糖胺聚糖類(gag)與生物活性分子的綴合物的合成方法、聚合綴合物及其相關用途的制作方法

專利名稱：糖胺聚糖類(gag)與生物活性分子的綴合物的合成方法、聚合綴合物及其相關用途的制作方法
糖胺聚糖類(GAG)與生物活性分子的綴合物的合成方法、聚合綴合物及其相關用途本發明涉及糖胺聚糖類(GAG)與具有不同特性的生物活性分子(包含小分子和大分子)的綴合物的合成方法。本發明特別涉及透明質酸(HA)及其衍生物與具有生物作用的多肽類和蛋白質例如干擾素、紅細胞生成素、生長因子、胰島素、細胞因子、抗體和激素的
三雙口 o聚合物在生物醫學領域的應用完全是一般和廣泛的。例如，使用聚合物基質的水凝膠常用于減輕腹部外科手術中的手術粘連、再建和整容手術、凝膠基質組成的控釋系統或作為生物材料。另一個重要的實例是用聚合物鏈衍生具有藥理學作用的分子，從而改善溶解度和掩蔽該分子的降解過程，從而延遲其作用。在本文上下文中最典型的實例是聚乙二醇(PEG)，盡管不存在于活生物體中，但是它是完全生物相容性的且無免疫原性。PEG常用于執行生物藥物(治療蛋白)性能。聚乙二醇化a-干擾素或聚乙二醇化-干擾素是值得舉出的，例如，它已經替代了簡單的蛋白質重組形式，從而變成了用于病毒性肝炎的選擇療法并且成為一個真正的巨型炸彈(歐洲專利EP0809996)。用PEG使蛋白質官能化的局限受限于得到具有無規律官能團的綴合物，或者，在任何情況下，得到多元分散體系形式。此外，得到的不同異構體的特征可能在于不同的生物活性、生物利用度、半衰期、免疫原性能力。由于這一原因，在九十年代，引入了聚乙二醇化方法，以便得到僅在特定位置修飾的蛋白質；其中N-末端是最易于接近的，結果是其pKa相對于存在于蛋白質中的其他氨基相當不同。在這方面，Pepinsky等人(Pepinsky RB, Le Page DJ, Gill A 等人 J Pharmac ExpTher, 2001297 (3) =1059-1066)已經特別研究了通過從PEG醛衍生物中得到的還原烷基化在@1干擾素(用于治療多發性硬化)N-末端引入PEG鏈。得到的加合物因半衰期增加而在體內顯示更好的效力。另一種歸因于這種方法的被PEG修飾的蛋白質是G-CSF、生長因子和Kinstler等人在N-末端官能化的中性粒細胞活化(US 6，153，655專利)。相應的產物(培非司亭)自從2002年以來已經在市場上銷售。在生物醫學領域中的聚合物組中，生物聚合物受到特別關注。其中的一些天然存在于人體組織中并且具有生物相容性和無免疫原性的特性，其代表了在這方面的重要的附加值。在這些生物聚合物中，糖胺聚糖類(GAG)特別受到關注，即具有高分子量、由二糖重復單元組成的無支鏈的多糖類。例如，GAGs具有在結締組織、腱和軟骨中的結構功能或它們作為抗凝血藥起作用。透明質酸(HA)是GAG，其可以在具有涉及細胞運動性過程的結構作用的胞外基質中發現，而且具有粘彈性的功能，還是水化和增殖劑。由于這些特別的特征，所以HA及其衍生物用作生物材料(EP 216453)和控釋系統(美國專利申請號US4582865和美國專利申請號 US 4636524 ;K. Motokawa 等人，Journal of Biomedical Materials Research Part A,(2006)，459頁)的基質。HA還涉及分子識別和調節機制，因為它被細胞受體例如RHAMM(⑶168)、⑶44、LYVEU Layilin識別。HA與D44的相互作用特異性特別重要。實際上，該受體在大部分上皮來源的實體癌中超表達；通過具有抗癌活性的藥物結合HA，可以利用生物聚合物的活性尋靶作用，使得抗癌藥胞吞和釋放入腫瘤細胞內部(國際專利申請W02009001209)。具有水溶性聚合物(例如GAG)的治療劑的衍生化特別用于多肽類、多肽激素和蛋白質的情況。這類分子實際上具有對甚至小的修飾極其敏感的結構，所述小的修飾因其中存在它們的環境導致。此外，多肽類和蛋白質通常具有其極短半衰期所限制的功效時間期限。這就是為什么其被水溶性聚合物官能化極其重要的原因，也改善了溶解度、生物利用度和減低了免疫原性。GAG與蛋白質通過二乙烯基砜(專利US 7，034, 127，特別稱作IFN)、二硫鍵(專利US 7417021)的綴合方法是本領域公知的。能夠控制衍生位置的唯一方法是通過形成二硫鍵的反應；在這種情況中，聚合物自身可以結合相應的還原形式的半胱氨酸殘基。如果多肽鏈僅帶有可利用和還原形式的單一半胱氨酸殘基，則衍生方法實際上是特異性的，而這是十分罕見的情況。實際上，蛋白質通常具有大量半胱氨酸殘基，而尤其是它通常發生這些殘基已經參與二硫鍵的情況，其還原涉及明顯的重排，這些重排可以導致蛋白質功能性缺失。已知技術中無一方法能夠得到明確的官能化模式、恰當維持蛋白質的生物活性、由此成為有效的單一分散和有效的產物。基于上述，利用生物活性分子例如蛋白質和多肽類與GAG(即HA)的綴合方法而不損害蛋白質功能性的必要性是顯而易見的。本發明的作者目前已經建立了具有能夠克服現有技術局限的生物活性分子(即蛋白質和多肽類)的糖胺聚糖類的綴合方法，因為它能夠使得GAG(例如HA)在不改變蛋白質基本結構和危害其功能性的情況下被結合。區別本發明GAG與治療劑(TA)綴合物與現有技術狀態下已知綴合物的另一個特征實際上在于本發明的綴合方法導致幾乎單一分散體系的加合物形成，而不會導致具有不同化學、物理、生物特征的產物的異構體混合物形成，其性能、治療效力和毒理學特性可變。此外，通過適當改變一些加工參數(即pH)，也能夠選擇糖胺聚糖所結合的生物活性分子的氨基；例如，能夠使水溶性聚合物HA特異性結合N-末端。在藥物例如蛋白質和多肽類的情況中，與氨基偶合通常通過酰化進行，導致形成酰胺類，其氮不再能夠參與酸-堿平衡。本發明綴合方法的特征在于它并非意味著存在于活性成分種類上的凈電荷的任何改變，導致伯胺轉化成維持交換質子的能力的仲胺。這是維持TA生物活性的明顯的優點。甚至更令人意外地，本發明作者已經發現本發明的生物綴合物能夠增加綴合的藥物的效力和隨時間維持它(參見實施例10的HA綴合物-胰島素)。治療劑與水溶性聚合物的綴合改善了其特性，使得它更可溶、生物可利用和更具有活性。不同于現有技術狀態中所述的水溶性聚合物(例如聚乙二醇，PEG)，糖胺聚糖類的應用使得得到的遞藥系統極佳，它們能夠以使用其他類型聚合物所不能達到的特異性使治療劑定向。這種特異性由包括GAG的受體相互作用復合系統決定。此外，盡管與細胞受體發生相互作用，但是不會強化免疫應答的生物聚合物的應用導致具有更高效力的協同作用。本發明描述了糖胺聚糖類(GAG)與生物活性分子的綴合物的合成方法，包含下列步驟a)通過GAG與間隔分子(SP)反應用至少一個醛基(CHO)衍生GAG，其中所述間隔分子包含一個或多個醛基(SP-CHO)作為第一種官能團，所述醛基(SP-CHO))任選被保護；和適合于綴合GAG的親核基團作為 第二種官能團；al)當所述一個或多個醛基被保護時，用酸水水解活化的中間體；b)使步驟a)或al)中得到的加合物與至少一種生物活性分子(TA)反應，所述生物活性分子的特征在于它包含能夠與醛基反應的官能團。被氨基或醛基(被保護或未保護的)官能化的透明質酸組成的水凝膠是現有技術狀態中已知的，然而，這些衍生物隨后與其他相同的多糖分子交聯，所述多糖分子可能被不同的官能團衍生，例如與起始官能化透明質酸的氨基或醛基反應(EP1757314 ；Bulpitt P等人 J of Biomedical Materials Research, 199947 (2) :152-169)。如上所述，糖胺聚糖類(GAGs)是具有高分子量、由二糖重復單元組成的無支鏈多糖類。GAGs的常見特征在于每個二糖單元中存在一個羧酸官能團，其在性質上可以顯示酸或皂化形式，由此生成聚陰離子。在本發明中，首字母簡略詞GAG —般表示多糖類的酸形式或皂化形式，而在這種情況中，大部分典型的抗衡離子是堿金屬和堿土金屬，例如鈉、鉀、鎂、鈣。分類為GAG的聚合物包含透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質素、肝素、硫酸類肝素。本發明中使用的GAG可以是天然形式或半合成衍生物形式，包括季銨鹽、羧酸酯類、0-酯類、酰胺類、過羧酸化衍生物、0-硫酸化衍生物、N-脫乙酰化衍生物、N-硫酸化衍生物或特征在于同時存在這些修飾的混合衍生物。首字母簡略詞GAG在下文中用于表示舉出的天然形式的聚合物或相應半合成衍生物。盡管在通常作為結構式表示的GAG類不攜帶任何醛基，但是值得注意的是在還原端的開放形式與封閉形式之間的溶液中建立的天然平衡經過了形成醛基。然而，這種存在在定量上非常有限，因為聚合物鏈的長度產生的還原端量低。另一方面，當GAG的分子量減小時，可利用的醛形式的還原端的相對量遞增，直到它變成定量地用于GAGs寡聚體；這是唯一的情況，其中還原端可以有效地用于進行本文件中所述的綴合過程。在所有其他情況中，認為醛基甚至在溫和條件下也相當不穩定，便利地以合成方式將其以被保護醛的形式引入水溶性聚合物。在這種方式中，能夠分離活化的中間體，然后使其與TA反應，不必使全部成分接觸單一反應混合物。本發明的綴合物與治療劑TA的關聯在于治療劑結合作為仲胺或叔胺的水溶性聚合物。作為能夠形成治療劑與GAG之間的鍵的方式和申請人制備和本文件中示例的方法，醛基(可能如a)步驟中所述被保護)的存在應被視為本發明的特征。由此在步驟a)中得到的加合物的穩定性足以使其能夠被分離，而一旦釋放了醛基，則可利用于與所關注的治療劑的衍生反應。得到的綴合物可以描述為下式GAG-SP-TA其中GAG表示糖胺聚糖，SP是間隔臂，TA是治療劑。
翻譯這種衍生方法的符號，得到如下步驟a. GAG+SP- (CHO) — GAG-SP- (CHO)步驟al. GAG-SP- (CHO) — GAG-SP-CHO步驟b. GAG-SP-CH0+TA — GAG-SP-TA其中CHO表示醛基官能團，如果在括號內，則被保護。
這種保護易于使用本領域技術人員已知的有機合成技術得到。例如，保護的便利形式在于使用半縮醛類或乙縮醛類，其通過醛類與如下成分的反應得到脂族或芳基脂族醇或二元醇類，包含，例如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、仲丁醇、叔丁醇、異丁醇、乙二醇、1，3-丙二醇、1，4_ 丁二醇和結構類似的分子，且能夠與醛類反應，形成可分離的縮醛類。步驟(a)的產物代表定義為“活化的中間體”或“活化的、但可分離的半合成中間體”。每次可以使用存在于聚合物或相應半合成衍生物上的官能團即羧基、羥基(每個重復單元4個)、有時以烷基或0-硫酸化酯類、N-乙酰基、N-硫酸化基團選擇用于用間隔臂使GAG官能化以得到活化的中間體的化學。此外，GAG與間隔臂之間的偶合條件必須例如不改變醛基或在存在時除去其保護。間隔臂必須包含適合于與GAG共價結合的官能團，優選親核基團，例如胺或醇基。游離形式或被適合的鹽鹽化的胺基因其更大的親核性而優選。間隔分子SP-(CHO)優選是氨基-醛，甚至更優選被保護為乙縮醛。可以用作GAG-SP-(CHO)型的間隔臂的分子的實例包含氨基-醛縮醛類，由此包含 游離或鹽形式的胺基 烴鏈，優選帶有1-20的多個碳原子的脂族基團 醛基，優選乙縮醛形式根據下列反應路線，其中n為1-20，而R和R’可以是脂族或芳基-脂族殘基，相同或不同，或攜帶不同羥基的同一鏈除反應路線化的線性外，脂族鏈可以是支鏈的或包含芳基。申請人:已經驗證便利的偶合方法在于形成酰胺類，其中GAG作為羧酸參與且間隔臂作為胺參與。這種類型的反應根據本領域技術人員公知的有機合成技術進行，且例如可以借助于促進對羧酸的親核攻擊的縮合試劑進行。這些試劑包括可以在均勻或不均勻相中的肽合成中使用的那些。這些試劑的實例是羰基二咪唑、碳酸二-琥珀酰亞胺酯、碳二亞胺類例如I-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC) ；N, N’ -二環己基碳二亞胺；N-烯丙基_N’-( 0 -輕乙基)碳二亞胺；N_( a - 二甲氨基丙基-N’-叔丁基碳二亞胺；N_( a - 二甲氨基丙基)_N’ ^ -溴烯丙基)碳二亞胺；1-(3_ 二甲氨基丙基)-3-(6-苯甲酰基氨基己基)碳二亞胺；環己基-(N-甲基嗎啉)乙基碳二亞胺對-甲苯磺酸酯(CMC)和類似產物。該反應可以在水性介質或在有機溶劑中、在-10-70°C溫度下進行，這取決于所用的活化類型。當在非水介質中進行制備時，便利地使用在這些條件下更可溶的GAG鹽，例如四-烷基銨鹽。這些抗衡離子在任何情況下都必須通過離子交換法被除去，該離子交換法在其分離前對衍生的聚合物進行。GAG的四烷基銨鹽(特別是HA鹽)通常可溶于無質子極性溶劑，例如N-甲基-批咯烷酮(NMP)、二甲亞砜(DMSO)、二甲基 甲酰胺(DMF)，其適合于作為反應介質。這些溶劑的應用便利地與作為縮合試劑的羰基二咪唑的應用結合，其作用得益于因少量強酸的適度酸性環境，例如在溶液或甲磺酸中發泡的氣態鹽酸。適合于進行這類活化中間體合成的其他有機溶劑是包含碳酸丙烯酯、碳酸二乙酯的有機碳酸酯類，且一般是被脂族、芳族或芳基-脂族鏈取代的有機碳酸酯類。通過添加飽和堿性鹵化物溶液例如NaCl、NaBr, KC1、KBr中斷反應。該反應混合物的水化使得形成酰胺鍵的促進劑失活，而以相對于GAG重復單元的摩爾數遠過量這樣的量加入的鹽導致有效的離子交換。通過添加0. 5% -30%體積且優選5-15%體積用量的飽和堿性鹵化物溶液得到遠過量的化學計算需求。然后通過透析純化相應活化的中間體的堿式鹽，然后冷凍干燥。盡管該產物是可分離和穩定的，但是它相對于隨后與包含對醛類的反應敏感的官能團的治療劑的官能化反應而言是活性的。活化的中間體的可替代純化/分離方法在于將具有足夠極性的溶劑混合物應用于沉淀-洗滌循環。例如，可以使用醇類例如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇和高級同系物、可能是與水的混合物進行沉淀-洗滌；其他適合的溶劑是丙酮、乙酸乙酯、四氫呋喃、二噁烷、乙腈、無質子極性溶劑(例如二甲基甲酰胺、二甲亞砜、正甲基吡咯烷酮、正甲基乙酰胺)、有機碳酸酯類。上述舉出的溶劑各自可以單獨使用或以與任意其他溶劑或水的混合物使用，以便得到具有更大準確性的極性和其他物化特性。優選包含上述醇類、丙酮和水的混合物。描述GAG-SP- (CHO)與TA之間偶合的步驟(b)通過釋放醛基(當被保護時)的第一步al)進行，在于通過用酸水根據本領域技術人員公知的標準技術處理進行的水解乙縮醛。所述用酸水對活化的中間體以釋放醛基的水解步驟al)優選在pH I. 5-3. O、優選pH 2. 0-2. 5、在25-65°C、優選40-60°C的溫度下進行至少30分鐘。游離醛目前對通過存在于TA分子上的胺基活化的治療劑部分上的親核攻擊敏感，導致形成亞胺，其通過典型地用于還原氨基化的無機氫化物還原成胺，例如氫化氰硼、氫化鋁鋰、硼氫化鈉等。本發明范圍內具有藥物作用的活性成分包含，例如具有藥理學作用的“小分子”和/或多肽類、激素、蛋白質、糖蛋白、酶、細胞因子、生長因子或細胞分化因子、抗體、治療聚合物、核酸或其組合。根據本發明的優選實施方案，可以使用本發明中所述技術與HA綴合的“活性成分種類”包含多肽類和/或蛋白質，特別是
-免疫調節劑，特別是屬于干擾素家族的蛋白質，例如I型干擾素即除包含IFN3和IFNco的IFNa外自身還結合相同的IFNa受體的那些；II型和III型干擾素，即自身分別結合IFNy和IFNX受體的干擾素。-生長因子，特別是:I.促血紅細胞生長素和一般鑒定為ESA (紅細胞生成-刺激因子)的分子，其包含重組人腎紅細胞生成素a和重組人腎紅細胞生成素3、重組人腎紅細胞生成素W、重組人腎紅細胞生成素S、促紅血球生成素、CERA和從其中生成或衍生的物質，例如通過刺激紅細胞生成產生的融合蛋白；2.刺激造血作用的因子，例如GM-CSF G-CSF因子，其還可以用于腫瘤學領域；3.用于骨和軟骨的生長因子，包含屬于骨形態發生蛋白(BMP)家族的蛋白質例如BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7 (在文獻中也表示為 0P1)、BMP8a、BMP8b、BMP10、BMP15、也稱作⑶F2(生長分化因子2)的BMP9、屬于TGF-P超家族的蛋白質、VEGF、TOGF、屬于FGF家族的蛋白質；-細胞因子及其受體拮抗劑，例如IL2、具有其可溶性受體或相關單克隆抗體的TNF ；ILl-ra(ILl-受體拮抗劑，用于治療關節炎和類風濕性關節炎)和一般促炎細胞因子的可溶性受體；-糖蛋白，特別是潤滑素(Iubricin)；:特別是超氧化劑物歧化酶(SOD);核糖核酸酶和葡糖腦苷脂酶；:特別是單克隆抗體或其綴合物或融合蛋白；發揮抗腫瘤作用的單克隆抗體；發揮抗炎作用的單克隆抗體；-激素蛋白質激素或至少部分包含多肽鏈，特別是降鈣素、胰島素及其類似物和生長激素(GH或hGH)。包含并非生物功能基礎的胺基的治療劑-抗腫瘤藥，特別是I.紫杉烷類、長春花生物堿類；喜樹堿；2.取代的脲類；3.鉬、金、銀和其他用于腫瘤或骨關節炎和/或類風濕性關節炎療法的金屬或制菌劑/抗菌劑；4.甲氨蝶呤、三甲曲沙、培美曲塞、四氫葉酸酯；5.嘧啶類似物；胞苷、嘌呤；6.腫瘤抗生素和類似物；蒽二酮類；-抗病毒藥和抗牛素；-蛋白酶和聚合酶抑制劑；-具有中樞或外周作用的抗炎、止痛、麻醉、止痛藥；-麻醉品阿片劑或非-阿片劑；-類固醇；-米諾地爾(通常用于皮膚病)。核酸，特別是I.小干擾RNA (或短干擾RNA，常稱作siRNA，它是20_25個核苷酸長度的RNA分子。更具體地說，siRNA涉及抑制單一基因表達，其在治療黃斑變性中的應用目前處于實驗階段)。2.微小RNA(microRNAs、miRNAs是調節特異性靶基因表達的小的未編碼RNA分子。它們由此可以作為對特異性有害造血形式的腫瘤抑制物起作用)。3.反義 RNA上述舉出的物質在下文中稱作“治療劑”(縮寫為TA)或“活性成分種類”。TA的分子結構必須攜帶能夠與醛類反應的官能團，例如胺基。如果該基團不存在于TA上，則可以通過本領域技術人員公知的合成有機化學引入它。按照這種方式，實際上能夠使任意的分子結合GAG。在本發明范圍內，透明質酸(HA)及其上述鹽的應用特別得到關注。用于本發明
的HA可以衍生自任意的來源；例如，可以通過發酵或生物技術提取雞冠花產生并且具有400-3xl06Da 的分子量，優選 lxl03Da_lxl06Da，甚至更優選 10，000-750，OOODa0本發明的衍生反應可以照此應用于多糖類和相同的上述修飾。由此從可變修飾的透明質酸、根據公知方法且特別是如下的成分得到分子網狀結構-用有機和/或無機堿成鹽的HA(EP 138572B1)；_ hyAFT :ha與脂族、芳基-脂族、脂環族、芳香、環狀和雜環系列的醇類的酯類，其中酯化百分比可以根據所用醇的類型和長度的不同而改變，優選20-80%，而可以使用有機和/或無機堿使其余百分比的未酯化的HA成鹽(EP 216453)；_ HYADD : HA與脂族、芳基-脂族、脂環族、芳香、環狀和雜環系列的醇類的酰胺類，其中酰胺化百分比為0. 1_50%，而可以使用有機和/或無機堿使其余百分比的未進行酰化的HA成鹽(EP 1095064)；-至多第4硫酸化度的HA的0-硫酸化衍生物(EP702699)；_ ACP :酯化百分比不高于20%、優選0. 05-10%酯化的HA內酯，而可以使用有機和/或無機堿使其余百分比的未酯化的HA成鹽(EP 341745)；-HA的脫乙酰化物它們衍生自存在于上HA的N-乙酰葡糖胺殘基的脫乙酰化，其中脫乙酰化百分比優選0. 1_30%，而可以使用有機和/或無機堿使全部HA的羧基成鹽(EP1313772)；-HY0XX :獲自具有0. 1-100 %且優選25_75%過羧化度的N-乙酰葡糖胺部分的伯羥基氧化的HA的過羧酸衍生物。可以使用有機和/或無機堿使全部HA的羧基成鹽(EP1339753)。根據本發明的優選實施方案，HA與治療劑之間的綴合過程包含下列步驟a) HA與被保護氨基-醛類SP-(CHO)的衍生反應，其中HA參與與羧基的反應，與氨基-醛的胺形成酰胺。該過程優選從HATBA(HA的四丁銨鹽)或另一種可溶于有機無質子極性溶劑(01^0、匪 、01^、有機碳酸酯類)的鹽開始進行。活化的但可分離的中間體獲自該過程。a I)水解活化的中間體即HA-SP- (CHO) — HA-SP-CHO以釋放醛基與磷酸在I. 5-3、優選pH 2. 0-2. 5范圍內、在25-65°C、優選40°C _60°C溫度下的反應進行至少30分鐘；b)活化的中間體與TA分子優選蛋白質的綴合反應。通過在使用硼氫化鈉的還原條件下添加蛋白質，形成亞胺，由此形成胺。如果所選擇的治療劑是多官能化化合物，則可能生成具有不同化學、物理和生物特性的不同位置異構體。這種條件典型地在蛋白質的情況中得以驗證，其中具有12個潛在結合位置的干擾素代表了一個實例。通過改變該反應進行時的PH值，優選在N-末端生成特異性官能化(pH = 6. 0)，其中這就是意味的全部的優點，或使用不可再現的方案，使用在不同點結合蛋白質的HA官能化(pH > 7. 5)。用于制備本發明綴合物的化學能夠有效地選擇官能化模式。達到這一重要的結果歸因于醛基的應用，其相對于親核攻擊的特別反應性相對于進入的基團的親核能力具有足夠的選擇性。根據情況與情況的不同通過漸進的優化確定用于便利地發揮這種選擇性的特定條件。返回至最重 要的多功能活性成分種類的實例即蛋白質，可以在具有不同易接受性的位置上可以發現親核胺基，但尤其是可以區別于其作為堿的強度，表示為pKa。存在于賴氨酸殘基上的e位置上的胺基典型地顯示pKa 9.3-9. 5，而在羧基上a的胺基具有典型地在7. 6-8的pKa。為了有利于e上的胺的反應，偶合過程必須在高于8. 0的pH下進行，優選8. 5-9. 0 ;另一方面，為了有利于N-末端上的胺類的反應性，pH必須在5. 0-6. 5,優選5. 5-6. 2。第二種情況是最重要的情況，因為蛋白質典型地僅在N-末端具有I個游離a-胺基。建立反應條件以便普遍與該胺基反應導致形成幾乎單分散體系的GAG與蛋白質之間的綴合物。盡管所示的pH值代表本發明所關注的蛋白質，但是它們是指示性的，因為它們可以因不同分子而適度改變。該合成方法能夠得到生物活性綴合物，其具有相對于本領域狀態已知的綴合物基本上更高的性能。通過研究這些新綴合物的生物特性，申請人實際上已經發現相對于本領域狀態已知的聚合物綴合物基本上更高的特性。特別地，使用透明質酸衍生后得到的本發明綴合物維持活性成分和起始多糖的生物活性，而其特征在于不同的機械和流變特性。在進行偶合過程下的條件是例如在不改變TA的生物功能性下進行。申請人:實際上將本發明的合成方法應用于合成新的生物綴合物 透明質酸(HA)與干擾素(IFNa ) 透明質酸與生長激素(hGH) 透明質酸(HA)和核糖核酸酶A 透明質酸與胰島素 透明質酸與鮭降鈣素(HA-sCT) 透明質酸與ILl-ra 透明質酸與潤滑素，由此其用于本發明的目的。HA-IFN a綴合物的制備描述在實施例3中。重組人IFNa 2a是具有約20kDa分子量的蛋白質，其結構的特征在于形成2個二硫鍵和12個胺基(其中賴氨酸殘基的側鏈上11個)的4個半胱氨酸+N-末端。應注意存在于天然蛋白質上的在殘基29與138之間包括的兩個二硫鍵是生物活性的基礎，因此對應用US專利7，417，021的方法必不可少的還原條件是有害的。所用的合成條件是，例如為了得到幾乎單分散的體系的綴合物，使HA廣泛結合細胞因子的N-末端。這種特異性反映在維持和/或增加IFN和/或其他生物綴合物的生物活性上，已經研發了實施例4的方法用于其測定。對相同的HA-IFN綴合物進行熒光體層攝影術實驗，以觀察靜脈內施用后的體內生物分布。為了能夠使用這項技術使其得到揭示，根據實施例6制備生物綴合物，以便包括共價結合的熒光探針。所發現的生物分布(實施例7)顯示在相當快的時間范圍內，熒光普遍以肝水平蓄積且在胸部區域中達到較低程度，這是因在肺微循環中的非特異性俘獲所致。在更長的時間中，還觀察到了在骨盆、特別是膀胱區域中的蓄積，證實在生物綴合物的正常吸收-排泄機制中并非如此巨大，而是緩慢水解和釋放熒光探針。這種主要的肝和肺蓄積證據揭示出了另一個有意義的特性，它并非由本領域狀態中已知的綴合物所呈現，即，使治療種類特異性定向于確定類型的組織的可能性。本發明的另一個目的由此涉及本發明的綴合物在醫學領域特別是抗病毒和抗腫瘤療法中的用途。本發明優選的實施方案，本發明的目的涉及HA-IFN綴合物作為用于刺激相對于病毒類型感染的免疫系統的系統的用途，所述的病毒類型感染例如肝炎(優選通過
靜脈內施用)或病毒病原體導致的病理學情況，例如唇皰疹、生殖皰疹和能夠導致疣(優選通過局部施用)或宮頸癌HPV (人乳頭瘤病毒)導致的感染。HA-IFN綴合物由此可以有利地用作抗腫瘤劑。正如實施例10中所示，HA-胰島素綴合物不僅使治療劑的藥理學功效倍增，而且維持胰島素控制隨時間改變的基礎血糖水平的能力。在這種情況中，揭示出所述生物綴合物的另一個特性，即在于生成治療劑的控釋系統。在示例生物綴合物HA-核糖核酸酶A的制備的實施例9中，維持結合酶的生物活性甚至更為顯著，因為在使用分光光度技術濃縮底物后直接測定酶活性。申請人:還驗證了一旦與HA綴合和通過靜脈內施用，則治療劑顯示快速和定量的肝和肺蓄積。本發明的這一目的使得其應用特別有利于病理學情況相關的療法，所述的病理學情況關注肝，例如與病毒相關的肝病、肝纖維化、肝硬化、戈謝病、肝和肺腫瘤。綴合物的肝和肺俘獲的動力學和有效性依賴于HA，通過改變其分子量，可以改變蓄積特性，直到它變成可忽略不計。另一方面，靜脈內施用并非唯一的可能途徑。申請人實際上驗證了皮下施用綴合物有效地減緩TA釋放(實施例10)。實施例11示例了生物綴合物HA-降鈣素的制備方法降鈣素是32-氨基酸的線性多肽激素，其主要由甲狀腺的濾泡旁細胞在人體內產生，這種激素參與鈣(Ca2+)和磷代謝。由于其特異性，所以降鈣素以4種方式影響血Ca2+水平 通過腸抑制Ca2+吸收 抑制骨中的破骨細胞活性 抑制腎小管的磷酸鹽重吸收 增加腎小管的絕對Ca2+和Mg2+重吸收，降鈣素是腎Ca-保存激素。因此，降鈣素用于治療 絕經后骨質疏松 低鈣血癥 佩吉特病
骨轉移灶降鈣素分別具有10-15分鐘和50-80分鐘的短吸收和消除半衰期。鮭降鈣素主要和幾乎唯一地在腎中降解，形成無藥物活性的分子片段。新生物綴合物HA-降鈣素由此極其重要，這是因如實施例11中所述的事實所致，它揭示出相對于游離激素的更長低鈣化作用，能夠產生使我們研究新臨床應用的更為顯著的效果，例如為保護變性病理學情況例如類風濕性關節炎和關節病中的軟骨和骨的關節內施用。實施例13示例了生物綴合物HA-潤滑素的合成方法潤滑素存在于滑液中和關節軟骨表面上，且由此在關節潤滑和滑液動態平衡中起重要作用。已經證實人滑液成纖維細胞產生潤滑素。滑膜關節的最佳功能性取決于關節連接組織之間極低的摩擦系數。通常緊密的充
分潤滑的表面維持在關節軟骨上。然而，在骨關節炎(OA)中，減少的潤滑促使軟骨基質降解和纖維性顫動；它們由此促使關節功能障礙和疼痛。減少的潤滑還導致其他形式關節炎包括類風濕性關節炎(RA)中的關節功能障礙和疼痛。還檢測了潤滑素的表達和在腱、關節盤、肺、肝、心臟、骨、韌帶、肌肉和皮膚中定位的蛋白質。就這些組織而言，潤滑的表面也貢獻了最佳的功能性。除需要潤滑的表面外，正常的腱功能還需要防止細胞與腱表面粘連。因此，申請人描述了新生物綴合物HA-潤滑素作為例如滑膜關節、關節盤、腱、腹膜、心包和側甲的潤滑劑、抗粘連劑和/或關節內補充劑的新生物綴合物的應用，使得原位停留時間長于對未綴合TA所描述的且有效性高于它。在本文的上下文中，本發明的綴合物可以有利地用作TA的控制釋放。這些系統特別用于具有由有限壽命限制的治療有效窗的TA。具有這些特性的TA的典型實例是包含細胞因子的治療蛋白質、生長因子、酶、激素例如GH、葡糖腦苷脂酶、SOD、ILl-ra、胰島素和類似物、GM-CSF, GCSF, EPO且一般是上述ESA，I、II、III型干擾素、單克隆抗體、融合蛋白等等。例如，胰島素是第一種生物技術藥物且持續具有主要的重要性，因為它是患有糖尿病的人的增長數量的基礎。長效胰島素目前可得到，但遞藥系統市場上未出現(與聚合物、微納米粒綴合)。如實施例10中所示，本發明的綴合方法適合于生成控釋系統，其有效地減緩活性形式的TA釋放和延長其作用、使其治療有效性倍增。此外，需要考慮到的是與患者依從性相關的另一個方面，即在本治療方案中必須進行不同的每日皮下施用在其社會生活中顯然的不便性和適合于注射的部位的逐漸耗盡性。類似的考慮也在本文件中列舉的其他治療物質中得到確認。本發明透明質酸(優選其衍生物)與治療劑之間的綴合物由此可以有利地用于制備具有高度有效性、生物依從性、生物利用度、使TA針對特定類型細胞或器官組織可能性和通過控釋和增加TA壽命改善藥代動力學特性可能性的生物材料。本發明透明質酸與治療劑之間的綴合物可以有利地用于制備適合于胃腸外或非胃腸外施用的藥物組合物，包含口服應用制劑、通過真皮內、靜脈內、肌內、皮下、動脈內、鞘內、心內、滑膜內、腹膜內、膀胱注射的可注射溶液或凝膠、霜劑、軟膏劑、泡沫、干粉、噴霧齊U、用于局部應用的皮膚或透皮硬膏劑，還有用于直腸、陰道內、舌下、眼內應用的藥物制劑。根據本發明的優選實施方案，藥物組合物適合于對肝和/或肺定位的靜脈內給藥。根據另一個優選的實施方案，藥物組合物適合于通過控釋系統皮下施用。本發明的綴合物維持其中包含的活性成分的生物功能，而相對于這些分離形式，它們可以用作其媒介化工具(vehiculation)和控釋系統。通過適當選擇GAG或半合成衍生物的類型得到定向于特定組織或類型細胞的媒介化工具，而通過GAG或半合成衍生物與活性成分種類之間的鍵的性質調節釋放動力學。最終，本發明涉及特征在于包含如上述所 定義的綴合物的基質的生物材料。現在根據優選實施方案、特別參照公開的附圖為示例而非限制性目的描述本發明，其中圖I顯示為示例透明質酸(HA)目的的代表的醛化GAG的合成路線，而攜帶所代表的被保護的醛基的間隔臂原型是4-氨基-丁醛-二乙縮醛。圖2顯示醛化透明質酸的H-NMR光譜。這是在重水中存在的質子NMR光譜。存在于HA中的乙酰基的甲基質子信號(1.88ppm)位于另一個信號側翼，歸因于乙縮醛的甲基質子(I. 05ppm)。圖3顯示在小鼠中靜脈內施用用熒光探針標記的HA-IFN綴合物后的熒光體層攝影圖像。圖4顯示用HA-IFN對人卵巢癌初級細胞系(pdOVCAl)進行的細胞毒性試驗(ATPlite)結果，所述人卵巢癌初級細胞系對IFN的抗增殖作用敏感。圖5顯示分別顯示游離和綴合的IFN的HA-IFN綴合物的色譜圖。圖6顯示分別顯示游離和綴合的hGH的HA-hGH綴合物的色譜圖。圖7顯示分別顯示游離和綴合的RNAsi酶的HA-核糖核酸酶綴合物的色譜圖。圖8顯示分別顯示游離和綴合的胰島素的HA-胰島素綴合物的色譜圖。圖9顯示通過測定相對于對照組和未治療動物所治療的動物血糖水平皮下給予5 ii g或20 ii g劑量胰島素的HA-胰島素綴合物的體內生物活性。

圖10顯示生物綴合物HA-IFN與IFN與未處理產品相比的體內功效。圖 11 顯示使用 GF-250 柱(Agilent, 4,6x 25cm)、以 0. 3mL/min 的速率的 HA-sCT尺寸排阻分析。洗脫液緩沖液Na2HPO4O. 1M、NaCl 0. 2M、pH 7. 2，其包含20%乙腈。通過測定在280nm的吸光度監測來自柱的流出液。在9. 2min洗脫的降鈣素被完全除去。注射運行的緩沖液以證實在Umin的峰相當于所用柱的分離體積結束。圖12表示靜脈內施用sCT、HA-sCT、HA和鹽水溶液后血鈣水平分布。數據代表三只大鼠的平均值且使用標準偏差的相對平均值表示。圖13 顯示使用 GF-250 柱(Agilent，4，6x 25cm)、以 0. 3mL/min 的速率的HA-ILl-ra尺寸排阻分析。洗脫液緩沖液Na2HPO4O. lM、NaCl 0. 2M、pH 7. 2，其包含20%乙腈。通過測定在280nm的吸光度監測來自柱的流出液。在9. 75min洗脫的IL_l_ra被完全除去。現在為提供更好理解和示例可能的實施方案的目的在下列實施例中更詳細地描述本發明，但不限制其可能的應用，在任何情況下，這些實施方案都可以在不危害其基本精神的情況下由本領域技術人員改變。實施例圖I中的合成路線示例上述GAG-TA綴合物的合成方法的連續反應，描述了所涉及的種類的分子結構。透明質酸(HA)是用于作為示例目的的GAG的代表，而攜帶所代表的被保護醛基的間隔臂原型是4-氨基-丁醛-二乙縮醛。實施例I :具有200kDa平均分子量的HA醛衍生物的合成將5. OOg透明質酸鈉鹽發酵來源的hyalastine部分(MW 200kDa)溶于250ml水，通過預裝填四丁銨形式的IOOcm3Dowex樹脂的玻璃柱滲濾得到的溶液。收集洗脫的TBA的HA鹽溶液，冷凍干燥。得到7. 50g產物，將其溶于400ml的N-甲基-吡咯烷酮(NMP)。在完全溶解HA鹽后，加入300mg羰基-二咪唑(CDI)、450yl甲磺酸和387mg的4-氨基丁醛二乙縮醛，將該混合物在40°C、在適度攪拌下反應過夜。通過添加0. I體積的
飽和NaCl水溶液終止反應，30分鐘后，將該溶液加入到3體積的無水乙醇中，以根據圖I從反應混合物中分離HA衍生物。再用乙醇洗滌沉淀，最終在40°C高度真空干燥。得到4. 49g衍生物，其包含相對于HA的重復單元13%以摩爾計的被保護的醛基。該產物的NMR光譜如圖2中所示，其合成如本文所述進行。實施例2 :具有IOOkDa平均分子量的HA醛衍生物的合成將具有IOOkDa平均分子量的提取來源的4. OOg透明質酸鈉鹽溶于500ml注射制備用水。使得到的溶液達到4°C溫度，然后加入290mg(15%以摩爾計)EDC、175mg的NHS和245mg的4-氨基丁醛二乙縮醛。反應18小時后，通過添加4體積的無水乙醇沉淀產物，用具有增加乙醇含量直到達到無水乙醇的水醇混合物洗滌。證實產物以11. 9%摩爾/摩爾被取代。實施例3 :HA-干擾素綴合物的合成在60°C溫度將實施例I的3. OOg HA的醛衍生物(活化的中間體)以10mg/ml濃度溶于磷酸存在的酸性環境2小時。將4xl0_5摩爾重組人干擾素a 2a、4xl0_4摩爾氫化氰硼加入到預先冷卻的水解產物中，將pH調節至6. O。在24h反應后，通過對水透析純化加合物，然后冷凍干燥。通過尺寸排阻色譜法驗證純度(GPC)，相應色譜體圖如圖5中所示。使用人抗-IFNa抗體使生物綴合物HA-IFN進行SDS-PAGE+蛋白質印跡。通過密度計技術揭示出存在低于5%的游離蛋白質。結果與從尺寸排阻色譜法顯示的相關(圖5)。實施例4 =HA-IFN綴合物生物活性的體外測定通過特別準備的方法測定HA-IFN綴合物的生物活性。對IFN抗增殖作用敏感的人卵巢癌初級細胞系(pdOVCAl)進行本實驗。將細胞以10, OOO個細胞/孔的濃度接種，單獨和在如下的存在下溫育-如實施例3中制備成作為等效IFN單位的1，000、500、250U/ml濃度的HA-IFN生物綴合物；-I, 000、500、250U/ml 濃度的重組人干擾素 a 2a ；-具有200kDa分子量的HA，即同樣用于制備綴合物，濃度為323.5、162. 75、81. 375 u g/ml。5天溫育后，通過ATPlite細胞毒性試驗測定細胞存活率。將得到的結果概括在圖4中，而將細胞存活率表示為相對于單獨溫育細胞得到的水平百分比。正如可以觀察到的，重組人干擾素a 2a相對于該細胞系發揮顯著的細胞毒性作用。這種特性幾乎可以在所述綴合物中定量維持，而未綴合的HA不能發揮這種作用。實施例5 :綴合物HA-IFN的生物活性的體內測定使用腹膜內接種3xl06細胞/小鼠的卵巢癌細胞系(pdOVCAl)(對IFN的抗增殖作用敏感)在屬于SCID F組的小鼠中進行實驗。使用3個不同的動物組、每組6只小鼠進行本實驗第I組在第7天、第14天和第21天使用作為陽性對照的重組人干擾素a 2a (IFN)以I, 000U/ml的濃度治療；第2組在第7天、第14天和第21天使用作為等效IFN單位的實施例3中所述制備的本發明生物綴合物(HA-IFN)以l，000U/ml的濃度治療；第3組代表非藥物治療的對照組，但僅接種pdOVCAls。將結果概括在圖10中上述實驗清楚地顯示生物綴合物HA-IFN與參比藥物IFN相比更大的體內功效。作為結果的另一個證實，統計學評價顯示生物綴合物與未處理的對照品相比顯著性意義，而獲自陽性對照與未處理產品相比得到的結果未揭示出統計學顯著性。實施例6 :熒光探針標記的HA-干擾素綴合物的合成在無菌條件下謹慎取樣以進行每次傳代，用0.5mg Cy5、根據從提供者(GEHealthcare)接受的說明標記12. 5mg重組人干擾素a 2a。使用標記的蛋白質進行偶合反應，通過對水徹底透析、根據實施例3中提供的說明純化。得到90. 4mg產物。實施例7 :熒光探針標記的HA-干擾素綴合物的熒光體層攝影術的體內生物分布通過臨床前光學顯像系統Explore Optix (GE Healthcare)體內測定靜脈內施用后綴合物的生物分布。該系統由用于測定生物發光的設備組成，這種生物發光適合于體層攝影重建小嚙齒動物的整體影像。所用技術是“時間相關單光子計數”，以便測定熒光探針的吸收和熒光(隨其壽命)，從而能夠對其進行三維定位。圖3中所示的影像代表實施例6的標記綴合物在麻醉小鼠中的接種實驗結果。接種前未發現信號。接種后即刻觀察到肝蓄積，這與相鄰肺區域內的熒光強度下降相關，主要因肺微循環中的非特異性俘獲導致。骨盆區中蓄積與這些信號相關，在較長時間期限內導致膀胱蓄積。實施例8 HA-hGH綴合物的合成在60°C溫度將實施例I的I. 00g HA的醛衍生物以10mg/ml濃度溶于磷酸存在的酸性環境2小時。將2xl0_5摩爾重組人生長激素、2xl0_4摩爾氫化氰硼加入到預先冷卻的水解產物中，將PH調節至6. O。24h反應后，通過對水透析純化加合物，然后冷凍干燥。實施例9 HA-RNAsi A綴合物的合成在50°C溫度將實施例I的I. 00g HA的醛衍生物以8mg/ml濃度溶于磷酸存在的酸性環境2小時。將pH調節至6. 0，將2xl0_5摩爾核糖核酸酶A和2xl0_4摩爾氫化氰硼加入到預先冷卻的水解產物中。在該pH下反應特別在蛋白質N-末端進行。24h反應后，通過對水透析純化加合物，然后冷凍干燥。可以在圖7中找到實施例14中所述的條件下記錄的相應GPC色譜圖。這種類型的綴合物最佳地適合于使用基于評價287nm隨時間吸收增加的特異性試劑盒測定體外酶的殘留活性，所述的基于評價287nm隨時間吸收增加通過水解特異性合成底物環2’，3’ -胞苷一磷酸(2’，3’ -CMC)確定。游離或與HA結合的形式的酶的殘留活性的比較產生了如下結果
權利要求
1.糖胺聚糖類(GAG)與生物活性分子的綴合物的合成方法，包含下列步驟 a)通過GAG與間隔分子(SP)反應用至少ー個醛基(CHO)衍生GAG，其中所述間隔分子包含一個或多個醛基(SP-CHO)作為第一種官能團，所述醛基(SP-CHO))任選被保護；和適合于綴合GAG的親核基團作為第二種官能團； al)當所述ー個或多個醛基被保護時，用酸水水解活化的中間體； b)使步驟a)或al)中得到的加合物與至少ー種生物活性分子(TA)反應，所述生物活性分子的特征在于它包含能夠與醛基反應的官能團，所述生物活性分子選自包含多肽類和蛋白質、核酸和含有至少ー個并非生物功能基礎的胺基的治療劑。
2.根據權利要求I的方法，其中所述保護醛基使用半縮醛類或縮醛類通過醛類與脂族或芳基脂族醇或ニ元醇類反應進行，所述脂族或芳基脂族醇或ニ元醇類選自甲醇、こ醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、仲丁醇、叔丁醇、異丁醇、こニ醇、1，3-丙ニ醇、1，4_ 丁ニ醇，以形成可分離的縮醛類。
3.根據權利要求I和2的任ー項的方法，其中所述間隔分子SP-(CHO)是氨基醛，優選被保護的こ縮醛。
4.根據權利要求1-3的任ー項的方法，其中所述用酸水水解活化中間體以釋放醛基的步驟al)在I. 5-3. 0的pH、優選pH 2. 0-2. 5、在25_65°C溫度、優選40_60°C下進行至少30分鐘。
5.根據權利要求1-4的任ー項的方法，其中所述步驟a)的親核基團是游離或鹽化形式的胺基或醇基。
6.根據權利要求1-5的任ー項的方法，其中所述能夠與醛類反應的生物活性分子的官能團是可以天然存在或通過合成引入的胺基。
7.根據權利要求1-6的任ー項的方法，其中所述GAG選自透明質酸(HA)、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質素、肝素、硫酸類肝素或其衍生物，其選自與堿金屬和堿土金屬的鹽，所述堿金屬和堿土金屬選自鈉、鉀、鎂、鈣；季銨鹽；羧酸酯類、0-酯類；酰胺類、過羧酸化衍生物；0_硫酸化衍生物；N-脫こ酰化衍生物；N-硫酸化衍生物。
8.根據權利要求1-7的任ー項的方法，其中當所述生物活性分子是多肽或蛋白質時，其選自 -免疫調節劑，優選自I型干擾素、II型干擾素、III型干擾素； -生長因子，優選自紅細胞生成素和一般鑒定為ESA的分子、紅細胞生長刺激因子例如GM-CSF和G-CSF因子、用于骨和軟骨的生長因子； -細胞因子，優選自IL2、TNF及其具有其可溶性受體的受體拮抗劑、ILl-ra和促炎細胞因子的可溶性受體； -糖蛋白，優選潤滑素； -酶，優選選自超氧化物歧化酶、核糖核酸酶和葡糖腦苷脂酶； _抗體； -激素，優選選自降鈣素、胰島素及其類似物和生長激素。
9.根據權利要求1-7的任ー項的方法，其中當所述生物活性分子是包含并非生物功能基礎的胺基的治療劑時，其選自 -抗腫瘤藥，優選自紫杉烷類、長春花生物堿類、喜樹堿、取代的脲類；鉬、金、銀或其他金屬的復合物；甲氨蝶呤、三甲曲沙、培美曲塞、四氫葉酸酯；嘧啶、胞苷、嘌呤的類似物；腫瘤抗生素和蒽ニ酮類； -抗病毒藥和抗生素； -蛋白酶和聚合酶抑制劑； -抗炎藥、止痛藥、麻醉藥、止痛藥； -麻醉品； -類固醇； -米諾地爾。
10.根據權利要求1-7的任ー項的方法，其中當所述生物活性分子是核酸吋，其選自小干擾RNA、微小RNA、反義RNA。
11.根據上述權利要求的任ー項的方法，用于合成透明質酸或其衍生物與生物活性分子的綴合物，其包含下列步驟 a)用至少ー個醛基(CHO)通過HA與被保護的氨基-醛類在EDC+NHS的水性介質或在無質子溶劑中進行的反應衍生HA或可溶于無質子有機極性溶劑的HA鹽，以形成酰胺； al)水解步驟a)的中間體，以便在磷酸、在pH I. 5-3. O、優選pH 2. 0_2. 5、在25_65°C、優選40-60°C溫度下進行至少30分鐘中釋放醛基； b)使步驟a)或al)中得到的中間體與生物活性分子(TA)反應，該生物活性分子的特征在于它包含能夠與醛基反應的官能團。
12.根據權利要求11的方法，其中所述透明質酸或其衍生物選自用有機和/或無機堿鹽化的透明質酸；透明質酸與脂族、芳基脂族、脂環族、芳香、環狀和雜環系列的醇類的具有酷化百分比20-80%的酯類；HA與脂族、芳基脂族、脂環族、芳香、環狀和雜環系列的胺類的具有酰胺化百分比0. 1-50%的酰胺類；至多第四硫酸化度的透明質酸的0-硫酸化衍生物；具有低于20%酷化百分比的透明質酸的內酯類；具有0. 1-30%脫こ酰化百分比的透明質酸脫こ酰化化合物；具有0. 1-100%且優選25-75%過羧酸化度的透明質酸過羧酸化衍生物。
13.根據權利要求11-12的任ー項的方法，其中所述生物活性分子是蛋白質或多肽且所述官能團是胺基。
14.根據權利要求13的方法，其中在使用氰基硼氫化鈉或氫化鋁鋰或硼氫化鈉的還原條件下將所述蛋白質或多肽加入步驟a)或al)中得到的中間體中。
15.根據權利要求11-14的任ー項的方法，其中所述多肽或蛋白質選自干擾素、紅細胞生成素、血細胞生成刺激因子、骨/軟骨生長因子、生長激素、潤滑素、胰島素、降鈣素、ILl_ra0
16.根據權利要求11-15的任ー項的方法，其中所述HA的鹽是HATBA。
17.可通過根據權利要求1-16的合成方法得到的糖胺聚糖類(GAG)與生物活性分子的綴合物。
18.可通過根據權利要求11-16的合成方法得到的透明質酸(HA)與生物活性分子的綴合物。
19.根據權利要求18的綴合物，其選自HA-IFN、HA-EPO、HA-GCSF、HA-骨/軟骨生長因子、HA-hGH、HA-潤滑素 HA-胰島素、HA-sCT、HA-ILl-ra。
20.根據權利要求17-19的任一項的綴合物，其用于醫學領域。
21.根據權利要求20的綴合物用于制備具有抗病毒或抗腫瘤作用的藥物的用途。
22.根據權利要求21的用途，其中所述綴合物是HA-IFN。
23.藥物組合物，其包含作為活性成分的根據權利要求17-20任ー項所定義的綴合物與ー種或多種藥理學可接受的賦形劑。
24.根據權利要求23的藥物組合物，用于ロ服、直腸、陰道內、舌下、眼內應用；或作為通過皮內、靜脈內、肌內、皮下、動脈內、鞘內、心內、滑膜內、關節內、腹膜內、膀胱內注射的可注射溶液；或配制成用于局部應用，例如凝膠、霜劑、軟膏劑、泡沫、干粉、噴霧劑、皮膚或透皮硬膏劑。
25.根據權利要求24的藥物組合物，配制成用于肝和/或肺定位的可注射靜脈內溶液或具有用于皮下和/或皮內和/或關節內施用的控釋的系統。
26.生物材料，其特征在于包含根據權利要求17-19的任ー項所定義的綴合物的基質。
全文摘要
本發明涉及糖胺聚糖類(GAG)與具有不同特性的生物活性分子(包含小分子和大分子)的綴合物的合成方法。本發明特別涉及透明質酸(HA)及其衍生物與具有生物作用的多肽類和蛋白質例如干擾素、紅細胞生成素、生長因子、胰島素、細胞因子、抗體和激素的綴合。本發明的目的還涉及通過GAG與被保護的氨基醛類在上述舉出的綴合過程中部分或完全反應得到的可分離的中間體。
文檔編號C08B37/00GK102803297SQ201080026531
公開日2012年11月28日 申請日期2010年6月4日 優先權日2009年6月16日
發明者M·戴斯特, D·雷尼爾, G·帕蘇特, A·羅薩托 申請人:菲迪雅制藥股份公司