一種從泡葉藻中提取制備低分子巖藻聚糖硫酸酯的方法
【專利摘要】本發明涉及海藻化學領域，具體地說是一種從泡葉藻中提取制備低分子巖藻聚糖硫酸酯的方法。具體對泡葉藻（Ascophyllum?mackaii）分別采用稀鹽酸和水浸泡提取，浸泡液通過發泡機凈化提取液，分別收集上層漂浮物以及底層沉淀物并采用過濾收集和細胞破碎提取的方法充分提取收集泡葉藻中的多糖。超濾技術除去鹽分并獲得20000道爾頓之內的分級產物。乙醇沉淀法獲得巖藻聚糖硫酸酯粗品。DEAE-Sepharose?F.F.的陰離子交換樹脂色譜柱進行純化，分級。8-14KD透析袋再次分級、濃縮，低溫濃縮和冷凍干燥獲得巖藻聚糖硫酸酯產品。
【專利說明】一種從泡葉藻中提取制備低分子巖藻聚糖硫酸酯的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及海藻化學領域，具體地說是一種從泡葉藻中提取制備低分子巖藻聚糖硫酸酯的方法。
【背景技術】
[0002]巖藻聚糖硫酸酯(fucoidan)，又名巖藻多糖或褐藻糖膠，是一種水溶性的硫酸雜多糖，普遍存在于褐藻和一些棘皮動物中。研究發現巖藻聚糖硫酸酯具有抗凝血、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等多種生物學活性，并且隨著其應用價值的不斷提升，需求量也在增加。因此如何提高巖藻聚糖硫酸酯中主要成分的提取率是對其進行產業化利用的關鍵。
[0003]巖藻聚糖硫酸酯的主要成分除了 L-巖藻糖和硫酸根外，還含有半乳糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、糖醛酸、蛋白質等，越來越多的研究表明，其活性與硫酸根含量和位置密切相關。不同的提取方法、提取工藝條件對巖藻聚糖硫酸酯得率有很大影響，而且對其多糖含量與硫酸根含量的影響不同。雖然劉紅英等和李兆新等對巖藻聚糖硫酸酯的含量測定進行了一些探討，但由于其組成復雜還沒有標準方法。因此在提取純化過程中，評價指標也各不相同，大部分用粗多糖質量、粗多糖中多糖含量來表示。
[0004]由于巖藻聚糖硫酸酯主要由巖藻糖和硫酸根組成，這兩者的成分含量對巖藻聚糖硫酸酯的活性起很重要的作用。
【發明內容】
[0005]本發明目的在于提供一種從泡葉藻中提取制備低分子巖藻聚糖硫酸酯的方法。
[0006]為實現上述目的，本發明采用的技術方案為:
[0007]—種從泡葉藻中提取制備低分子巖藻聚糖硫酸酯的方法:
[0008]1)將泡葉藻原料于40-60°C下浸泡提取在泡葉藻原料干藻重量6-10倍的稀鹽酸溶液中1.3-4.8h，稀酸浸泡液待用，保留上層漂浮物；酸浸泡后的泡葉藻固體繼續加入其體積3-6倍的水溶液,攪拌浸泡4-7h，收集水浸泡液,將稀酸浸泡和水浸泡液合并待用；
[0009]2)將上層漂浮物調節至pH5.5-6.5，在經過濾或高速離心，收集過濾液A ；
[0010]將上述依次經稀酸和水浸泡后固態藻體采用納米高壓均質機進行細胞破碎，破碎后進行離心分離收集上清液B ；
[0011]3)將上述合并液、過濾液A和上清液B混合均勻后進行超濾去除鹽分，而后超濾濃縮至原料重量的1/2體積(V/W)，濃縮液進行醇沉淀，沉淀物干燥，即為巖藻聚糖硫酸酯粗干品;
[0012]4)將上述巖藻聚糖硫酸酯粗干品加入其3-5倍重量的蒸餾水中進行溶解，溶解后通過裝有DEAE-Sepharose F.F.的陰離子交換樹脂柱進行洗脫，收集洗脫液透析后于55-65°C低溫濃縮并冷凍干燥獲得，即得到原藻重量1.5-2.3%的巖藻聚糖硫酸酯。
[0013]所述泡葉藻原料為南非、智利、秘魯的泡葉藻或大型巨藻的一種或多種。
[0014]所述泡葉藻原料浸泡在濃度為0.08-0.28mo 1/L的稀鹽酸溶液中。[0015]所述步驟2 )收集固態藻體，使用美國NB納米高壓均質機在300-2300r/min的轉速下對底層固態藻體進行細胞破碎，破碎后以0-1600rpm速度進行離心分離，收集上清液B。
[0016]所述步驟3)合并提取液、過濾液A和上清液B混合均勻后，采用超濾技術去除鹽分，獲得10000-20000道爾頓的分級產物，而后進行超濾濃縮至原藻重量的1/2(V/W);所得濃縮液加入到其2-5倍體積的95%乙醇中，在5°C放置過夜使沉淀完全，收集沉淀物以1000-4000r / min,離心20min,收集沉淀用85%乙醇洗漆。
[0017]所述濃縮液加入到95%乙醇中，使濃縮液中的乙醇含量達到50-65%。
[0018]所述步驟4)溶解后依次用巖藻聚糖硫酸酯粗品重量3-5倍的蒸餾水和l-2mo I/L的氯化鈉溶液作為洗脫液進行陰離子交換樹脂柱洗脫，收集氯化鈉洗脫液并用8-14KD的透析袋進行透析。
[0019]本發明所具有的優點:
[0020]本發明從泡葉藻中提取出的藻聚糖硫酸酯含量明顯高于海帶；并有效的提高和保留了巖藻聚糖硫酸酯中活性成分其中泡葉藻主要包括南非泡葉藻以及智利和秘魯泡葉藻等。采用本發明采用DEAE-Sepharose F.F.的陰離子交換樹脂色譜柱對獲得的巖藻聚糖硫酸酯粗品進行純化。具有潛在的產業化推廣價值。
【具體實施方式】
[0021]實施例 1
[0022]稱取淡干南非、智利、秘魯等泡葉藻或巨藻100千克，切割成l_2cm小塊，轉移到具有溫度調節和分層出口的不銹鋼攪拌器中，加入900千克0.l%mo 1/L的鹽酸溶液，調節溫度到60°C，攪拌提取4h。靜置2h后打開出料口分別收集底層泡葉藻固體、上層漂浮物以及稀酸提取液。底層泡葉藻固體繼續加入300千克水，浸泡攪拌4h，1000r/min離心，繼續保留固體藻渣并收集水提取液。合并上述酸提取液和水提取液。
[0023]上層漂浮物用NaOH調節pH5.5，100目篩絹網過濾，收集過濾液A。將上述稀酸和水提取后的固體藻洛采用美國NB型納米高壓均質機以轉速1300r/min進行細胞破碎5min,破碎后用高速離心機進行離心分離(1000r/min),收集離心上清液B。合并稀酸和水提取液、過濾液A和上清液B。使用10%碳酸氫鈉調節pH到6.5，采用美國聯合碳化生產的MD34超濾技術除去鹽分，獲得15000-25000道爾頓的分級產物并超濾濃縮至50千克。濃縮液中加入150千克的95%乙醇，使超濾濃縮液中的乙醇含量達到50%，在5°C條件下靜置過夜達到沉淀完全。沉淀物轉移至高速離心機(4000r/min)離心20min,收集沉淀物并分別用3Kg95%乙醇和5Kg95%乙醇洗滌。向洗滌后的沉淀物中加入9Kg蒸餾水并充分攪拌溶解后通過裝有DEAE-S印haroseF.F.的陰離子交換樹脂柱(Φ0.6X 1.5m)。依次用IOKg蒸餾水和15Kglmol/L的氯化鈉溶液分別洗脫，收集氯化鈉洗脫液，并用8-14KD的透析袋進行透析，去除小分子多糖和鹽分。透析液在58°C溫度下濃縮，冷凍干燥獲得泡葉藻巖藻聚糖硫酸酯產品1.58Kg。產品得率可以達到1.6-1.7%，巖藻聚糖硫酸酯的純度可以達到85-90%。
[0024]實施例2
[0025]稱取淡干南非、智利、秘魯等泡葉藻或巨藻100千克，切割成l-2cm小塊，轉移到具有溫度調節和分層出口的不銹鋼攪拌器中，加入600千克0.2% mo 1/L的鹽酸溶液，調節溫度到40°C，攪拌提取1.3h。靜置3h后打開出料口分別收集底層泡葉藻固體、上層漂浮物以及稀酸提取液。
[0026]底層泡葉藻固體繼續加入500千克水，浸泡攪拌4h，1000r/min離心，繼續保留固體藻渣并收集水提取液。
[0027]合并上述酸提取液和水提取液。
[0028]上層漂浮物用NaOH調節pH6.5，100目篩絹網過濾，收集過濾液A。將上述稀酸和水提取后的固體藻洛采用美國NB型納米高壓均質機以轉速2000r/min進行細胞破碎3min,破碎后用高速離心機進行離心分離(1600r/min),收集離心上清液B。
[0029]合并稀酸和水提取液、過濾液A和上清液B。使用10%碳酸氫鈉調節pH到6.5，采用美國聯合碳化生產的MD34超濾技術除去鹽分，獲得15000-25000道爾頓的分級產物并超濾濃縮至50千克。
[0030]濃縮液中加入200千克的95%乙醇，使超濾濃縮液中的乙醇含量達到55%，在5°C條件下靜置過夜達到沉淀完全。沉淀物轉移至高速離心機(4000r/min)離心20min,收集沉淀物并分別用3Kg95%乙醇和5Kg95%乙醇洗滌。向洗滌后的沉淀物中加入13Kg蒸餾水并充分攪拌溶解后通過裝有DEAE-S^harose F.F.的陰離子交換樹脂柱(Φ 0.6X 1.5m)。依次用IOKg蒸餾水和15Kglmol/L的氯化鈉溶液分別洗脫，收集氯化鈉洗脫液，并用8-14KD的透析袋進行透析，去除小分子多糖和鹽分。透析液在58°C溫度下濃縮，冷凍干燥獲得泡葉藻巖藻聚糖硫酸酯 產品1.63Kg。
【權利要求】
1.一種從泡葉藻中提取制備低分子巖藻聚糖硫酸酯的方法，其特征在于: 1)將泡葉藻原料于40-60°C下浸泡提取在泡葉藻原料干藻重量6-10倍的稀鹽酸溶液中1.3-4.8h，稀酸浸泡液待用，保留上層漂浮物；酸浸泡后的泡葉藻固體繼續加入其體積3-6倍的水溶液,攪拌浸泡4-7h，收集水浸泡液,將稀酸浸泡和水浸泡液合并待用； 2)將上層漂浮物調節至pH5.5-6.5，在經過濾或高速離心，收集過濾液A ； 將上述依次經稀酸和水浸泡后固態藻體采用納米高壓均質機進行細胞破碎，破碎后進行離心分離收集上清液B; 3)將上述合并液、過濾液A和上清液B混合均勻后進行超濾去除鹽分，而后超濾濃縮至原料重量的1/2體積(V/W)，濃縮液進行醇沉淀，沉淀物干燥，即為巖藻聚糖硫酸酯粗干品； 4)將上述巖藻聚糖硫酸酯粗干品加入其3-5倍重量的蒸餾水中進行溶解，溶解后通過裝有DEAE-Sepharose F.F.的陰離子交換樹脂柱進行洗脫，收集洗脫液透析后于55_65°C低溫濃縮并冷凍干燥獲得，即得到原藻重量1.5-2.3%的巖藻聚糖硫酸酯。
2.按權利要求1所述從泡葉藻中提取制備低分子巖藻聚糖硫酸酯的方法，其特征在于:所述泡葉藻原料為南非、智利、秘魯的泡葉藻或大型巨藻的一種或多種。
3.按權利要求1所述從泡葉藻中提取制備低分子巖藻聚糖硫酸酯的方法，其特征在于:所述泡葉藻原料浸泡在濃度為0.08-0.28mol/L的稀鹽酸溶液中。
4.按權利要求1所述從泡葉藻中提取制備低分子巖藻聚糖硫酸酯的方法，其特征在于:所述步驟2)收集固態藻體，使用美國NB納米高壓均質機在300-2300r/min的轉速下對底層固態藻體進行細胞破碎，破碎后以0-1600rpm速度進行離心分離，收集上清液B。
5.按權利要求1所述從泡葉藻中提取制備低分子巖藻聚糖硫酸酯的方法，其特征在于:所述步驟3)合并提取液、過濾液A和上清液B混合均勻后，采用超濾技術去除鹽分，獲得10000-20000道爾頓的分級產物，而后進行超濾濃縮至原藻重量的1/2(V/W);所得濃縮液加入到其2-5倍體積的95%乙醇中，在5°C放置過夜使沉淀完全，收集沉淀物以 1000-4000r / min,離心20min,收集沉淀用85%乙醇洗漆。
6.按權利要求5所述從泡葉藻中提取制備低分子巖藻聚糖硫酸酯的方法，其特征在于:所述濃縮液加入到95%乙醇中，使濃縮液中的乙醇含量達到50-65%。
7.按權 利要求1所述從泡葉藻中提取制備低分子巖藻聚糖硫酸酯的方法，其特征在于:所述步驟4)溶解后依次用巖藻聚糖硫酸酯粗品重量3-5倍的蒸餾水和l_2mol/L的氯化鈉溶液作為洗脫液進行陰離子交換樹脂柱洗脫，收集氯化鈉洗脫液并用8-14KD的透析袋進行透析。
【文檔編號】C08B37/00GK103788219SQ201210424580
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年10月30日 優先權日:2012年10月30日
【發明者】韓麗君, 袁毅, 郭書舉, 曲桂艷, 劉旭 申請人:中國科學院海洋研究所