 計算多糖含量為95.5%。
實施例5.鍺含量的測定
I.樣品消化
準確稱取1.(^樣品放入消煮管中，加入5_101^ HNO3，靜置過夜后，在消煮爐 (120°C)上加熱。大量棕色煙霧過后，冷卻，滴加H2O2直至溶液清亮。繼續加熱溶液，保持微沸狀態，蒸發至約l_2mL取下。冷卻后用O. 01mol/L HNO3定容50mL后過濾。
2.石墨爐原子吸收法測定微量鍺
測定條件Pd (NO3) 2和Sr (NO3) 2混合基體改進劑IOuL ；
燈電流8mA；
波長265.2nm;
狹縫0.2nm ;
進樣量20uL。
標準曲線鍺濃度分別為OuL/L，10uL/L, 20uL/L, 40uL/L, 80uL/L, 120uL/L。
參考儀器條件如表I所示。
表I.石墨爐原子吸收法測定鍺的儀器條件
權利要求
1.一種靈芝菌絲體多糖鍺的提取方法，其特征在于，取富鍺靈芝菌絲體，經預處理、超聲波提取、乙醇沉淀、去蛋白、精制、干燥等技術分離純化，制得含多糖和含鍺的靈芝多糖鍺。
2.根據權利要求I所述的一種靈芝菌絲體多糖鍺的提取方法，其特征在于，所述的預處理為富鍺靈芝菌絲體采用0. 6-0. 9% NaCl溶液洗滌3_5次。
3.根據權利要求I所述的一種靈芝菌絲體多糖鍺的提取方法，其特征在于，所述的超聲波提取為向富鍺靈芝菌絲體中加入蒸餾水，40-60°C下超聲波提取20-40min，3500_4500rpm 離心 10_20min。
4.根據權利要求I所述的一種靈芝菌絲體多糖鍺的提取方法，其特征在于，所述的乙醇沉淀為加無水乙醇使靈芝菌絲體提取液中乙醇終濃度達到75-85%，放置冰箱中過夜，3500-4500rpm 離心 10-20min,得粗多糖錯。
5.根據權利要求I所述的一種靈芝菌絲體多糖鍺的提取方法，其特征在于，所述的去蛋白工藝為采用Sevag法，氯仿/正丁醇(體積比)和(氯仿+正丁醇)/樣品(體積比)分別為 I : 0. 2-0. 4 和 I : 0. 2-0. 5。
6.根據權利要求I所述的一種靈芝菌絲體多糖鍺的提取方法，其特征在于，所述的精制技術為向上述多糖鍺溶液加入無水乙醇使乙醇終濃度達到80%，沉淀多糖，離心，棄上清液，進行3-5次，干燥，得靈芝菌絲體多糖鍺成品。
7.根據權利要求I所述的一種靈芝菌絲體多糖鍺的主要指標為多糖純度達95%以上，鍺含量達16. 5mg/g以上。
全文摘要
本發明公開了一種靈芝菌絲體多糖鍺的提取方法，屬于生物技術領域。本發明對富鍺靈芝菌絲體進行預處理、超聲波提取、乙醇沉淀、去蛋白、精制、干燥等技術處理后，得到含多糖和含鍺的靈芝多糖鍺。本發明制備的靈芝菌絲體多糖鍺，多糖純度達95％以上，鍺含量達16.5mg/g以上，可用于保健食品、化妝品及醫藥等領域。
文檔編號C08B37/00GK102977222SQ20121055721
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月20日 優先權日2012年12月20日
發明者王秀英 申請人:西藏金稞集團有限責任公司