專利名稱：動物雙歧桿菌胞外多糖及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種雙歧桿菌，它產生的胞外多糖及其制備方法，尤其涉及一種動物雙歧桿菌，它產生的胞外多糖及其制備方法。
背景技術：
多糖是指由20個以上單糖組成的糖類化合物，是生物體重要的生物大分子之一， 因其多變的結構而成為一種最具魅力的信息載體，具有免疫調節、抗腫瘤、抗衰老、降血脂、 降血糖、抗炎、抗病毒等生理功能，并逐漸成為現代生物、醫藥、食品、化工行業的研究開發重點，具有很大的發展潛力。多糖的結構是其生物活性的基礎，多糖的活性直接或間接地受到結構的制約。何種結構的多糖才具有活性，結構的改變如何影響多糖活性，多糖的一級結構和高級結構與其生物活性間的構效關系是當前糖化學和糖生物學共同關注的焦點問題。多糖的結構分析在多糖研究中具有非常重要的地位，是糖化學的核心所在，也是研究多糖分子結構與功能關系的基礎。多糖類物質抗病作用機理的研究揭示，多糖生物活性不僅是建立在多糖分子的一級結構(單糖組成、單糖間糖苷鍵的連接方式、糖苷鍵類型、異頭物構型、取代基及取代位置、分支密度)基礎上，而且還與多糖分子的超級結構即空間構象有關。
發明內容
本發明的目的是提供一種動物雙歧桿菌，它產生的胞外多糖及其制備方法。本發明所提供的動物雙歧桿菌胞外多糖，其分子量為2. 13X IO4Da,單糖組成及摩爾比為 Rha Ara Gal Glc Man = 0. 4 0. 3 1. 6 0. 8 1.2，主鏈的連接方式及順序為—4)-a -D-Glcp-(1 —，一 3,4) - α -D-Manf-(1 —，一 4) - α -L-Rha-(1 —，一 3， 4)-α -D-Manf-(1—，一 4)-a -D-Galf-(1—，支鏈中兩個 α -D-Galp-(1 —分別連接于兩個 —3,4)-D-Manf-(1 —。生產上述動物雙歧桿菌胞外多糖的動物雙歧桿菌已于2011年02月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 4599。上述動物雙歧桿菌胞外多糖的制備方法，是將動物雙歧桿菌CGMCC No. 4599厭氧培養，酶解除蛋白，離心去除菌體獲得上清液，上清液經無水乙醇沉淀、Sevage法除蛋白、透析得到動物雙歧桿菌胞外多糖粗品，所述動物雙歧桿菌胞外多糖粗品溶液通過陰離子柱層析，陰離子柱層析洗脫液除鹽后再進行凝膠柱層析，凝膠柱層析洗脫液除鹽，得到動物雙歧桿菌胞外多糖。其中所述厭氧培養條件為適宜雙歧桿菌增殖產胞外多糖的培養條件，如在PTYG 培養基中37士 1°C厭氧培養M-72小時。上述酶解是在pH 7. 5時，加入胰蛋白酶，45°C處理90min，然后滅活酶。上述透析的截留分子量以8000_14000Da為宜。
上述陰離子柱可用50mM Tris-HCl洗脫。上述凝膠柱可用0. 05mol/L NaCl洗脫。本發明的動物雙歧桿菌CGMCC No. 4599是一種產胞外多糖的動物雙歧桿菌，該胞外多糖是一種新型乳酸菌胞外多糖。
圖1動物雙歧桿菌CGMCC No. 4599的形態特性。圖2動物雙歧桿菌EPS的DEAE-kpharose Fast Flow陰離子交換層析洗脫曲線。圖3 —步純化EP釙的kpharose CL-6B凝膠層析洗脫曲線。圖4 二步純化EPSb的高效液相色譜圖。圖5 二步純化EPSb的紫外掃描圖。圖 6HPAEC-PAD 色譜圖A為單糖標品(1. 0 μ g/mL) HPAEC-PAD色譜圖；B為二步純化EPSb的HPAEC-PAD色譜圖。圖7甲基化二步純化EPSb的GC-MS總離子流氣相色譜圖。
圖8 二步純化EP釙的1H NMR譜圖。圖9 二步純化EPSb的一級結構圖。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1、動物雙歧桿菌胞外多糖(EPSb)的純化1、動物雙歧桿菌EPSb的純化1)動物雙歧桿菌EPS的制備動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animal is) LPL-RH的形態特征如圖1 ；在PTYG固體培養基上的培養特征為乳白色不透明或半透明的菌落，凸起邊緣整齊，有光澤；生理生化特性為不產生過氧化氫酶、具有果糖-6-磷酸解酮酶、糖醇發酵試驗結果如表1。表1.動物雙歧桿菌CGMCC No. 4599的糖醇發酵試驗結果
權利要求
1.動物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis)，其保藏編號為 CGMCC No. 4599。
2.一種動物雙歧桿菌胞外多糖，其分子量為2. 13X IO4Da,單糖組成及摩爾比為 Rha Ara Gal Glc Man = 0.4 0. 3 1.6 0.8 1.2，主鏈的連接方式及順序為一4)-a -D-Glcp-(1 —，一 3,4) - α -D-Manf-(1 —，一 4) - α -L-Rha-(1 —，一 3， 4)-α -D-Manf-(1—，一 4)-a -D-Galf-(1—，支鏈中兩個 α -D-Galp-(1 —分別連接于兩個 —3,4)-D-Manf-(1 —。
3.動物雙歧桿菌胞外多糖的制備方法，是將動物雙歧桿菌CGMCCNo. 4599厭氧培養， 酶解除蛋白，離心去除菌體獲得上清液，上清液經無水乙醇沉淀、Sevage法除蛋白、透析得到動物雙歧桿菌胞外多糖粗品；所述動物雙歧桿菌胞外多糖粗品溶液通過陰離子柱層析， 陰離子柱層析洗脫液除鹽后再進行凝膠柱層析，凝膠柱層析洗脫液除鹽，得到動物雙歧桿菌胞外多糖。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述厭氧培養條件為在PTYG培養基中 37士 1°C厭氧培養M-72小時。
5.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述酶解是在pH7. 5時，加入胰蛋白酶45°C處理90min，然后滅活酶。
6.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述透析的截留分子量為 8000-14000Da。
7.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述陰離子柱用50mMTris-HCl洗脫。
8.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述凝膠柱用0.05mol/LNaCl洗脫。
全文摘要
本發明涉及動物雙歧桿菌胞外多糖及其制備方法。動物雙歧桿菌胞外多糖的分子量為2.13×104Da，單糖組成及摩爾比為Rha∶Ara∶Gal∶Glc∶Man＝0.4∶0.3∶1.6∶0.8∶1.2，主鏈的連接方式及順序為→4)-α-D-Glcp-(1→，→3，4)-α-D-Manf-(1→，→4)-α-L-Rha-(1→，→3，4)-α-D-Manf-(1→，→4)-α-D-Galf-(1→，支鏈中兩個α-D-Galp-(1→分別連接于兩個→3，4)-D-Manf-(1→。動物雙歧桿菌胞外多糖是一種新型乳酸菌胞外多糖。
文檔編號C08B37/00GK102154183SQ201110054259
公開日2011年8月17日 申請日期2011年3月7日 優先權日2011年3月7日
發明者劉麗莎, 旭日花, 李平蘭, 王洋 申請人:中國農業大學