專利名稱：一種霍山石斛中生物活性多糖的提取、純化方法
技術領域：
本發明涉及一種生物活性多糖的提取、純化方法，具體地說是一種霍山石斛中生物活性多糖的提取、純化方法。
背景技術：
霍山石斛最早記載于《本草綱目》，現為國家瀕危物種保護植物，資源珍稀，藥用價值極高，為歷代醫家所推崇，位列石斛之上品。霍山石斛的主要成分為多糖類，霍山石斛多糖為a-吡喃構型，平均分子量為2. 2X IO4Da,由葡萄糖、甘露糖和半乳糖按31 10 8的分子摩爾比組成，此外還含有少量的生物堿及多酚類物質，研究表明多糖成分與霍山石斛的藥效有著密切的關系。天然多糖應用研究現狀多糖作為藥物始于1943年，50年代發現真菌多糖具有抗癌作用，后來又發現地衣、花粉及許多植物均含有多糖類化合物，并進行分離提純，確定了其化學結構、物理化學性質、藥理作用，尤其對多糖類化合物的抗腫瘤和免疫增強作用進行深入研究，到了 60年代作為廣譜免疫促進劑而引起了醫藥界的廣泛關注，并逐漸認識到多糖及復合物分子具有極其重要的生物功能。1995年3月，亞洲分子生物學組織(AMBO)在日本舉辦了“糖生物學和糖工程”培訓班。越來越多的研究證明，多糖不但能治療機體免疫系統受到嚴重損傷的癌癥，還能治療多種免疫缺損疾病，如慢性病毒性肝炎和某些耐藥細菌和病毒引起的慢性疾病，以及諸如風濕病之類的自身免疫疾病，有的還能誘導干擾素的產生。同時，作為藥物的多糖在治療腫瘤時，不像一般化療藥物直接殺死生長著的腫瘤細胞活補體、巨噬細胞、T-淋巴細胞、B-淋巴細胞或加強抗體生成等，以達到抑制和消滅腫瘤細胞的作用，對正常細胞影響很小。如研究表明，紫草和枸杞多糖具有抗突變、抗衰老、增強免疫功能的作用；枸杞多糖等可抵抗自由基過氧化；牛膝、人參多糖可提高小鼠天然殺傷細胞(NKC)的活性，誘生腫瘤壞死因子(TNF)；香菇、商陸、松果、柴胡云芝多糖可激活巨噬細胞，從而抑制腫瘤生長；從三七、防風、甘草、刺五加中提取的多糖類化合物能激活網狀內皮系統，發揮抗腫瘤作用 ’靈芝多糖通過活化巨噬細胞和蛋白激酶C(H(C)而發揮免疫增強作用等等。目前，已有部分天然多糖類化合物用于臨床，顯示出良好療效，且無骨髓抑制等不良反應，可長期應用，預示了它抗腫瘤方面的良好發展前景。同時，多糖在治療腫瘤、代謝及感染性疾病等方面的應用仍在不斷擴大，給近代腫瘤、艾滋病及其它疾病的治療開辟了新的方向[1 3]。天然多糖的分離提純將多糖同低分子有機物、無機鹽等成分分離，或是同蛋白質、酯類、木質素等其它高分子量的自然產物分離。這樣提取的多糖通常具有多分散性，表現在化學組成、聚合度、 分子形狀等分布不均一。因此，還要將這種多分散的多糖混合物分離純化成分布均一的單個多糖組分。這種分離具有相當大的困難，但意義重大。因為初步研究表明，某種多糖的藥效活性與其組成、分子結構及分子量水平都密切相關。免疫應答對單糖的化學結構是非特異性的，它主要由分子大小決定而不是單糖的化學結構。由于不同的植物中所含成分不同，從其中提取多糖成分的具體方法有很大差異，但通常都包括水提、醇沉、除脂、除蛋白、 脫色、柱分離這些基本步驟。常規提取分離工藝復雜，生產周期長，從而增大了生產成本，使工業化生產和大規模臨床應用受到限制。石斛外壁有一定的纖維組織，所以常規提取方法時間較長，通常每次提取都在4 小時以上，且需多次提取，能耗較高，但提取率較低。石斛多糖的純化方法多采用有機溶劑除雜，工序繁瑣，得率較低，不適于工業化生產。目前市場上鐵皮石斛等制劑產品提取工藝簡單，多采用簡單水煎以粗多糖的形式利用，有的直接生藥打粉入藥，造成制劑作用成份不明確，質量可控性差，生物利用度低，服用量大，藥效不顯著等弊端，不符合中藥現代化的要求。霍山石斛除楓斗初加工產品外，其它類型產品市場幾乎空白。所以尋求新的提取、純化方法對該珍稀物種的開發將起到積極作用。微波萃取技術作為一種新型的萃取技術，具有加熱速度快，加熱均勻，節能高效， 易于控制，可減少溶劑用量等優點。與常規提取法相比，微波萃取法在選擇性與提取時間上都表現出無可比擬的優越性。與傳統的乙醇回流提取法相比較，利用微波輔助提取不僅可以提高多糖的提取率，而且可以大大縮短提取時間，具有提高有效成分的提取率和勞動生產率的優點。膜分離技術是指以選擇性透過膜為分離介質，當膜兩側存在某種推動力(如壓差、濃度差、電位差等)時，原料側組分可選擇透過膜，從而達到分離提純的過程。膜分離過程作為一種新型的分離方法，與傳統的分離過程如精餾、萃取、重結晶、吸附等相比，具有能耗低、單級分離效率高、可常溫操作、無相變及化學變化、選擇性高、設備簡單、無污染等優點，適于處理熱敏性物質和生物活性物質。將該上述兩項技術應用在霍山石斛多糖的制備中在國內外未見報道。
發明內容
本發明旨在提供一種霍山石斛中生物活性多糖的提取、純化方法，所要解決的技術問題是尋找一種提取、純化方法能夠在縮短提取時間、避免有機溶劑繁瑣萃取的前提下， 獲得較高純度的生物活性多糖。本發明解決技術問題采用如下技術方案本發明霍山石斛中生物活性多糖的提取、純化方法的特點在于按以下步驟操作(1)微波提取將霍山石斛粉碎成粗粉，向所得粗粉中加入粗粉質量10-30倍的水，于30-100°C微波恒溫提取1-30分鐘，提取1-4次；(2)濃縮合并步驟⑴得到的提取液，于真空度-0. 06 -0. 08MPa、溫度彡80°C 的條件下真空濃縮至相對密度為1. 10-1. 30 (600C )得到濃縮液；(3)醇沉向步驟(2)得到的濃縮液中加入95vt% (體積百分濃度，下同)乙醇， 靜置12-24小時后離心得到沉淀物；(4)膜過濾將步驟( 得到的沉淀物用沉淀物質量20-50倍的60_80°C水溶解， 在0. 35MI^壓力下使溶液通過分子量為100KD的超濾膜，收集截留液，然后在0. 35MI^壓力下使截留液通過分子量為300KD的超濾膜，收集通過液；(5)干燥將步驟(4)收集的通過液于真空度-0. 06 -0. 08MPa、溫度彡80 °C的條件下濃縮，然后在溫度< 60°C的條件下真空干燥，得到霍山石斛多糖提取物。
本發明霍山石斛中生物活性多糖的提取、純化方法的特點也在于步驟(1)中微波恒溫提取時微波的頻率為M50MHz或915MHz、功率為500-15000W。本發明霍山石斛中生物活性多糖的提取、純化方法的特點也在于步驟(3)中乙醇的加入量為所述濃縮液體積的1-5倍，使得含醇量達到50% -80% (體積百分比)。
與已有技術相比，本發明的有益效果體現在1、本發明方法可以將提取時間由每次4小時以上縮短到每次30分鐘以內，在相同提取次數下，粗提物得率可由20%提高到35%左右。純化后霍山石斛多糖得率可由5%左右提高到10% 15%，霍山石斛多糖含量由40%提高到60%以上。2、本發明與現有技術相比，可有效保持多糖結構的穩定、完整，不至于失活，同時顯著降低了能耗和生產成本。3、本發明采用膜技術對具有生物活性的多糖進行選擇性分離、純化，避免了有機溶劑萃取及有機溶劑殘留，適于規模化工業生產。用本發明方法制備的生物活性多糖提取物，多糖含量大于60%，質量收率介于 6% 15%之間。
四
圖1是葡萄糖標準曲線。圖2是霍山石斛多糖的分子量分布圖。圖3是本發明提取純化方法的工藝流程圖。
五具體實施例方式下面將通過實施例對本發明作進一步的描述，這些描述并不是要對本發明內容作出限定。本領域的技術人員應理解，對本發明內容的技術特征所作的等同替換，或相應的改進，仍屬于本發明的保護范圍之內。實施例1 1、微波提取將霍山石斛30g粉碎成粗粉，向所得粗粉中加入600mL水，于 2450MHz頻率、功率500W、60°C微波恒溫提取30min，提取4次，合并4次提取液；2、濃縮將步驟1得到的提取液在真空度-0. 07 -0. 08MPa，溫度彡70°C的條件下濃縮至相對密度為1. 15(60°C )得到濃縮液；3、醇沉向步驟2得到的濃縮液中加入95vt% (體積百分濃度，下同)乙醇得到混合液，混合液中乙醇的體積百分濃度為80vt %，靜置M小時后于4000轉/分鐘轉速下離心得到沉淀物4. 3g ；4、膜過濾向步驟3得到的沉淀物中加入IOOmL 60°C水使沉淀溶解，在0. 35MPa 壓力下使溶液通過分子量為100KD的超濾膜，收集截留液，然后在0. 35MI^壓力下使截留液通過分子量為300KD的超濾膜，收集通過液；5、干燥將步驟4收集的通過液于真空度-0. 06 -0. 08MPa、溫度彡80°C的條件下濃縮至相對密度1. 31 (60°C )，然后在真空度-0. 06 -0. 08MPa、溫度彡60°C的條件下真空干燥4小時，得到霍山石斛多糖提取物3. 6g。按照多糖含量測定方法測定，多糖含量為76. 6%。對提取物進行薄層色譜鑒別，結果顯示供試品色譜中在與葡萄糖、甘露糖、半乳糖對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色斑點。表明該多糖提取物含有霍山石斛多糖特征性成分。對比例1 取霍山石斛30g，粉碎成粗粉，加入600mL水于100°C水浴回流提取4小時，提取4 次，合并4次提取液，真空濃縮(真空度-0. 07 -0. 08MPa，溫度彡70。C )至相對密度為 115 (60 0C )得濃縮液，向濃縮液中加入95vt%乙醇得到混合液，混合液中乙醇的體積百分含量為SOvt %乙醇，靜置M小時后于4000轉/分鐘轉速下離心，得沉淀2. lg。按照多糖含量測定方法測定，多糖含量為40. 5%。通過對實施例1和對比例1的比較可以看出本發明提取方法與現有技術相比，在相同提取次數下，提取時間由16小時減少到了 2小時，大大減少了能耗，降低了生產成本。 多糖得率由提高到了 12%，提高了 71.4% ；多糖含量由40. 5%提高到76.6%，提高了 89. 1%。實施例2 1、微波提取將霍山石斛30g粉碎成粗粉，向所得粗粉中加入450mL水，于 2450MHz頻率、功率560W、80°C微波恒溫提取lOmin，提取4次，合并4次提取液；2、濃縮將步驟1得到的提取液在真空度-0. 07 -0. 08MPa，溫度彡70°C的條件下濃縮至相對密度為1. 19(60°C )得到濃縮液；3、醇沉向步驟2得到的濃縮液中加入95vt%乙醇得到混合液，混合液中乙醇的體積百分濃度為80vt%，靜置M小時后于4000轉/分鐘轉速下離心得到沉淀物4. 6g ；4、膜過濾向步驟3得到的沉淀物中加入IOmL 60°C水使沉淀溶解，在0. 35MPa壓力下使溶液通過分子量為IOOKD的超濾膜，收集截留液，然后在0. 35MI^壓力下使截留液通過分子量為300KD的超濾膜，收集通過液；5、干燥將步驟4收集的通過液于真空度-0. 06 -0. 08MPa、溫度彡80°C的條件下濃縮至相對密度1. 30 (600C )，然后在真空度-0. 06 -0. 08MPa、溫度彡60°C的條件下真空干燥4小時，得到霍山石斛多糖提取物3. Og。按照多糖含量測定方法測定，多糖含量為78. 2%。對提取物進行薄層色譜鑒別，結果顯示供試品色譜中在與葡萄糖、甘露糖、半乳糖對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色斑點ο本發明生物活性多糖含量測定參照《中國藥典》2010年版中多糖測定方法，采用硫酸-苯酚法，具體方法如下1、標準曲線的制備精密稱取105°C干燥至恒重的無水葡萄糖Hmg，置IOOmL量瓶中，加適量水溶解， 稀釋至刻度，搖勻，制成每毫升含140 μ g對照品溶液。分別精密量取對照品溶液0.2mL、 0. 4mL、0. 6mL、0. 8mL、l. OmL置具塞試管中，加水至2mL，再加入質量濃度5 %的苯酚溶液 lmL，搖勻，然后加入硫酸(質量濃度95% -98% ) 6mL，搖勻，置40°C水浴20min，取出，隨后置冰水浴中冷卻5min，取出。以相應的試劑為空白樣，通過紫外分光光度法在488nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。擬合葡萄糖標準曲線得到線性回歸方程y = 0. 04415X+0. 00861，相關系數為 0.9985。式中y為吸光度，χ為葡萄糖濃度(mg · mL—1)，標準曲線見圖1。
2、樣品測定取待測樣品2mL，測定吸光度，根據回歸方程計算多糖含量。多糖的藥理活性與其初級結構、高級結構、分子量、溶解度、粘度有著密切的關系， 多糖分子的多級結構又與其分子量有著直接的關系，一般分子量為100 200kDa的高分子多糖呈現較強的活性。多糖的生物活性與其分子量有著直接關系，而膜分離技術正是利用其不同的孔徑截留不同分子量物質的新型分離技術。本發明對霍山石斛多糖分子量的分布進行了測定。根據文獻4霍山石斛多糖為 a_吡喃構型，平均分子量為2. 2Xl(rt)a，由葡萄糖、甘露糖和半乳糖按31 10 8的分子摩爾比組成。本發明在35°C、0. 35MPa條件下選用截留分子量分別為400kDa、200kDa、lOOkDa、 IOkDa的濾膜對霍山石斛水溶液依次進行超濾，將多糖水溶液分為4段，測定每段的多糖含量，結果見圖2。由圖2可知，超濾后分子量> 400kDa的石斛多糖約占總糖的20. 2%，分子量在300-200kDa之間的石斛多糖占40. 1%，分子量在200_100kDa之間的石斛多糖占 26. 5%，分子量< IOkDa的寡糖和單糖約占13. 2%。分子量為100_300kDa的石斛多糖具有較強活性，因此，選擇分子量為100-300kDa的石斛多糖作為活性多糖制品進行后續實驗。對提取物進行薄層色譜鑒別。取多糖提取物約lOOmg，用IOmL體積濃度為5% 的硫酸100°c水解6小時，用質量濃度為的氫氧化鈉溶液中和剩余硫酸，作為供試品溶液。另取葡萄糖、甘露糖、半乳糖對照品，分別加水制成每ImL含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版附錄VI B)試驗，吸取上述溶液各 5ul，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇甲醇乙酸乙酯冰醋酸水的體積比為 12.5 4.5 5 1.5 1. 5的混合溶劑為展開劑，展開，取出，晾干，噴以體積濃度10% 的硫酸乙醇溶液。結果供試品色譜中在與葡萄糖、甘露糖、半乳糖對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色斑點。表明該多糖提取物含有霍山石斛多糖特征性成分。參考文獻[1]譚周進，謝達平.多糖的研究進展.食品科技，2002. 3 10 12[2]Shoji Uchiyama,Haramaki,Use of agaricus blazei murill to pre-vent or treat skin and other disorders, Uinted States Patent Appli—cation Publication, 2002[3]Naohito 0hno,Mai Furukawa,Noriko N. Miura, et al,Antitu-mor(β-goucan from the cultured fruit body of agaricus blazei, Bi-ol. Pharm. Bull. 24(7)820 ~ 828,2001[4]羅建平等。霍山石斛的研究進展。時珍國醫國藥，2010年第21卷第1期， 208-211[5]陳犛。石斛多糖提取工藝的研究。實驗研究，2010年4月第7卷第12期，40_41[6]錢葉，呂不望。石斛中石斛多糖的提取工藝研究。中國現代應用藥學雜志，2005 年8月第22卷第4期。[7]張紀立，何錦麗。石斛藥理研究進展。時珍國醫國藥，2000年第11卷第5期， 469-470。
權利要求
1.一種霍山石斛中生物活性多糖的提取、純化方法，其特征在于按以下步驟操作(1)微波提取將霍山石斛粉碎成粗粉，向所得粗粉中加入粗粉質量10-30倍的水，于 30-100°C微波恒溫提取1-30分鐘，提取1-4次；(2)濃縮合并步驟⑴得到的提取液，于真空度-0.06 -0. 08MPa、溫度彡80°C的條件下真空濃縮至相對密度為1. 10-1. 30得到濃縮液；(3)醇沉向步驟( 得到的濃縮液中加入乙醇，靜置12-24小時后離心得到沉淀物；(4)膜過濾將步驟C3)得到的沉淀物用沉淀物質量20-50倍的60-80°C水溶解，在 0. 35MPa壓力下使溶液通過分子量為100KD的超濾膜，收集截留液，然后在0. 35MPa壓力下使截留液通過分子量為300KD的超濾膜，收集通過液；(5)干燥將步驟(4)收集的通過液于真空度-0.06 -0. 08MPa、溫度彡80°C的條件下濃縮，然后在溫度< 60°C的條件下真空干燥，得到霍山石斛多糖提取物。
2.根據權利要求1所述的提取、純化方法，其特征在于步驟(1)中微波恒溫提取時微波的頻率為M50MHz或915MHz、功率為500-15000W。
3.根據權利要求1所述的提取、純化方法，其特征在于步驟(3)中乙醇的加入量為所述濃縮液體積的1-5倍。
全文摘要
本發明公開了一種霍山石斛中生物活性多糖的提取、純化方法，是將霍山石斛粉碎后加水微波恒溫提取，將提取液真空濃縮至相對密度為110-1.30得到濃縮液；向濃縮液中加入乙醇，靜置后離心得到沉淀物；將沉淀物加水溶解，在0.35MPa壓力下使溶液通過分子量為100KD的超濾膜，收集截留液，然后在0.35MPa壓力下使截留液通過分子量為300KD的超濾膜，收集通過液；將收集的通過液真空濃縮并干燥，得到霍山石斛多糖提取物。本發明可以縮短提取時間，在相同提取次數下，粗提物得率可由20％提高到35％左右；純化后霍山石斛多糖得率可由5％左右提高到10-15％，霍山石斛多糖含量由40％提高到60％以上。
文檔編號C08B37/00GK102391385SQ20111033029
公開日2012年3月28日 申請日期2011年10月26日 優先權日2011年10月26日
發明者張煒玲, 李俊, 王新生, 謝亞鳳, 金海英 申請人:安徽圣農生物科技股份有限公司