專利名稱：牦牛骨制取硫酸軟骨素的一種方法
技術領域：
本發明涉及牦牛骨制取硫酸軟骨素的一種生產工藝。具體的說，本發明涉及以青藏高原特色物種牦牛屠宰后廢棄的鼻骨、喉骨、軟肋、氣管、月牙骨等軟骨為原料，采用雙酶解、過濾、乙醇沉淀、真空干燥等系列工藝制備硫酸軟骨素，屬于生化制藥技術領域。
背景技術：
硫酸軟骨素(Chondroitin Sulfate, ChS)是典型的多糖藥物品種之一，臨床應用歷史悠久，且應用范圍不斷擴大，除了對防治骨性關節炎有明顯效果外，硫酸軟骨素的復合制劑在神經痛、老年性肩痛、皮膚病等的治療中也有廣泛應用。隨著科技的進步，硫酸軟 骨素越來越多新的保健功能被發現硫酸軟骨素可增加脂肪酶的活性，使乳糜微粒中的甘油三酯分解，血液中乳糜微粒減少而澄清；具有抗凝和抗血栓作用，可用于冠狀動脈硬化、血脂和膽固醇增高、心絞痛、心肌缺血和心肌梗死等癥的治療；同時還可用于某些神經性頭痛，神經痛，關節痛，偏頭痛的治療以及鏈霉素引起的聽覺障礙及肝炎等的輔助治療；此外，硫酸軟骨素還被發現具有良好的抗衰老功能。硫酸軟骨素主要存在于動物的軟骨中，至今尚無法采用化學合成或生物合成方法制備，只能從動物的軟骨中提取。軟骨素為酸性粘多糖，在軟骨組織中與蛋白質結合成蛋白多糖，并被膠原蛋白分子包裹，所以在提取軟骨素時，首先要把蛋白質的鏈條切開，釋放出硫酸軟骨素。目前國內企業普遍采用強堿或稀堿破壞蛋白，然后加入酸水解、高鹽沉淀除去蛋白，大量的蛋白、酸堿以及高鹽隨生產廢水排放，造成嚴重的環境污染。據測算，每生產I噸硫酸軟骨素，就要排放5-10噸的蛋白、5-9噸的酸堿鹽等廢棄物，使硫酸軟骨素的生產帶來較大經濟效益的同時，也造成了極嚴重的環境污染，而憑借現有的污水處理技術，即使投入巨資，也難以處理如此高濃度的廢水，所以硫酸軟骨素的生產在發達國家基本全部停產。隨著我國對環保問題的重視，硫酸軟骨素的眾多生產企業也瀕臨關閉，迫切需要減少廢棄物產生、排放清潔生產技術的支撐。本發明硫酸軟骨素的制備創新采用牦牛軟骨作原料，自然條件下生產的牦牛軟骨保證了產品的綠色無污染性，與普通來源的硫酸軟骨素相比具有明顯的產品優勢。
發明內容
本發明提供了一種牦牛骨制取硫酸軟骨素的生產工藝，采用了一條新型、簡單、環保的技術路線，有效提高了產品質量，整個反應條件溫和，操作簡單，減少了牦牛廢棄物對環境的污染，滿足工業化生產的要求。本發明的方法包括下列步驟I.材料的預處理將鮮牦牛軟骨洗凈，放入80 1恒溫蒸煮鍋中，加水淹沒，煮3 4h后撈出，剔除軟骨上的肉、脂肪、軟骨包裹膜和纖維化硬骨組織等雜質，得到純凈軟骨，放入冷庫-18°C _20°C速凍，使骨質疏松，使用前取出，在60°C 80°C烘干3 4h，用粉碎機對牦牛軟骨破碎后備用。2.雙酶解采用堿性胰蛋白酶和酸性胃蛋白酶對預處理后的牦牛軟骨進行充分酶解。濾液用2mol/L HCI調節pH值至8. O 9.0，按1000 0.5(V濾液V胰酶)的比例加入胰酶，于40 50°C水解lh，再按1000 O. 5的比例加胃蛋白酶，40 50°C水解I. 5h。3.過濾酶解液冷卻后，用500目濾布過濾，再用MNWC-5000中空纖維超濾器濃縮體積的一半左右，得到濃縮過濾酶解液。
4.醇沉所得濾液在攪拌條件下加入95%酒精(食品級)，使溶液的酒精濃度達到65%，醇沉6-8h，虹吸上清液回收乙醇，壓濾，所得沉淀為硫酸軟骨素粗品。5.乙醇精制加入95%乙醇使溶液終濃度達75%，30分鐘攪拌一次，使細粒聚集成大顆粒沉淀，靜置8小時以上，吸去上清液，沉淀用無水乙醇脫水洗滌I 2次。6.真空干燥將所得沉淀抽干，于60°C 65°C真空干燥，即得到成品硫酸軟骨素。
具體實施例方式以下將參照實例對本發明作進一步的詳細描述，但本發明不限于此具體實例。實施例I.取新鮮牦牛喉骨10kg，洗凈，放入80°C恒溫蒸煮鍋中，加水淹沒，煮3h后撈出，剔除喉骨上的包裹膜和纖維化硬骨組織等雜質，得到純凈喉骨，放入冷庫-20°C速凍。待使用時，在70°C烘干3h，用粉碎機對牦牛軟骨破碎后備用；將潔白干凈的牦牛喉骨塊放入反應釜內，加入適量水，采用堿性胰蛋白酶和酸性胃蛋白酶對上述牦牛軟骨進行充分水解用2mol/L HCI調節pH值到8·5，按1000 O. 5 (Visa V胰酶)的比例加入胰酶，于45°C水解lh。再按1000 O. 5的比例加胃蛋白酶，45°C水解I. 5h;酶解液冷卻后，用500目濾布過濾，再用MNWC-5000中空纖維超濾器濃縮體積的一半左右，得到濃縮過濾酶解液。所得濾液在攪拌下加入95%酒精(食品級)，使溶液的酒精濃度達到65%，醇沉7h，虹吸上清液回收乙醇，壓濾，所得沉淀為硫酸軟骨素粗品；再加入95%乙醇濃度達75%，30分鐘攪拌一次，使細粒聚集成大顆粒沉淀，靜置9小時，吸去上清液，沉淀用無水乙醇脫水洗滌2次；將其抽干，于65°C真空干燥，即得成品硫酸軟骨素。對產品含量進行測定，硫酸軟骨素含量達到92. 45%，收率為 24. 39%。實施例2.取新鮮牦牛軟肋200kg，洗凈，放入80°C恒溫蒸煮鍋中，加水淹沒，煮4h后撈出，剔除喉骨上的包裹膜和纖維化硬骨組織等雜質，得到純凈軟肋，放入冷庫-20°C速凍；使用時80°C烘干4h，用粉碎機對牦牛軟骨粉碎后備用；將潔白干凈的牦牛喉骨塊放入反應釜內，加入適量水，采用堿性胰蛋白酶和酸性胃蛋白酶對上述牦牛軟骨進行充分酶解用2mol/L HCI調節pH值到8. 6，按1000 O. 5 (Visa V胰酶)的比例加入胰酶，50°C水解Ih ;再按1000 O. 5的比例加胃蛋白酶，50°C水解I. 5h;酶解液冷卻后，用500目濾布過濾，再用MNWC-5000中空纖維超濾器濃縮一半體積，得到濃縮過濾酶解液；所得濾液攪拌條件下加入95%酒精(食品級)，使溶液中酒精濃度達到65%，醇沉7. 5h，虹吸上清液回收乙醇，壓濾，所得沉淀為硫酸軟骨素粗品；再加入95%乙醇使終濃度達75%，30分鐘攪拌一次，使細粒聚集成大顆粒沉淀，靜置9. 5小時，吸去上清液，沉淀用無水乙醇脫水洗滌2次；將其抽干，于60°C真空干燥，即得成品硫酸軟骨素。對產品含量進行測定，硫酸軟骨素含量達到92. 31%，收率為 21. 89%。采用實施例2方法所得硫酸軟骨素產品檢測結果為
含量(干品計)92.31% 外觀白色粉末 水分6.6% 含氮量(干品計)3.1%
氯化物彡0.1%重金屬(以Pb計)<20ppm細菌數量<100cfb/g實施例3.取新鮮牦牛軟肋200Kg，洗凈，放入80°C恒溫蒸煮鍋中，加水淹沒，煮4h后撈出，剔除喉骨上的包裹膜和纖維化硬骨組織等雜質，得到純凈軟肋，放入冷庫-20°C速凍。待使用時，在80°C烘干4h，用粉碎機對牦牛軟骨破碎后備用。將潔白干凈的牦牛喉骨塊放入反應釜內，加入適量水，采用堿性蛋白酶胰蛋白酶和酸性蛋白酶胃蛋白酶對上述牦牛軟骨進行充分水解用2mol/L HCI調節pH值到8. 6，按濾液與胰酶1000 O. 5的比例加入胰酶，于50°C水解lh。再按1000 O. 5的比例加胃蛋白酶，50°C水解I. 5h。酶解液冷卻后，用500目濾布過濾，再用MNWC-5000中空纖維超濾器濃縮到體積的一半左右，得到濃縮過濾酶解液。所得濾液在攪拌下加入95%酒精(食品級)，使溶液的酒精濃度達到65%，醇沉7.5h，虹吸上清液回收乙醇，壓濾，所得沉淀為硫酸軟骨素粗品。再加入95%乙醇濃度達75%，每30分鐘攪拌一次，使細粒聚集成大顆粒沉淀，靜置9. 5小時，吸去上清液，沉淀用無水乙醇脫水洗滌2次。將其抽干，于60°C真空干燥，即得成品硫酸軟骨素。對產品含量進行測定，硫酸軟骨素含量達到92. 31%，收率為21. 89%。采用實施例1、2、3方法所得硫酸軟骨素產品檢測結果如表I所示。表I.硫酸軟骨素產品檢測結果
項目實例I實例2實例3 -
含量(干品計) 92.45% 91.89 92. 31
I觀—白色粉末白色粉末白色粉末
—水分I 7.0%6. 5%6.6%
權利要求
1.牦牛骨制取硫酸軟骨素的方法關鍵技術如下 (1)雙酶酶解法 采用堿性胰蛋白酶和酸性胃蛋白酶對預處理后的牦牛軟骨進行水解，濾液用2mol/LHCI調節pH值到8 O 9. O，按1000 0.5(V濾液V胰酶)的比例加入胰酶，40 50°C水解lh，再按1000 0. 5的比例加胃蛋白酶，40 50°C水解I. 5h。
(2)升溫鹽解 采用2%的NaCl進行鹽解，55°C恒溫0. 5小時后，80°C恒溫3 8min ； (3)醇沉 所得濾液攪拌下加入95%酒精(食品級)，溶液酒精濃度達到65%，醇沉6h 8h，虹吸上清液回收こ醇，壓濾，所得沉淀為硫酸軟骨素粗品。
(4)こ醇精制 加入95%こ醇濃度至終濃度達到75%，30min攪拌一次，使細粒聚集成大顆粒沉淀，靜置8小時以上，吸去上清液，沉淀用無水こ醇脫水洗滌I 2次。
2.根據權利要求I牦牛骨制取硫酸軟骨素方法，其特征在于加入胰蛋白酶后，最佳酶解條件為溫度50°C，pH值為8. 0 9. 0，胰酶加入量為0. 02g dF1 0. 04g dl'
3.根據權利要求I的牦牛骨制取硫酸軟骨素方法，其特征在于加入95%酒精(食品級)，溶液的酒精濃度達到65%，醇沉6. 5h 7. 5h為宜。
4.根據權利要求I牦牛骨制取硫酸軟骨素方法，其特征在于加入95%こ醇濃度達75%，每30min攪拌一次，靜置9h Ilh為宜。
5.根據權利要求I牦牛骨制取硫酸軟骨素方法，其特征在于獲得硫酸軟骨素產品，含量大于90%,收率大于18%。
全文摘要
牦牛骨制取硫酸軟骨素的一種生產工藝。本發明涉及利用青藏高原特色物種牦牛屠宰后廢棄的鼻骨、喉骨、軟肋、氣管、月牙骨等軟骨為原料，通過雙酶酶解法、沉淀分離、過濾、乙醇沉淀、真空干燥等系列工藝制備硫酸軟骨素。解決了目前本類產品生產工藝流程復雜、污染嚴重、堿酸或鹽用量較大、提取周期較長以及收率較低等問題。本法制取的硫酸軟骨素含量達到90％以上，收率達到18％以上；同時對牦牛廢棄原料的充分利用，減輕了對環境的污染，有效提高了資源利用率，且易于工業化生產。
文檔編號C08B37/08GK102850466SQ20111017637
公開日2013年1月2日 申請日期2011年6月28日 優先權日2011年6月28日
發明者高聚霞 申請人:西藏金稞集團有限責任公司