專利名稱：一種培氟沙星表面分子印跡聚合物的制備方法以及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種基于硅膠表面培氟沙星表面分子印跡聚合物的制備方法及應用， 屬于食品質量檢測及藥物分析領域。
背景技術：
培氟沙星是一種廣泛應用于獸藥和動物飼料添加劑的一類氟喹諾酮類抗生素。過量的使用會導致培氟沙星在動物組織中殘留，使之產生耐藥性和一些不良反應。而培氟沙星在食品中的殘留也引起了人們的關注。由于此類藥物可以通過乳汁分泌出來，因此牛乳中此類抗生素的殘留也成為了人們較為關注的問題，因為培氟沙星可以引起人體的一些不良反應，如頭暈、惡心、以及一些過敏癥狀如皮疹、皮膚瘙癢等。培氟沙星的檢測方法主要有液相色譜法、氣象色譜法、酶聯免疫法、氣象色譜-質譜法、液相色譜-質譜法等，酶聯免疫法雖然靈敏度高，但是，建立該方法需要復雜的過程包括抗原、抗體的制備，同時因其具有生物活性，因此在操作及儲存過程中條件也較為嚴格。對于色譜檢測方法，重點在于前處理，傳統的前處理方法是固相萃取法，該方法具有操作簡單、價格便宜、吸附容量大、易與檢測儀器連用等優點，已經成為了一種常用的樣品前處理技術。影響固相萃取效率的因素中，吸附劑的選擇尤為重要。傳統的分離抗生素的吸附劑為中性氧化鋁、C18等，對于一些復雜基質的樣品這些填料存在雜質去除不完全、目標樣品流失等缺陷。為了克服以上缺陷，研究者發明了具有高度特異性吸附的分子印跡技術替代傳統的吸附劑來作為固相萃取填料進行培氟沙星的殘留分析檢測。分子印跡技術也叫分子模板技術，屬于超分子化學的研究范疇，是指以某一特定的目標分子為模板制備對該分子具有特異選擇性聚合物的過程。分子印跡技術因其具有構效預定性、特異識別性和廣泛實用性等特點，引起了眾多研究者的興趣。此外，基于分子印跡技術制備的分子印跡聚合物具有選擇性高、高惡劣環境能力強、實用壽命長、穩定性好、 應用范圍廣等優點，也正因如此，分子印跡技術在色譜分離、固相萃取、藥物分析、膜分離、 環境監測、食品安全監測等領域具有樂觀的應用前景。傳統的分子印跡聚合物的制備方法主要有，主體聚合法、懸浮聚合法、沉淀聚合法。這些方法雖特異性強，但是存在一定的弊端，因識別位點埋藏深，使得模板分子進入和洗脫困難，因此吸附量少，制備方法也較為繁瑣，而表面分子印跡的出現克服了以上的缺點。雖然已有文獻報道制備出的分子印跡聚合物對有培氟沙星具有很好的選擇吸附性，但是所采用的方法基本為傳統的主體聚合和沉淀聚合的方法，這些方法存在這如下所述的弊端，如主體聚合法，其制備的聚合物需要研磨，此過程將會破壞很多識別位點，也有很多識別位點被掩蓋，模板分子的洗脫和吸附都很困難，比表面積小，粒徑不均勻導致柱效不穩定等現象的產生。
發明內容
為了解決傳統的分子印跡技術上的缺陷，本發明提供一種新的培氟沙星分子印跡固相萃取材料的制備方法，并優化確定了該發明材料的使用條件。儀器與試劑Nicolet Nexus470 紅外光譜儀(美國 Thermo Electron 公司)，1260 Infinity Series高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，Centrifuge 5804R冷凍離心機(德國印pendorf公司)，5sl020固相萃取儀(北京振翔工貿有限公司)。甲醇、三氯甲烷、二氯甲烷、乙腈、乙酸、甲苯、磷酸二氫鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、乙酸、四丁基溴化銨均為分析純(國藥集團)。甲基丙烯酸、偶氮二異丁腈、3-甲氧基氨丙基硅烷、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯均為化學純(上海源葉生物有限公司)，培氟沙星標準品(中國獸醫藥品監察所)。本發明制備的培氟沙星分子印跡固相萃取柱與傳統的固相萃取柱相比具有如下優勢制備過程簡單易行；得到的聚合物無需研磨粒徑均勻；柱效穩定，可重復使用；分子識別能力強，由于識別位點都位于硅膠表面，傳質速度快，吸附量大，洗脫完全；此外也可以對培氟沙星的結構類似物進行分離。從使用價值考慮可以用來做為一種色譜柱填料實現對抗生素培氟沙星的分離，克服了傳統固相萃取柱所存在的缺點。
圖I為印跡聚合物(MIPs)和非印跡聚合物(NIPs)的吸附曲線。
具體實施例方式實施例I培氟沙星表面分子印跡聚合物的制備I、硅膠的活化取適量硅膠將其溶于O. 25mol/LNa0H，室溫震蕩lh，洗滌后將其溶于8mol/LHCl， 90°C回流12h，洗滌后真空干燥，獲得活化硅膠。2、燒基化娃月父將活化后的硅膠有適量的硅烷化試劑3-甲氧基氨丙基硅烷，溶于甲苯溶液中 90°C攪拌回流12h，洗滌、真空干燥后獲得烷基化硅膠。3、聚合物的制備將烷基化的硅膠、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈、培氟沙星溶于甲醇/水(9 l，v/v)溶液中，混勻后于60°C水浴震蕩熱聚合48h.其中，硅膠為印跡載體，甲基丙烯酸為功能單體、乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑、偶氮二異丁腈為引發劑、 培氟沙星為模板分子、而甲醇水溶液為制孔劑。模板與功能單體的摩爾比為I : 4，功能單體與交聯劑的摩爾比為I : 5，引發劑與功能單體的摩爾比為I : 4 I : 6，溶劑體積用量與交聯劑的摩爾比例為2 I ；4、模板分子的去除將所得到的聚合物依次經三氯甲烷、甲醇、水洗滌，以去除未反應的物質，真空抽濾后將聚合物以PH為3的甲醇溶液進行索氏提取，直至模板分子洗脫完全，再經60°C真空干燥，得到培氟沙星分子印跡固相萃取材料。實施例2培氟沙星表面分子印跡聚合物的應用I、裝柱及固相萃取柱的活化稱取200mg培氟沙星分子印跡固相萃取材料(MIPs)加入到容量為3ml的聚丙烯固相萃取空柱中，在加入填料之前柱底部要事先加入一個篩板(孔徑)，在填料加入后在柱的上端也要加人篩板(孔徑)，用篩板插入工具壓緊，取5ml甲醇，5ml水活化固相萃取柱；2、樣品預提取牛奶樣品采用冷凍離心，之后用O. 22 μ m的微孔濾膜進行過濾。3、上樣、淋洗、洗脫及干燥定容將上述樣品提取液加入柱中，控制溶液過柱速度不超過O. 5ml/min，溶液全部流出后，用Iml的二氯甲烷淋洗，抽干柱體；以3X2ml 二氯甲烷淋洗柱體，棄去全部淋洗液；以 3X2ml甲醇(pH = 3，乙酸調節pH)洗脫，控制洗脫流速不超過O. 2ml/min，每次洗脫后要抽干柱體，收集全部洗脫液；將收集的洗脫液與40°C真空干燥至干，再以Iml的流動相復溶， 過O. 22 μ m有機濾膜，濾液供液相色譜測定(圖I)。
權利要求
1.一種培氟沙星表面分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于以硅膠為印跡載體，甲基丙烯酸為功能單體、乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑、偶氮二異丁腈為引發劑、培氟沙星為模板分子、甲醇水溶液為制孔劑；混勻后于60°c水浴震蕩熱聚合；模板與功能單體的摩爾比為I : 4，功能單體與交聯劑的摩爾1:5，引發劑與功能單體的摩爾比為1: 4 1 6，溶劑體積用量與交聯劑的摩爾比例為2 1 1。
2.權利要求I所述的方法，其特征在于還包括模板分子的去除，將權利要求I制備的聚合物依次經三氯甲烷、甲醇、水洗滌，以去除未反應的物質，真空抽濾后將聚合物以pH為 3的甲醇溶液進行索氏提取，直至模板分子洗脫完全，再經60°C真空干燥，得到培氟沙星分子印跡固相萃取材料。
3.權利要求2所述的制備方法，奇特征在于具體包括如下步驟1)硅膠的活化及烷基化取適量硅膠將其溶于O.25mol/LNa0H，室溫震蕩lh，洗滌后將其溶于8mOl/LHCl，90°C回流12h，洗滌后真空干燥，獲得活化硅膠；將活化后的硅膠、硅烷化試劑3-甲氧基氨丙基硅烷，溶于甲苯溶液中90°C攪拌回流12h，洗滌、真空干燥后獲得烷基化娃月父；2)培氟沙星分子印跡聚合物的制備將烷基化的硅膠2g、甲基丙烯酸4mol、乙二醇二甲基丙烯酸酯20mol、偶氮二異丁腈O. 25mmol、培氟沙星Immol溶于體積比為9 : I的40ml 甲醇/水溶液中，混勻后于60°C水浴震蕩熱聚合48h ；3)將所得到的聚合物依次經三氯甲烷、甲醇、水洗滌，以去除未反應的物質，真空抽濾后將聚合物以PH為3的甲醇溶液進行索氏提取，直至模板分子洗脫完全，再經60°C真空干燥，得到培氟沙星分子印跡固相萃取材料。
4.權利要求2所述培氟沙星表面分子印跡聚合物應用于制備固相萃取柱。
5.權利要求2所述培氟沙星表面分子印跡聚合物應用于分離富集生物樣品或食品中的培氟沙星。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于將權利要求3制備的固相萃取柱分離牛乳樣品提取液，以PH為3的甲醇溶液為洗脫溶劑、甲醇和水為柱的活化溶劑。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于上述牛乳樣品培氟沙星提取液的制備方法是取空白牛乳O. 5ml，加入O. 5mg/ml培氟沙星溶液O. 5ml，震蕩混勻，冷凍離心，上清液過O.22 um的有機濾膜，將濾液真空干燥后，復溶于O. 5ml的流動相中，用來測定。
全文摘要
本發明涉及一種培氟沙星表面分子印跡聚合物的制備及其應用。通過表面分子印跡的方法得到對培氟沙星具有高效識別性的聚合物。該分子印跡聚合物以硅膠為載體、以培氟沙星為模板、甲基丙烯酸為功能單體、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑、甲醇水溶液作為致孔劑，采用表面分子印跡技術合成分子印跡聚合物。將所得的聚合物作為固相萃取柱的填料制備得到培氟沙星固相萃取柱。同時將其應用于實際牛乳樣品中培氟沙星的檢測。本發明實現的生物樣品及食品中培氟沙星的高效分離、富集與純化，克服了傳統固相萃取柱的缺陷，所得固相萃取柱可重復使用，成本低，有良好的應用前景。
文檔編號C08J9/28GK102604008SQ201210067929
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月15日 優先權日2012年3月15日
發明者吳龍云, 孫秀蘭, 田秀梅, 蔣棟磊 申請人:江南大學