專利名稱：蜆殼花椒果皮多糖的制備方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域。
背景技術：
腫瘤是目前危害人類健康的主要疾病之一。國內外對抗腫瘤藥物的研究發現，化學抗癌藥物在作用于靶細胞的同時危機正常細胞，臨床上應用的治療腫瘤化學藥物大多都會導致突變遺傳毒性，但中草藥的突變遺傳毒性不太明顯。中草藥抗癌活性成分主要包括皂甙、多糖、生物堿及其他成分，其中多糖抗腫瘤作用機制主要包括以細胞毒為主的直接抗腫瘤機制和免疫作用為主的間接抗腫瘤機制，已成為當今抗腫瘤新藥發展的主要方向之
O蜆殼花椒(Zanthoxylum Dissitum Hemsl.),又名單面針、山枇杷、大葉花椒、麻瘋刺、九牛藤、公麒麟、蛘殼花椒等，屬蕓香科花椒屬攀援藤本植物，根、莖及葉均可人藥，臨床上有祛風活絡、散瘀止痛、解毒消腫之功效，民間用于治療腰腿疼痛、關節疼痛、跌打損傷等癥。蜆殼花椒也是許多中成藥組方中的主要成分，如婦科千金片，婦科外用洗液等，具有很高的藥用價值。近年來，對蜆殼花椒的研究主要為基礎研究，如化學成分分析、組織培養技術及生物學特性方面，據報道，蜆殼花椒中性親脂性成分對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌均有抑制作用，而對蜆殼花椒多糖的提取方法及抗腫瘤活性等方面研究，至今未見文獻報道和專利公開。
發明內容
本發明的目的是提供一種具有抗腫瘤作用的中草藥有效部位-蜆殼花椒果皮多糖的制備方法。本發明的另一個目的在于提供一種蜆殼花椒果皮多糖作為在制備緩解和治療癌癥藥物中的應用。本發明是蜆殼花椒果皮多糖的制備方法及用途，其方法的步驟為(I)將干燥的蜆殼花椒果皮用粉碎機粉碎成40 60目的粉末；(2)置于提取器內，以有機溶劑脫脂，重復此步驟兩次，過濾，得到脫脂后的濾渣；(3)按蒸餾水體積mL與濾渣重量g之比為10 20 1，向濾渣中加入蒸餾水，在100°c提取2 3h，重復此步驟三次，合并三次提取液；(4)用Sevag法，或者酶解法除蛋白，離心，得上清液；(5) 50°C 80°C減壓濃縮上清液，使溶液體積mL為第(I)步的蜆殼花椒粉末重量g的4 6倍，得到濃縮液；(6)向濃縮液中加乙醇至醇濃度為80%，靜置過夜，離心得到沉淀，干燥沉淀得到艦殼花椒果皮多糖。其用途是蜆殼花椒果皮多糖在制備緩解和治療癌癥藥物中的用途。本發明的方法簡單，適于工業化生產，通過制備方法制得的蜆殼花椒果皮多糖以苯酚硫酸法測得總多糖含量> 76%，經過體外抗腫瘤試驗，證明蜆殼花椒多糖具有良好的抗腫瘤作用，可在制備緩解和治療癌癥藥物中應用。蜆殼花椒果皮多糖對人宮頸癌細胞Hela及人肝癌細胞SMMC-7721有明顯的抑制生長的作用。
具體實施例方式實施例I :蜆殼花椒果皮多糖的提取 (I)粉碎將干燥的蜆殼花椒果皮用粉碎機粉碎成40 60目的粉末；(2)脫脂將粉末置于提取器內，以石油醚脫脂兩次，每次lh，過濾，得到濾渣，再用95%乙醇脫脂兩次，每次2h，過濾，揮發除去濾渣中的有機溶劑；(3)提取按蒸餾水體積mL與濾渣重量g之比為10 20 1，向濾渣中加入蒸餾水，在100°C提取2 3h，重復此步驟三次，合并三次提取液；(4)除蛋白用酶解法除蛋白，離心，得上清液；(5)濃縮50°C 80°C減壓濃縮上清液，得到濃縮液； (6)醇析向濃縮液中加95 %乙醇至醇濃度為80 %，靜置過夜，離心得到沉淀，干燥沉淀得到蜆殼花椒果皮多糖。以葡萄糖為標準品，苯酚硫酸法檢測蜆殼花椒果皮多糖的含量為72. 9987% ο實施例2 :蜆殼花椒果皮多糖的提取(I)粉碎將干燥的蜆殼花椒果皮用粉碎機粉碎成40 60目的粉末；(2)脫脂將粉末置于提取器內，以石油醚脫脂兩次，每次lh，過濾，得到濾渣，再用95%乙醇脫脂兩次，每次2h，過濾，揮發除去濾渣中的有機溶劑；(3)提取按蒸餾水體積mL與濾渣重量g之比為10 20 1，向濾渣中加入蒸餾水，在100°C提取2 3h，重復此步驟三次，合并三次提取液；(4)除蛋白用Sevag法除蛋白，離心，得上清液；(5)濃縮50°C 80°C減壓濃縮上清液，得到濃縮液；(6)醇析向濃縮液中加95%乙醇至醇濃度為80%，靜置過夜，離心得到沉淀，干燥沉淀得到蜆殼花椒果皮多糖。以葡萄糖為標準品，苯酚硫酸法檢測蜆殼花椒果皮多糖的含量為76. 1895%。實施例3 :苯酚硫酸法測多糖含量(I)標準溶液的制備精密稱取105°C干燥至恒重的葡萄糖對照品O. lOOOg，加蒸餾水溶解，定容于250mL容量瓶中，配成O. 4mg/mL的葡萄糖標準溶液，精密吸取標準液I、2、3、4、5mL分別置于IOmL容量瓶中，以蒸餾水定容搖勻，得系列對照品溶液。(2)標準曲線的繪制精密吸取上述系列對照品溶液I. OmL，分別置于IOmL比色管中，將比色管置于冰水中，分別向比色管加入ImL苯酚試劑，再加入濃硫酸4mL，待各管加完后同時搖勻，置于沸水加熱lOmin，冷卻定容并在490nm測定吸光度，另精密吸取蒸餾水I. OmL，同法操作，作為空白對照，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線，計算得回歸方程。(3)樣品溶液多糖含量測定精密移取樣品溶液ImL于IOmL比色管中，按標準曲線繪制方法測定吸光度，并根據回歸方程計算多糖含量。實施例4 :蜆殼花椒果皮多糖對人宮頸癌細胞Hela生長的影響
(I)腫瘤細胞的培養含有體積分數為10%的小牛血清的RPMI 1640培養基于37°C、5% C02條件的二氧化碳培養箱中對Hela細胞進行培養至對數生長期。(2)實驗分組及處理Hela細胞的培養0. 25%胰酶消化對數生長期的細胞，用培養液稀釋調節細胞濃度至I X IoVmL細胞懸液，將細胞懸液接種于96孔細胞培養板上培養過夜。
(3)四甲基偶氮噻唑藍(MTT)法測定待細胞貼壁后加藥品進行培養，每孔加100 μ L細胞懸液，100 μ L樣品，樣品濃度設 lmg/mL、0. 5mg/mL、0. 25mg/mL、0. 125mg/mL、0. 0625mg/mL 等 5 個濃度梯度，同時設空白對照組和陽性對照組，空白對照組為有細胞無藥物的細胞懸液，陽性對照組加50 μ L絲裂霉素和100 μ L的細胞懸液。每組均設5個重復，將培養板置于37°C、5% CO2及飽和濕度的CO2培養箱中培養48h，然后每孔加濃度為5mg/mL的MTT溶液(溶于PH = 7. 4的PBS) 20 μ L，在同樣條件下繼續培養4h，然后吸去上清液加100 μ LDMSO溶解，搖床上搖lOmin，使充分溶解，用ELISA Reader于490nm處測定各孔光密度值(OD值)，并以下面公式計算樣品對細胞生長的抑制率。細胞生長抑制率=(陰性對照組孔OD值-樣品孔OD值)/陰性對照組孔OD均值 X 100%并根據量效關系和直線回歸法計算半數抑制濃度IC5(I。(4)MTT法測定蜆殼花椒果皮多糖對Hela細胞生長的影響結果見表I。表I蜆殼花椒果皮多糖對Hela細胞生長的影響
樣品名稱濃度(mg/mL)抑制率(％)T""~
IC5o(mg/mL)
Abs0.06258.07Λ
----0.4609
_0.125__10.44_
_025__26.27_
_05__51.44_
__178.48_結果顯示，不同濃度的蜆殼花椒多糖溶液對Hela細胞均有抑制作用，且抑制作用與濃度呈明顯的劑量依賴關系。實施例5 :蜆殼花椒果皮多糖對人肝癌細胞SMMC-7721生長的影響(I)腫瘤細胞的培養含有體積分數為10%的小牛血清的RPMI 1640培養基于37°C、5% C02條件的二氧化碳培養箱中對SMMC-7721細胞進行培養至對數生長期。(2)實驗分組及處理SMMC-7721細胞的培養0. 25%胰酶消化對數生長期的細胞，用培養液稀釋調節細胞濃度至I X IOVmL細胞懸液，將細胞懸液接種于96孔細胞培養板上培養過夜。(3)四甲基哦但噻唑藍(MTT)法測定待細胞貼壁后加藥品進行培養，每孔加100 μ L細胞懸液，100 μ L樣品，樣品濃度設 lmg/mL、0. 5mg/mL、0. 25mg/mL、0. 125mg/mL、0. 0625mg/mL、0. 03125mg/mL 等 6 個濃度梯度，同時設空白對照組和陽性對照組，空白對照組為有細胞無藥物的細胞懸液，陽性對照組加50 μ L絲裂霉素和100 μ L的細胞懸液。每組均設5個重復，將培養板置于37°C、5% CO2及飽和濕度的CO2培養箱中培養48h，然后每孔加濃度為5mg/mL的MTT溶液(溶于PH =7. 4的PBS) 20 μ L，在同樣條件下繼續培養4h，然后吸去上清液加100 μ LDMSO溶解，搖床上搖lOmin，使充分溶解，用ELISA Reader于490nm處測定各孔光密度值(OD值)，并以下面公式計算樣品對細胞生長的抑制率。細胞生長抑制率=(陰性對照組孔OD值-樣品孔OD值)/陰性對照組孔OD均值 X 100%并根據量效關系和直線回歸法計算半數抑制濃度IC5(I。4)MTT法測定蜆殼花椒果皮多糖對SMMC-7721細胞生長的影響結果見表I。表I蜆殼花椒果皮多糖對SMMC-7721細胞生長的影響
權利要求
1.蜆殼花椒果皮中提取多糖的制備方法，其步驟為 (1)將干燥的蜆殼花椒果皮用粉碎機粉碎成40 60目的粉末； (2)置于提取器內，以有機溶劑脫脂，重復此步驟兩次，過濾，得到脫脂后的濾渣； (3)按蒸餾水體積mL與濾渣重量g之比為10 20 1，向濾渣中加入蒸餾水，在100°C提取2 3h，重復此步驟三次，合并三次提取液； (4)用Sevag法，或者酶解法除蛋白，離心，得上清液； (5)50°C 80°C減壓濃縮上清液，使溶液體積mL為第(I)步的蜆殼花椒粉末重量g的4 6倍，得到濃縮液； (6)向濃縮液中加乙醇至醇濃度為80%，靜置過夜，離心得到沉淀，干燥沉淀得到蜆殼花椒果皮多糖。
2.根據權利要求I所述的蜆殼花椒果皮多糖的制備方法，其特征在于脫脂所用有機溶劑為石油醚，或者乙酸乙酯，或者丙酮，或者95%乙醇。
3.根據權利要求I所述的蜆殼花椒果皮多糖的制備方法，其特征在于除蛋白方法為Sevag法、酶解法兩者聯合運用。
4.蜆殼花椒果皮多糖在制備緩解和治療癌癥藥物中的用途。
全文摘要
蜆殼花椒果皮多糖的制備方法及用途，其方法的步驟為(1)將干燥的蜆殼花椒果皮用粉碎機粉碎成40～60目的粉末；(2)置于提取器內，以有機溶劑脫脂，重復此步驟兩次，過濾，得到脫脂后的濾渣；(3)按蒸餾水體積mL與濾渣重量g之比為10～20∶1，向濾渣中加入蒸餾水，在100℃提取2～3h，重復此步驟三次，合并三次提取液；(4)用Sevag法，或者酶解法除蛋白，離心，得上清液；(5)50℃～80℃減壓濃縮上清液，使溶液體積mL為第(1)步的蜆殼花椒粉末重量g的4～6倍，得到濃縮液；(6)向濃縮液中加乙醇至醇濃度為80％，靜置過夜，離心得到沉淀，干燥沉淀得到蜆殼花椒果皮多糖；其用途為在制備緩解和治療癌癥藥物中的用途。
文檔編號C08B37/00GK102626460SQ201110133348
公開日2012年8月8日 申請日期2011年5月19日 優先權日2011年5月19日
發明者于愛紅, 姚廣玉, 楊林, 邵文斌 申請人:蘭州理工大學