專利名稱：一種兩親性殼聚糖-膽汁酸衍生物及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種兩親性殼聚糖-膽汁酸衍生物及其制備方法，屬于生物醫藥技術領域。
背景技術：
很多用于治療的藥物由于溶解性能較差，使其應用受到很大的限制。改善藥物的溶解性，提高藥物的生物利用度是醫藥學面臨的急待解決的問題。兩親性聚合物在水介質中可以發生微相分離形成具有疏水性內核與親水性外殼的超分子聚集體，在藥學領域中主要作為難溶性藥物的增溶載體，避免了低分子表面活性劑增溶效果不理想、毒性較大的缺點，其疏水性的內核還可以保護藥物不降解，并控制藥物緩慢釋放，而親水性外殼則有助于膠束在血液中的長時間循環，因此是近年來藥物遞送系統中的研究熱點。作為藥物增溶載體的聚合物膠束大多是由單體合成的兩親性嵌段共聚物，但由于多數材料難以滿足生物相容性和生物可降解性等要求，大大限制了合成單體的選擇。目前已報道的親水性嵌段一般局限于聚乙二醇(PEG)和聚氧乙烯(PEO)，疏水嵌段局限于聚內酯或聚氨基酸類，后者作為疏水嵌段可能導致免疫反應，且肽鍵很容易被體內的酶分解，釋藥速率的控制不理想。因此，開發新型安全載體材料，可以促進聚合物膠束在藥學領域中的應用。殼聚糖(Chitosan)是由2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖以β-1，4糖苷鍵形式連接而成的多糖。廣泛存在于甲殼綱動物蝦和蟹的甲殼、昆蟲的甲殼、真菌的細胞壁等中，是自然界僅次于纖維素的第二大天然高分子。殼聚糖能被人體吸收利用，與人體的組織器官及細胞有良好的生物相容性，無毒，具有生物降解性，降解過程中產生的殼寡糖在體內部積累， 幾乎無免疫原性，同時具有多種生物活性，在臨床醫學、醫藥生物材料和組織工程材料方面顯示了多方面的應用，取得了許多意想不到的效果，參見蔣挺大.殼聚糖[Μ].北京化學工業出版社，2006 :205-270。同時，殼聚糖還有很好的吸附性、成膜性、通透性、成纖性、吸濕性和保濕性，已被廣泛應用于工業、農業、食品、日化、污水處理、紡織印染等領域。由于殼聚糖不能直接溶于水，限制了其應用范圍。為拓寬其應用范圍，可以利用其分子鏈上大量的活性基團——氨基和羥基，進行化學修飾，改善其水溶性和表面活性，提高應用價值。若在殼聚糖骨架上分別引入親水和疏水基團，即可形成水溶性的兩親性聚合物，使其具有良好的表面活性、泡沫性、乳化性、吸濕保濕性，參見隋衛平等.(2-羥基-3-丁氧基)丙基-羥丙基殼聚糖的應用性質[J].應用化學，2002，19 (9) :890-892.膽汁酸是存在于人體內的一種天然雙親分子，屬留類化合物。膽汁酸在肝臟中經酶催化合成，儲存于膽囊中，進入小腸參與脂肪的消化吸收，又通過腸膜吸收回到肝臟，從而參與肝腸代謝的循環過程，具有高度的生物活性和生物相容性。留核上有一個或多個羥基與三個甲基，而側鏈上則有一個羧基，羥基與側鏈羧基一起形成膽汁酸分子的親水部分， 而三個甲基則形成分子的憎水部分，所以膽汁酸體現明顯的雙親性。膽汁酸的獨特優異性能和結構特點使其在分子識別、人工受體、分子鉗、智能型分子傘以及生物醫用材料(細胞支架，組織修復替代材料，控釋及靶向藥物載體等)、智能高分子(熱敏材料，PH響應材料， 生物傳感材料等)等研究領域起到重要應用，參見歐陽貴平.膽酸衍生物的合成及其應用.合成化學，2009，17 O) :140-145。但是膽汁酸的水溶性和增溶效果較差，若將膽汁酸以側基的形式鍵合到水溶性高分子化合物，可以得到水溶性和增溶性好的兩親性化合物，參見Marieta Nichifor等.膽酸疏水改性葡聚糖在水中的聚合性質.高分子，1999，32 Ql) 7078-7085(Marieta Nichifor,Antonio Lopes,Adrian Carpov,Eurico Melo. Aggregation in Water of Dextran Hydrophobically Modified with Bile Acids. Macromolecules, 1999,32(21),7078-7085)。
發明內容
本發明針對現有技術中殼聚糖水溶性差、沒有增溶乳化能力等缺點，提供一種水溶性好的疏水改性的兩親性殼聚糖-膽汁酸衍生物及其制備方法。本發明的技術方案如下兩親性殼聚糖-膽汁酸衍生物，通式I如下
NHR1
CH2OR4
CH2OR4
O〉—。
OH
NH
C=O
OH式I 中，R1 為 H 或 COCH3 ；R2^R3 分別為-H 或-OH ；R4 為-CH2CH0HCH3 ；χ = 0. 5-0. 98， y = 0. 01-0. 2，ζ = 0. 01-0. 4，x+y+z = 1，η = 30-3000。x，y，ζ分別為所示單元的取代度，即所占的百分數，x+y+z = 1 ;n是所示單元重復的次數，η為30-3000，對應殼聚糖分子量約為5000-500，000。本發明通過在殼聚糖分子上引入疏水基團膽汁酸和親水基團羥丙基，得到兩親性高分子膽汁酸-羥丙基殼聚糖。本發明的兩親性殼聚糖-膽汁酸衍生物的制備方法，首先將殼聚糖(OB)與膽汁酸在活化試劑存在下反應得到膽汁酸-殼聚糖，然后對膽汁酸-殼聚糖進行羥丙基改性，步驟如下1、將殼聚糖(OB)溶于體積比濃度1-3%的醋酸中，得殼聚糖醋酸溶液；膽汁酸溶于甲醇中，甲醇用量與所述的醋酸體積相同，得膽汁酸甲醇溶液；將所述殼聚糖醋酸溶液與膽汁酸甲醇溶液混合，攪拌均勻，加入活化試劑于20-40°C反應15-30h，殼聚糖單元與膽汁酸摩爾比為1 0.1-1.0，產物由氨水中和后，用甲醇沉淀，過濾，濾餅用丙酮充分浸泡脫水，再過濾，濾餅分別用乙醇和丙酮洗滌，真空干燥，得到膽汁酸-殼聚糖。所述活化試劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的摩爾比(0. 1-1. 1) (0. 1-1. 1)的組合。2、將步驟1制得的膽汁酸-殼聚糖用堿性異丙醇堿化2_12h，加入環氧丙烷，殼聚糖單元與環氧丙烷摩爾比為1 1-10，30-60°C反應10-30h;產物冷至室溫，用醋酸或鹽酸中和，過濾，依次用體積比濃度75-100%的乙醇和丙酮洗滌，經真空干燥得兩親性殼聚糖-膽汁酸衍生物產品。所述殼聚糖是脫乙酰甲殼素，脫乙酰度為60-100%，分子量為5，000-500，000 ；所述膽汁酸為膽酸(CA)、脫氧膽酸(DCA)或石膽酸(LCA)。優選的，步驟1中所述活化試劑的用量為膽汁酸與1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的摩爾比為 1 (0.1-1.1) (0. 1-11)。進一步優選的，膽汁酸與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的摩爾比為1 0.2-0.5 0. 4-0. 8 ；最優選摩爾比為1 0. 2 0. 4。優選的，步驟2中所述堿性異丙醇是20-50% (w/v，單位g/ml)NaOH或20-50% (w/ v，單位g/ml)K0H與異丙醇按1 8-12體積比的混合；膽汁酸殼聚糖與NaOH或KOH的質量比為 1 0. 1-0. 5 ；進一步優選的，步驟2中所述堿性異丙醇是25-35wt% (w/v,單位g/ml)的NaOH 與異丙醇按1 9體積比的混合；膽汁酸殼聚糖與NaOH的質量比為1 0.2-0.4。本發明制備方法步驟1膽酸-殼聚糖是按以下方法制備的將1. Og殼聚糖用 IOOml的醋酸溶解，然后加入IOOml含0. 70 0. 76g膽酸、脫氧膽酸或石膽酸的甲醇溶液，攪拌均勻后加入0. 072g EDC和0. 086g NHS于25°C反應Mh。產物加入IOml氨水中和，加入200ml甲醇沉淀，過濾，濾餅用丙酮充分浸泡脫水，然后再用丙酮洗滌后真空干燥， 得到膽酸-殼聚糖。本發明通過在殼聚糖分子上引入了疏水基團膽汁酸和親水基團羥丙基，合成出的水溶性兩親性衍生物，使其除具有天然高分子的生物相容性、生理活性外，還具有高分子表面活性劑的優良性能，具有綠色、環保、多功能的特點，可以作為藥物增溶及緩釋載體，為生物、醫藥等領域提供優良的材料。本發明的主要原料殼聚糖是天然高分子，具有良好的生物相容性、無毒性，并且資源豐富；疏水基團膽汁酸也屬于天然產物，來源于生物體，具有良好的生物相容性和無毒性。本發明的兩親性殼聚糖-膽汁酸衍生物不僅保留了殼聚糖和膽汁酸的生物相容性、無毒副作用等性能，而且還具有良好的表面活性，水溶性和增溶性等高分子表面活性的特性， 可以作為藥物增溶及緩釋載體。同時本發明的制備方法簡便易行，產品穩定性好。
圖1是實施例1中殼聚糖(CHS)、膽酸-殼聚糖(CA-CHS)、膽酸-羥丙基殼聚糖 (CA-HPCHS)的紅外光譜圖。橫坐標是波長。圖2是實施例1中產品膽酸-羥丙基殼聚糖(CA-HPCHS)的核磁1H-NMR譜圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但對本發明并沒有限制。所用原料均為市購，其中殼聚糖是分子量為18萬、脫乙酰度90%，濟南海得貝海洋生物工程有限公司產售。實施例1 本實施例的兩親性殼聚糖-膽汁酸衍生物通式如發明內容中所述，其中，R2> R3均為-0H，R4 為-OI2CHOHCH3。制備方法如下1、將1. Og殼聚糖用IOOml的醋酸溶解，然后加入IOOml含0. 76g膽酸的甲醇溶液，攪拌均勻后加入0. 072g EDC和0. 086g NHS于25°C反應Mh。產物加入IOml氨水中和，加入200ml甲醇沉淀，過濾，濾餅用丙酮充分浸泡脫水，然后再用丙酮洗滌后真空干燥， 得到膽酸-殼聚糖。2、將步驟1制得的的膽酸-殼聚糖分散于IOml堿性異丙醇溶液中堿化10h，堿性異丙醇溶液是35wt%的NaOH與異丙醇按1 9體積比的混合。向溶液中加入4.細1環氧丙烷，在45°C水浴中回流反應24h后，冷至室溫。用醋酸中和、過濾，依次用80% (ν/ν)的乙醇和丙酮洗滌，經真空干燥得到產品。實施例1所得產品的結構表征實驗結果如下一、紅外光譜分析采用美國NIC0LET公司NEXUS-470型傅立葉轉換紅外光譜儀，將精制過的樣品與 KBr混合壓片，測得紅外光譜圖，如圖1所示。圖1為殼聚糖(CHS)、膽酸殼聚糖(CA-CHS)、 膽酸-羥丙基殼聚糖(CA-HPOB)的紅外光譜圖。由于CHS上仍有未脫掉的乙酰基，而膽酸又是通過酰胺鍵接枝到殼聚糖上的，故反映在紅外譜圖上沒有顯著變化。但仔細觀察，仍可看出微弱變化，如在1094ΠΠΓ1處C-O的伸縮振動峰和3446ΠΠΓ1處O-H的伸縮振動峰有所變寬，可能是膽酸上羥基所致。然而CA-HPCHS的紅外光譜與CHS的紅外光譜相比較，有明顯的變化。由環氧丙烷引入的羥基在1458ΠΠΓ1處形成一個很強的峰，是由于接上環氧丙烷而形成醚鍵所致。二、元素分析結果采用美國PE公司P-E 240C元素分析儀，經元素分析測得C、H、N在殼聚糖(CHS)、 膽酸殼聚糖(CA-OB)、膽酸-羥丙基殼聚糖(CA-HPOB)中的含量，結果見表1 表1元素分析的測定結果
CH N
CHS 40.749 1 ^
CA-CHS 40.989.33 7.77
CA-HPCHS 36.199.44 4.44通過元素分析的C/N比值可以計算CA-CHS和CA-HPCHS的取代度。計算公式如下C/N = 12X [6+2 X (1-χ)]/14(式 3. 1)C/N = 12 X [6+2 X (l_x) +24y]/14(式 3· 2)
C/N = 12 X [6+2 X (l_x) +24y+3z]/14(式 3· 3)式中χ表示CHS的脫乙酰度，y表示CA-CHS的取代度，ζ為CA-HPCHS的取代度。將元素分析測定結果代入以上公式可得y = 0. 9% ;z = 138%。三、1H-WR分析采用德國Bruker公司Bruker Avance 400，Ultrashield型核磁共振光譜儀，將精制過的膽酸-羥丙基殼聚糖(CA-HPCHS)樣品溶解于D2O中，以TMS為內標，磁場強度 299. 95MHz，記錄1H-NMR譜圖，如圖2所示，由圖2可以看出，CA-HPCHS的1H-NMR譜圖保留了殼聚糖的特征峰，即4. 3ppm、2. 5ppm處CHS的C1、C2上質子的共振吸收峰，3. 1-3. 8ppm處 C3、C4、C5、C6、C7上的重疊吸收峰。CA-HPCHS在0. 8-1. Oppm出現了膽酸和羥丙基上端甲基的吸收峰，1. 5-2. 2ppm處為膽酸的亞甲基和次甲基產生的特征多重吸收峰。實施例2 本實施例的兩親性殼聚糖-膽汁酸衍生物通式如發明內容中所述，其中，&為-H， R3 為-0H，R4 為-OI2CHOHCH3。制備方法如下1、將l.Og殼聚糖用IOOml的醋酸溶解，然后加入IOOml含0. 73g脫氧膽酸的甲醇溶液，攪拌均勻后加入0. 072g EDC和0. 086g NHS于25V反應Mh。產物加入IOml氨水中和，加入200ml甲醇沉淀，過濾，濾餅用丙酮充分浸泡脫水，然后再用丙酮洗滌后真空干燥，得到脫氧膽酸-殼聚糖。2、將步驟1制得的脫氧膽酸-殼聚糖分散于IOml堿性異丙醇溶液中堿化10h，堿性異丙醇溶液是35wt%的NaOH與異丙醇按1 9體積比的混合。向溶液中加入4.細1環氧丙烷，在45°C水浴中回流反應24h后，冷至室溫。用醋酸中和、過濾，依次用80% (ν/ν) 乙醇和丙酮洗滌，經真空干燥得到產品。實施例3 本實施例的兩親性殼聚糖-膽汁酸衍生物通式如發明內容中所述，其中，R2> R3均為-H，R4 為-OI2CHOHCH3。制備方法如下1、將1. Og殼聚糖用IOOml的醋酸溶解，然后加入IOOml含0. 70g石膽酸的甲醇溶液，攪拌均勻后加入0. 072g EDC和0. 086g NHS于25V反應Mh。產物加入IOml氨水中，加入200ml甲醇沉淀，過濾，濾餅用丙酮充分浸泡脫水，然后再用丙酮洗滌后真空干燥， 得到石膽酸-殼聚糖。2、將步驟1制得的石膽酸-殼聚糖分散于IOml堿性異丙醇溶液中堿化10h，堿性異丙醇溶液是35wt%的NaOH與異丙醇按1 9體積比的混合。向溶液中加入4.細1環氧丙烷，在45°C水浴中回流反應24h后，冷至室溫。用醋酸中和、過濾，依次用80%乙醇和丙酮洗滌，經真空干燥得到產品。實施例4 本實施例的兩親性殼聚糖-膽汁酸衍生物通式如發明內容中所述，其中，R2> R3均為-0H，R4 為-OI2CHOHCH3。制備方法如下1、將1. Og殼聚糖用IOOml的醋酸溶解，然后加入IOOml含1. 27g膽酸的甲醇溶液，攪拌均勻后加入0. 119g EDC和0. 143g NHS于30°C反應20h。產物加入IOml氨水中和，加入200ml甲醇沉淀，過濾，濾餅用丙酮充分浸泡脫水，然后再用丙酮洗滌后真空干燥， 得到膽酸-殼聚糖。2、將上述制備的膽酸-殼聚糖分散于IOml堿性異丙醇溶液中堿化12h，堿性異丙醇溶液是30wt%的NaOH與異丙醇按1 9體積比的混合。向溶液中加入5ml環氧丙烷，在 50°C水浴中回流冷凝反應20h后，冷至室溫。用醋酸中和、過濾，依次用80%乙醇和丙酮洗滌，經真空干燥得到產品。實施例5 本實施例的兩親性殼聚糖-膽汁酸衍生物通式如發明內容中所述，其中，&為-H， R3 為-0H，R4 為-OI2CHOHCH3。制備方法如下1、將1. Og殼聚糖用IOOml的醋酸溶解，然后加入IOOml含1. 22g脫氧膽酸的甲醇溶液，攪拌均勻后加入0. 119g EDC和0. 143g NHS于30°C反應20h。產物加入IOml氨水和，加入200ml甲醇沉淀，過濾，濾餅用丙酮充分浸泡脫水，然后再用丙酮洗滌后真空干燥，得到脫氧膽酸-殼聚糖。2、將上述制備的脫氧膽酸-殼聚糖分散于IOml堿性異丙醇溶液中堿化12h，堿性異丙醇溶液是30wt%的NaOH與異丙醇按1 9體積比的混合。向溶液中加入5ml環氧丙烷，在50°C水浴中回流冷凝反應20h后，冷至室溫。用醋酸中和、過濾，依次用80%乙醇和丙酮洗滌，經真空干燥得到產品。實施例6 本實施例的兩親性殼聚糖-膽汁酸衍生物通式如發明內容中所述，其中，R2> R3均為-H，R4 為-OI2CHOHCH3。制備方法如下1、將l.Og殼聚糖用IOOml的醋酸溶解，然后加入IOOml含1. 17g石膽酸的甲醇溶液，攪拌均勻后加入0. 119g EDC和0. 143g NHS于30°C反應20h。產物加入IOml氨水中和，加入200ml甲醇沉淀，過濾，濾餅用丙酮充分浸泡脫水，然后再用丙酮洗滌后真空干燥得到石膽酸-殼聚糖。2、將步驟1制得的石膽酸-殼聚糖分散于IOml堿性異丙醇溶液中堿化12h，堿性異丙醇溶液是30wt%的NaOH與異丙醇按1 9體積比的混合。向溶液中加入5ml環氧丙烷，在50°C水浴中回流冷凝反應20h后，冷至室溫。用醋酸中和、過濾，依次用80%乙醇和丙酮洗滌，經真空干燥得到產品。
權利要求
1.兩親性的殼聚糖-膽汁酸衍生物，其特征在于，通式I如下
2.權利要求1所述的兩親性的殼聚糖-膽汁酸衍生物制備方法，步驟如下(1)將殼聚糖溶于體積比濃度1-3%的醋酸中，得殼聚糖醋酸溶液；膽汁酸溶于甲醇中，甲醇用量與所述的醋酸體積相同，得膽汁酸甲醇溶液；將所述殼聚糖醋酸溶液與膽汁酸甲醇溶液混合，攪拌均勻，加入活化試劑于20-40°C反應15-30h，殼聚糖單元與膽汁酸摩爾比為1 0.1-1.0，產物由氨水中和后，用甲醇沉淀，過濾，濾餅用丙酮充分浸泡脫水，再過濾，濾餅分別用乙醇和丙酮洗滌，真空干燥，得到膽汁酸-殼聚糖；所述活化試劑為1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺摩爾比(0. 1-1. 1) (0. 1-1. 1)的組合；(2)將步驟(1)制得的膽汁酸-殼聚糖用堿性異丙醇堿化2-12h，加入環氧丙烷，殼聚糖單元與環氧丙烷摩爾比為1 1-10，30-60°C反應10-30h;產物冷至室溫，用醋酸或鹽酸中和，過濾，依次用體積比濃度75-100%的乙醇和丙酮洗滌，經真空干燥得兩親性殼聚糖-膽汁酸衍生物產品。
3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(1)所述殼聚糖是脫乙酰甲殼素，脫乙酰度為60-100 %，分子量為5，000-500，000。
4.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(1)所述膽汁酸為膽酸、脫氧膽酸或石膽酸。
5.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述活化試劑的用量為膽汁酸與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為 1 (0. 1-1. 1) (0. 1-1. 1)。
6.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述活化試劑的用量為膽汁酸與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 的摩爾比為 1 0.2-0.5 0.4-0.8。
7.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述活化試劑的用量為膽汁酸與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為.1 0. 2 0.4。
8.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟O)中所述堿性異丙醇是單位為 g/ml質量體積比20-50 %的NaOH或單位為g/ml質量體積比20-50 %的KOH與異丙醇按 1 8-12體積比的混合；膽汁酸殼聚糖與NaOH或KOH的質量比為1 0.1-0.5。
9.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述堿性異丙醇是單位為g/ ml質量體積比25-35wt%的NaOH與異丙醇按1 9體積比的混合；膽汁酸殼聚糖與NaOH 的質量比為1 0.2-0.4。
10.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(1)將l.Og殼聚糖用IOOml的體積比濃度醋酸溶解，然后加入IOOml含0. 70 0. 76g膽酸、脫氧膽酸或石膽酸的甲醇溶液，攪拌均勻后加入0. 072g EDC和0. 086g NHS于25°C反應24h ；所得產物加入IOml氨水中和，加入200ml甲醇沉淀，過濾，濾餅用丙酮充分浸泡脫水，然后再用丙酮洗滌后真空干燥，得到膽酸-殼聚糖。
全文摘要
本發明涉及一種兩親性殼聚糖-膽汁酸衍生物及其制備方法，所述兩親性殼聚糖-膽汁酸衍生物具有通式I的結構，其中，R1為H或COCH3；R2、R3分別為-H或-OH；R4為-CH2CHOHCH3；首先將殼聚糖在活化試劑EDC和NHS存在下與膽汁酸反應得到疏水的膽汁酸-殼聚糖，然后在堿性條件下與環氧丙烷反應得到水溶性好的膽汁酸-殼聚糖衍生物。本發明的方法可獲得表面活性、乳化性和增溶性良好的兩親性殼聚糖衍生物。可作為藥物增溶及緩釋載體。
文檔編號C08B37/08GK102260357SQ20111019668
公開日2011年11月30日 申請日期2011年7月14日 優先權日2011年7月14日
發明者宋朋, 李國寶, 隋衛平 申請人:濟南大學