專利名稱：含樹枝狀聚賴氨酸基元的星型陽離子聚合物及其制備方法
技術領域：
本發明屬于生物醫學工程材料領域，特別涉及一種含樹枝狀聚賴氨酸基元的星型陽離子聚合物及其制備方法，以及其作為生物醫用材料的潛在應用。
背景技術：
基因治療是目前用于癌癥及先天性免疫系統疾病治療的一種有效方法。該技術實施的關鍵是選擇合適的基因載體及基因導入方法，進而使基因能夠在細胞中獲得安全、 高效、可控且穩定的表達。病毒載體因其高風險性、機體免疫反應、不能大規模生產等缺陷在臨床應用方面受到限制，因此具有高轉染效率的脂質體及其它陽離子聚合物日益受到重視。樹枝狀大分子是近年發展起來的一類具有三維規整結構、高度支化和納米尺度的單分散性高分子材料，憑借其獨特的分子結構、無免疫原性、可生物降解、易于修飾等特性在基因載體方面顯示出重要應用前景。1993年，Haensler等首次嘗試將聚酰胺-胺(PAMAM)用于基因轉染實驗(BioconjugateChemistry 1993,4:372-379)。目前， PAMAM及其衍生物已被廣泛用作基因載體研究，在特定條件下，其基因轉染效率及細胞毒性方面已優于聚乙烯亞胺(PEI)等常用的基因載體(Cancer Letters 2010,298 :34-49 ； MolecularPharmaceutics 2010,5:1734-1746)。這其中，將樹枝狀基兀與多臂分子結合制備星型陽離子聚合物成為國內外研究者關注的熱點。星形陽離子聚合物由于其發散的分子結構、臂數、臂長及陽離子的分布等參數易于設計和調節，在基因傳遞方面顯示出獨特的優勢。Uekama等通過化學偶聯將β -⑶連接到PAMAM的外圍,研究表明連接環糊精分子后的PAMAM抗血衆降解破壞的能力增強，其基因轉染能力明顯提高(Bioconjugate Chemistry 2003,14 :247-254)。Deng等通過點擊化學方法高效合成得到結構規整的星型 β-CD-PAMAM,并將其用于基因與藥物的共傳遞研究(Journal of Materials Chemistry 2011，21，5273-5281)。然而，PAMAM在較高代數或較高濃度下仍顯示出明顯的細胞毒性，且其降解產物也有較大的毒性，使其在體內實際應用中受到限制。因此，如何得到生物相容性好、結構規整可控的新型基因載體材料，便成為當前生物醫學工程領域亟待解決的重要課題。迄今為止，通過點擊化學方法合成星型環糊精接枝樹枝狀聚賴氨酸及其應用尚未見報道。
發明內容
為了解決上述現有技術中存在的不足之處，本發明的首要目的在于提供一種含樹枝狀聚賴氨酸基元(PLLD)的星型陽離子聚合物；該聚合物結構規整、易于調控，分子量分布單一，生物相容性好，可生物降解，在基因傳遞方面顯示出重要應用前景。本發明的另一目的在于提供上述含樹枝狀聚賴氨酸基元(PLLD)的星型陽離子聚合物的制備方法；該方法首先通過取代反應合成疊氮基團修飾的β-CD，通過連續交替的偶聯、脫保護反應合成3代含炔基PLLD ;然后通過點擊化學方法將疊氮基團修飾的β -CD
上述含樹枝狀聚賴氨酸基元的星型陽離子聚合物的制備方法，包括以下操作步驟··(I)疊氮基團修飾的β-環糊精(β_⑶-N3)的合成a、稱取三苯基膦溶解于無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后在室溫條件下加入碘單質，升溫至55 70°C ;再加入干燥的β-環糊精(β-ra)，N2氣氛下反應24 48 小時；反應結束后，減壓蒸餾除去無水N，N-二甲基甲酰胺，冰水浴條件下加入甲醇鈉溶液; 所得產物在甲醇中沉淀4 7次，然后真空干燥，得到七(6-碘基-6-去氧)-β -環糊精
與含炔基PLLD偶聯，合成得到可用作基因載體的星型陽離子聚合物。本發明的再一目的在于提供上述含樹枝狀聚賴氨酸基元(PLLD)的星型陽離子聚合物作為基因載體材料在制備基因藥物中的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一種含樹枝狀聚賴氨酸基元的星型陽離子聚合物，所述星型陽離子聚合物的分子式如下
權利要求
1.一種含樹枝狀聚賴氨酸基元的星型陽離子聚合物，其特征在于所述星型陽離子聚合物的分子式如下
2.根據權利要求I所述的一種含樹枝狀聚賴氨酸基元的星型陽離子聚合物的制備方法，其特征在于包括以下操作步驟(I)疊氮基團修飾的β_環糊精的合成a、稱取三苯基膦溶解于無水N，N-二甲基甲酰胺中，然后在室溫條件下加入碘單質，升溫至55 70°C;再加入干燥的β -環糊精,N2氣氛下反應24 48小時；反應結束后，減壓蒸餾除去無水N，N- 二甲基甲酰胺，冰水浴條件下加入甲醇鈉溶液；所得產物在甲醇中沉淀 4 7次，然后真空干燥，得到七(6-碘基-6-去氧)-β -環糊精；b、將步驟a所得七(6-碘基-6-去氧)-β-環糊精與疊氮鈉溶解于無水N，N-二甲基甲酰胺中，N2氣氛下升溫至50 70°C后反應24 48小時；反應結束后，減壓蒸餾除去無 7jC N, N- 二甲基甲酰胺，然后滴加到蒸餾水中進行沉淀，再用去離子水反復洗滌3 5次，室溫條件下真空干燥，得到疊氮基團修飾的環糊精；(2)含炔基的樹枝狀聚賴氨酸的合成CU代含炔基樹枝狀聚賴氨酸的合成將干燥的炔丙胺和N，N’ - 二叔丁氧羰基-L-賴氨酸溶解于無水N，N- 二甲基甲酰胺中，室溫條件下通入N2保護5 20分鐘后，再加入I-羥基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯，然后在室溫條件下反應12 24小時；反應結束后減壓蒸餾除去無水N，N-二甲基甲酰胺，所得產物用乙酸乙酯萃取，過柱分離；將分離產物溶解于二氯甲烷中，室溫條件下加入三氟乙酸，反應2 4小時后減壓蒸餾除去溶劑，所得產物用無水乙醚洗滌后真空干燥，得到I代含炔基樹枝狀聚賴氨酸；d、2代含炔基樹枝狀聚賴氨酸的合成將步驟c所得I代含炔基樹枝狀聚賴氨酸與N， N’ - 二叔丁氧羰基-L-賴氨酸溶解于無水N，N-二甲基甲酰胺中，室溫條件下通入N2保護 5 20分鐘后，加入I-羥基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯， 室溫條件下反應24 48小時；反應結束后減壓蒸餾除去N，N- 二甲基甲酰胺，所得產物用乙酸乙酯萃取，過柱分離；將分離產物溶解于二氯甲烷中，室溫條件下加入三氟乙酸，反應2 4小時，然后減壓蒸餾除去溶劑；所得產物用無水乙醚洗滌后真空干燥，得到2代含炔基樹枝狀聚賴氨酸；e、3代含炔基樹枝狀聚賴氨酸的合成將步驟d所得2代含炔基樹枝狀聚賴氨酸與N， N’ - 二叔丁氧羰基-L-賴氨酸溶解于無水N，N-二甲基甲酰胺中，室溫條件下通入N2保護 5 20分鐘后，加入I-羥基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯， 室溫條件下反應24 48小時；反應結束后減壓蒸餾除去N，N- 二甲基甲酰胺，所得產物用乙酸乙酯萃取，過柱分離；將分離產物溶解于二氯甲烷中，室溫條件下加入三氟乙酸，反應2 4小時，然后減壓蒸餾除去溶劑；所得產物用無水乙醚洗滌后真空干燥，得到3代含炔基樹枝狀聚賴氨酸；(3)星型陽離子聚合物的合成將步驟b所得疊氮基團修飾的β-環糊精和步驟e所得3代含炔基樹枝狀聚賴氨酸溶解于N，N- 二甲基甲酰胺中，室溫條件下通入N2保護20 30分鐘后，加入硫酸銅和抗壞血酸鈉，升溫至40 50°C反應24 48小時；反應結束后，將產物置于透析袋中透析2 3 天，冷凍干燥，得到星型陽離子聚合物。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(I) (3)所述室溫為5 35 0C ；步驟(I) (2)所述無水N，N-二甲基甲酰胺的制備方法按照以下操作步驟將氫化鈣加入到N，N-二甲基甲酰胺中，攪拌6 24小時，然后減壓蒸懼，得到無水N，N-二甲基甲酰胺，所述氫化鈣的加入量以每500mL N, N- 二甲基甲酰胺中加入I 2克計；步驟a所述干燥的β-環糊精的制備方法按照以下操作步驟將β-環糊精置于真空干燥箱中，50 80°C條件下干燥12 48小時；步驟c所述干燥的炔丙胺的制備方法按照以下操作步驟將氫化鈣加入到炔丙胺中攪拌6 24小時，然后減壓蒸餾，得到干燥的炔丙胺；所述氫化鈣的加入量以每IOmL炔丙胺中加入O. I O. 2克計。
4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟a所述β-環糊精、三苯基膦和碘單質的摩爾比為I : I. 2 I. 5 I. 4 1.6 ;所述無水N，N-二甲基甲酰胺以每100毫升中加入5 20克干燥的環糊精計；所述甲醇鈉溶液中甲醇鈉的摩爾數為干燥的 β -環糊精摩爾數的I. 5 2. O倍。
5.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟b所述七(6-碘基-6-去氧)-β-環糊精與疊氮鈉的摩爾比為I : 8 12;所述無水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升中加入5 20克七(6-碘基-6-去氧)-β -環糊精計。
6.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟c所述炔丙胺、N，N’- 二叔丁氧羰基-L-賴氨酸、I-羥基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N, N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯的摩爾比為I : O. 9 I. O I. O I. 2 I. O 1.2 ;所述無水Ν，Ν-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升中加入5 10克N，N’ - 二叔丁氧羰基-L-賴氨酸計；所述過柱分離是使用硅膠規格為300 600目的硅膠柱，洗脫液為體積比2 8 I的三氯甲烷與甲醇的混合溶液；所述二氯甲烷的使用量以每100毫升溶解5 15克分離產物；所述三氟乙酸的使用量為分離產物質量的5 10倍。
7.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟d所述I代含炔基樹枝狀聚賴氨酸、N，N’ - 二叔丁氧羰基-L-賴氨酸、I-羥基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯的摩爾比為I : 2. 2 2. 4 2. 4 2. 8 2. 4 2. 8 ;所述無水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升中加入5 15克N，N’ - 二叔丁氧羰基-L-賴氨酸計； 所述過柱分離是使用硅膠規格為300 600目的硅膠柱，洗脫液為體積比5 12 I的三氯甲烷與甲醇的混合溶液；所述二氯甲烷的使用量以每100毫升溶解5 15克分離產物； 所述三氟乙酸的使用量為分尚產物質量的5 10倍。
8.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟e所述2代含炔基樹枝狀聚賴氨酸、N，N’ - 二叔丁氧羰基-L-賴氨酸、I-羥基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯的摩爾比為I : 4. 2 4. 8 4. 4 5. O 4. 4 5. O ;所述無水N，N- 二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升加入10 20克N，N’ - 二叔丁氧羰基-L-賴氨酸計；所述過柱分離是使用硅膠規格為300 600目的硅膠柱，洗脫液為體積比12 18 : I的三氯甲烷與甲醇的混合溶液；所述二氯甲烷的使用量以每100毫升溶解5 15克分離產物； 所述三氟乙酸的使用量為分離產物質量的5 10倍；所述3代含炔基樹枝狀聚賴氨酸的分子式如下
9.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(3)所述疊氮基團修飾的β_環糊精、含炔基樹枝狀聚賴氨酸、硫酸銅和抗壞血酸鈉的摩爾比為I : 8 10 : 4 5 : 10 15 ;所述無水N，N- 二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升加入5 10克疊氮基團修飾的 β -環糊精計；所述透析袋的截留分子量為1000 3000。
10.根據權利要求I所述的星型陽離子聚合物作為基因載體材料在制備基因藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種含樹枝狀聚賴氨酸基元的星型陽離子聚合物及其制備方法和應用。該方法包括如下操作步驟先通過取代反應在β-環糊精C6位上引入疊氮基團，同時利用炔丙胺與N，N’-二叔丁氧羰基-L-賴氨酸之間的偶聯反應以及重復多步的縮合、脫保護反應合成含炔基的樹枝狀聚賴氨酸，然后將上述兩產物通過點擊化學方法偶聯得到含樹枝狀聚賴氨酸基元的星型陽離子聚合物β-CD-PLLD。所得聚合物具有結構規整、易于調控、分子量分布單一、生物相容性好、可生物降解等優點，有望在基因治療領域獲得廣泛應用。
文檔編號C08B37/16GK102604114SQ201210005079
公開日2012年7月25日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者張黎明, 曹凱迪, 陳弟虎, 馬棟 申請人:中山大學