專利名稱：一種茶樹菇活性多糖及其制備方法
技術領域：
本發明屬于天然產物制備方法領域，更具體涉及一種茶樹菇活性多糖及其制備方法。
背景技術：
目前對真菌多糖藥用生理活性的基礎研究、真菌多糖提取工藝條件的探討雖有很多報道，但相關藥用生理活性研究缺乏對供試材料制備條件與活性試驗結果聯系的探討; 加工工藝的探討僅限于以多糖得率為評價指標優化其提取工藝，以多糖保存率和蛋白脫除率為評價指標優化脫蛋白工藝。由于不同的提取和脫蛋白工藝對多糖生物活性的保持有很大的影響，使得目前市場上出現的真菌多糖產品普遍缺乏明確的活性質量指標，產品推廣應用受到嚴重的制約。從真菌活性多糖產品質量明確、可控和經濟、高效開發產品的角度， 建立科學合理的真菌活性多糖提取、加工工藝綜合評價體系，成為促進真菌活性組分利用產品開發和廣泛應用的關鍵因素。
發明內容
為改善目前茶樹菇活性多糖產品開發加工工藝評價和選擇缺乏合理科學的方法， 導致茶樹菇多糖產品普遍缺乏明確的活性質量指標，產品推廣應用受到嚴重制約的現狀， 本發明提供一種具抗肝組織脂質過氧化作用和促進小鼠巨噬細胞吞噬作用的茶樹菇活性多糖的制備方法，該制備方法的思路也可適用于其他多糖的制備。本發明是通過如下技術手段實施的
一種茶樹菇活性多糖的制備方法包括茶樹菇粗多糖超聲提取、茶樹菇粗多糖脫蛋白處理步驟，以多糖抗脂質過氧化活性為產品標示主要活性指標；對溫度、時間、功率、PH進行單因素試驗和正交試驗，以提取物得率、生物活性檢測值綜合評分得分高的工藝條件，作為茶樹菇活性多糖的優化微波提取條件；以多糖保存率、生物活性檢測值、蛋白脫除率綜合評分得分高的工藝條件，作為茶樹菇活性粗多糖的優化脫蛋白條件；
所述提取物得率，生物活性檢測值綜合評分得分高，是指提取物得率權重系數設為 0. 4，多糖抗脂質過氧化活性權重系數設為0. 6，加權求和計算得分，得最高；
所述多糖保存率、生物活性檢測值、蛋白脫除率綜合評分得分高，是指多糖保存率的權重系數設為0. 3，多糖抗脂質過氧化活性的權重系數設為0. 3、蛋白脫除率的權重系數設為 0. 4，加權求和計算得分，得最高分。所述多糖抗脂質過氧化活性的檢測方法包括對茶樹菇粗多糖的抗小鼠肝組織脂質過氧化活性試驗。所述的茶樹菇活性多糖的主要活性成分是分子量為3X IO5的酸性多糖。本發明的優點為
1)本發明采用綜合評分法評價和篩選確定既能很好保持茶樹菇多糖生物活性，又具備較高茶樹菇多糖得率的提取工藝，與現有技術以多糖得率為指標優選提取工藝并獲得多糖后，將多糖樣品進行活性認定試驗的工藝研究方法相比較，本發明可以有效避免由于加工工藝評價不當，造成加工過程活性成分的丟失；
2)評價確法，脫蛋白處理工藝，可以保證活性多糖有較好的保存率、較高的蛋白脫除率，且脫蛋白茶樹菇活性多糖的活性能夠得到較好的保持，避免活性多糖組成的破壞，適應工業化生產脫蛋白茶樹菇活性多糖的需要；
3)制備過程所采用的工藝條件溫和，能夠最大限度的保持活性多糖的抗肝組織脂質過氧化活性、促進小鼠巨噬細胞吞噬活性，且活性多糖得率高，茶樹菇原料利用率高，加工經濟效益好；
4)本發明提出的茶樹菇活性多糖加工工藝優化方法和主要工作思路，不僅適用于本發明，而且同樣適用于其他涉及茶樹菇活性多糖加工工藝的探討，不同形式的茶樹菇活性多糖產品，如抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗突變、提高免疫力等茶樹菇活性多糖產品，通過調整活性試驗的方法，即可方便的完成相關工藝的優化、評價工作。
圖1為L9 (34)正交試驗設計表及結果；
圖2為不同脫蛋白方法對多糖保存率、蛋白脫除率及抗脂質過氧化活性的影響，注1) 表中數據為3次重復的平均值；大小寫字母分別表示經LSD檢驗在5%和1%水平上的顯著性差異。
具體實施例方式通過單因素試驗、正交試驗，獲得不同提取工藝條件下茶樹菇多糖得率及提取多糖抗肝組織脂質過氧化抑制率，綜合評分法評價和篩選確定既能很好保持茶樹菇多糖生物活性，又具備較高茶樹菇多糖得率的提取工藝，以該工藝條件(提取溫度80 °C、pH值7. 5、 超聲波處理30 min)制備茶樹菇活性粗多糖。采用Sevag法、酶法與^^叫法聯用、三氯乙酸法、三氯乙酸法與Sevag法聯用、 等電點法等方法，對茶樹菇活性粗多糖進行脫蛋白處理，以多糖保存率、蛋白脫除率、多糖脂質過氧化抑制率為指標，比較不同工藝脫蛋白效果及對茶樹菇多糖活性保持的影響，確定適宜的脫蛋白工藝，以該工藝條件對茶樹菇活性粗多糖進行脫蛋白處理，制備茶樹菇脫蛋白活性多糖。為實現茶樹菇活性多糖生產過程條件和產品質量可控，將茶樹菇脫蛋白活性多糖樣品經DEAE-52層析分離、活性跟蹤、主要活性部位分子量測定，明確茶樹菇抗肝組織脂質過氧化作用的主要活性成分多糖的分子量為3X105，該活性多糖對促進小鼠巨噬細胞吞噬作用也表現出較好的生物活性。在此基礎上，提出分子量3X IO5多糖可以作為本發明茶樹菇活性多糖產品的質量控制指標成分，并提出不同茶樹菇活性提取物產品的質量控制方法。本發明制得的茶樹菇活性多糖為淺茶色顆粒，略有特有的香味，溶于水，不溶于醇和油脂。茶樹菇活性粗多糖主要質量控制指標分子量3X IO5酸性多糖的含量> 40% ；蛋白質含量< 5%。茶樹菇脫蛋白活性多糖主要質量控制指標分子量3X IO5酸性多糖的含量> ；蛋白質含量< 2%。兩產品可作為原料藥或食品添加劑提供給制藥與食品加工企業，生產不同藥物或功能性食品。實施例1
1)、稱取茶樹菇干品500g，粉碎處理后，加1500mL水攪勻，依正交試驗設計的因素和水平，分別以不同條件(PH5-10，凍融、超聲、微波處理，50-100°C)浸提三次(正交試驗結果見圖1)，每次1. 5 h,5000 rpm離心15 min，棄沉淀留上清液，上清液濃縮至原體積的約1/4， 再加4倍于濃縮后體積的95%乙醇，醇析M h，5000rpm離心15 min,棄上清液，得各沉淀分離樣，測定各沉淀分離樣活性提取物得率和抗肝組織脂質過氧化活性，綜合評價確定優化提取條件；以優化條件提取制備活性提取物，冷凍干燥即得茶樹菇活性粗多糖；該茶樹菇活性粗多糖其主要活性成分3 X IO5酸性多糖含量> 40. 0%，蛋白質含量< 5. 0%。提取物得率的權重系數設為0. 4，抑制率的權重系數設為0. 6，以綜合分進行統計分析，結果見圖1。綜合評分Y=O. 4 X 100 / 0. 1456 + 0. 6 X 100 / 0. 1664 公式 1)； 直觀分析表明，以綜合評分為標準，在所選因素水平范圍內，細胞破碎方式和溶液PH
對茶樹菇粗多糖提取效果影響最大，溫度影響最小。經方差分析，各因素沒有顯著性，故以直觀分析選取最佳提取條件為A2B2C1，即溫度80°C、pH7. 5、凍融3次。綜上所述，高溫及強堿不利于多糖生物活性的保持，凍融處理能顯著提高多糖得率，且能很好的保持多糖生物活性，但不利于簡化工藝、降低成本的工業生產要求。因此依據正交試驗的結果，提取溫度80 1、？!1值7.5、超聲波處理30 min為最佳提取工藝組合。2)、取1)優化條件下所得茶樹菇活性粗多糖提取液，分別以Sevag法、酶法與^^叫法聯用、三氯乙酸法、三氯乙酸法與Sevag法聯用、等電點法進行脫蛋白處理， 4000rpm離心15min后，測定各脫蛋白樣多糖保存率、蛋白脫除率和抗肝組織脂質過氧化活性，綜合評價確定優化脫蛋白工藝條件；以優化工藝條件對茶樹菇活性粗多糖提取液進行脫蛋白處理將茶樹菇活性粗多糖提取液減壓濃縮至1/3體積，與氯仿-正丁醇混合液(氯仿正丁醇=4 1)等體積混合后，劇烈震蕩5min，靜置濁后，4000rpm離心15min，重復處理三次后，離心液加3倍體積95%乙醇，醇析Mh，4000rpm離心15min，丙酮洗滌沉淀，沉淀冷凍干燥即得茶樹菇脫蛋白活性多糖。該茶樹菇脫蛋白活性多糖其主要活性成分分子量 3X105酸性多糖的含量> 觀.0% ；蛋白質含量< 2.0%。用不同脫蛋白方法處理粗多糖的試驗結果見圖2 綜合評分參考公式1)；
三氯乙酸-Sevag法、酶-Sevag法和三氯乙酸法多糖保存率較高，分別達到85. 52%、 83. 43%,82. 88%，在LSD檢驗的5%水平上差異不顯著。等電點法、Sevag法多糖保存率較低為72. 34%、73. 06%,就多糖保存率這個指標而言，三氯乙酸-Sevag法、酶-Sevag法和三氯乙酸法效果較好。酶-Sevag法蛋白脫除率最高，達到79. 50%，與其他方法相比，在LSD檢驗的1%水平上差異極顯著，Sevag法次之，所以單從蛋白脫除率這個指標考慮，酶-Sevag法較好。沒有脫蛋白的多糖對脂質過氧化的清除作用效果最好，與脫蛋白的多糖相比，在 LSD檢驗的1%水平上差異極顯著(表3-1)，Sevag法和等電點法次之。生物體中的多糖可以多種形式存在，其中，聚糖與肽、蛋白結合可以形成糖肽或糖蛋白。茶樹菇粗多糖生物活性成分可能是粗多糖中的聚糖，也可能是其中的游離蛋白，也可能是糖與蛋白的結合物，需要分類探討。
酶法與Sevag法聯用脫蛋白率比較高，并且能很好的保持多糖含量，該結果和大量文獻資料報道的結論一致，酶法與Sevag法聯用是最佳的脫蛋白方法，但采用該工藝脫蛋白卻嚴重削弱了茶樹菇粗多糖的抗脂質過氧化作用能力。組合應用酶解技術，可能破壞了結合蛋白復合多糖的共價結合，從而降低了茶樹菇多粗糖的生物活性。Sevag法脫蛋白效率相對較高，由于反復重復操作，多糖損失很多，消耗了大量的有機溶劑，但是活性保持比較好。試驗結果提示，Sevag法脫除的蛋白可能大多是游離蛋白， 脫蛋白過程沒有破壞糖與蛋白的共價結合，
三氯乙酸法和三氯乙酸法與Sevag法聯用這兩種方法脫蛋白，脫除次數少、損耗有機溶劑少，對多糖的保存有利，脫蛋白效果也比較好，但由于三氯乙酸法條件劇烈，對多糖的活性破壞很嚴重，所以活性很差。未經脫蛋白工藝處理的茶樹菇粗多糖對脂質過氧化作用的清除效果最好。該試驗結果表明，蛋白存在形態以及其受損程度對茶樹菇粗多糖活性的保持具有較大的影響。綜上所述，茶樹菇多糖的抗脂質過氧化活性是蛋白和多糖共同作用的結果，茶樹菇粗多糖組成中，多糖與蛋白間可能存在共價結合，活性成分為復合多糖。因此為了更好的保持多糖的生物活性，茶樹菇多糖主產品開發，最好不做脫蛋白處理。從增加產品種類，更好的適應產品市場的多種需求考慮，應根據市場需求的情況，開發生產一定量的脫蛋白茶樹菇多糖產品，該類產品生產過程脫蛋白工藝以Sevag法為宜。以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
權利要求
1.一種茶樹菇活性多糖的制備方法，其特征在于所述制備方法包括茶樹菇粗多糖超聲提取、茶樹菇粗多糖脫蛋白處理步驟，以多糖抗脂質過氧化活性為產品標示主要活性指標；對溫度、時間、功率、PH進行單因素試驗和正交試驗，以提取物得率、生物活性檢測值綜合評分得分高的工藝條件，作為茶樹菇活性多糖的優化微波提取條件；以多糖保存率、生物活性檢測值、蛋白脫除率綜合評分得分高的工藝條件，作為茶樹菇活性粗多糖的優化脫蛋白條件。
2.根據權利要求1所述的一種茶樹菇活性多糖的制備方法，其特征在于所述提取物得率，生物活性檢測值綜合評分得分高，是指提取物得率權重系數為0. 4，多糖抗脂質過氧化活性權重系數為0. 6，加權求和計算得分，得最高得分。
3.根據權利要求1所述的一種茶樹菇活性多糖的制備方法，其特征在于所述多糖保存率、生物活性檢測值、蛋白脫除率綜合評分得分高，是指多糖保存率的權重系數為0.3， 多糖抗脂質過氧化活性的權重系數為0. 3、蛋白脫除率的權重系數為0. 4，加權求和計算得分，得最高分。
4.根據權利要求1所述的一種茶樹菇活性多糖的制備方法，其特征在于所述多糖抗脂質過氧化活性的檢測方法包括對茶樹菇粗多糖的抗小鼠肝組織脂質過氧化活性試驗。
5.一種如權利要求1、2、3或4所述的制備方法制備的茶樹菇活性多糖，其特征在于 所述的茶樹菇活性多糖其主要活性成分是分子量為3X105的酸性多糖。
全文摘要
本發明涉及一種茶樹菇活性多糖及其制備方法，該方法以茶樹菇為基礎材料，引入活性評價指標，經提取、脫蛋白條件試驗，對多指標進行綜合分析，評價和篩選既能很好保持茶樹菇多糖生物活性，又具備較高茶樹菇多糖得率的提取加工工藝，以優化的工藝條件制備茶樹菇活性粗多糖和茶樹菇脫蛋白活性多糖，通過茶樹菇脫蛋白活性多糖樣品柱層析分離、活性跟蹤、主要活性部位分子量測定，明確茶樹菇活性多糖抗肝組織脂質過氧化作用的主要活性成分是分子量為300000酸性多糖，該多糖對促進小鼠巨噬細胞吞噬作用也表現出較好的生物活性。該方法可以避免提取，分離多糖工藝評價選擇的盲目性，通過以生物活性為指標制備的茶樹菇活性多糖，具有良好的經濟效益。
文檔編號C08B37/00GK102276744SQ20111016378
公開日2011年12月14日 申請日期2011年6月17日 優先權日2011年6月17日
發明者俞白楠, 葉舟, 呂千, 呂楊蘭, 康彥斌, 李會霞, 汪世華 申請人:福建農林大學