專利名稱：一種可注射的化學交聯蛋白質/多肽水凝膠及其制備方法
技術領域：
本發明屬生物技術、生物醫用材料及組織工程技術領域，具體涉及一種可注射的 化學交聯蛋白質/多肽水凝膠及其制備方法。
背景技術：
近年來，新型生物醫用材料以及相關技術的發展，使得許多疾病的診斷和治療 水平有了顯著的進步。據估計，目前已有超過8000種醫療器械，2500種診斷類產品以及 40000種藥物制劑中使用了各種類型的(包括聚合物、陶瓷和金屬等)生物醫用材料(Adv. Mater.，2006，18，1345-1360)。然而，對于性能更為優異且更適宜于生物友好環境中使用的 生物醫用材料及其制備技術的需求仍日益高漲。水凝膠是富含大量水分的交聯網絡材料，其網絡骨架通常是天然或合成的聚合物 高分子鏈。近來又涌現出許多由小分子通過非共價鍵自組裝(self-assembly)而形成的超 分子水凝膠。因為與充盈大量水溶液的機體組織十分相似，相較于其它類型材料更有利于 保護細胞以及易失活的藥物如多肽、蛋白質、寡聚核苷酸和DNA等，所以水凝膠既是一類重 要的用于構建組織工程細胞支架的材料，又是一種極具前景的多肽和蛋白質等藥物的控釋 載體材料。在眾多水凝膠中，原位成型的可注射性水凝膠因創傷小且操作簡易而最具臨床 價值。可注射性水凝膠在體外保持流動狀態，可以很容易的填充到形狀復雜的缺損部位， 同時能夠負載具有治療功效的活性分子，注射于病灶部位實現局部給藥。能夠對物理刺 激進行響應而發生溶膠-凝膠轉變的聚合物是一類重要的可注射性水凝膠。ReGel是由 PLGA-PEG-PLGA兩親性三嵌段共聚物構成的溫敏性可注射水凝膠(J. Control. Release, 2001，72，203-215)。它在室溫或低于室溫時保持可流動的溶液狀態，當溫度達到人體溫度 時成為凝膠狀態。ReGel可以改善疏水小分子藥物的溶解性能，而其自身屬可降解聚合物， 在體內的降解周期達到數周，降解產物為人體可吸收的乳酸、羥基乙酸和低分子量的聚乙 二醇。BTG公司開發了負載抗腫瘤藥物紫杉醇的ReGel，商品名為OncoGel ，目前作為治療 食道癌的藥物正在進行臨床二期試驗。盡管ReGel作為可注射水凝膠載體材料的前景廣 闊，但是作為嵌段共聚物ReGel本身是一種粘性固體，給運輸和制劑生產帶來極大不便，而 且它的合成要求較苛刻、制備代價較高。利用天然聚合物也能夠制備可注射性水凝膠，其生物相容性和生物可降解性都很 好，且避免了合成聚合物繁瑣的制備過程。專利US 6129761和專利WO 99015211報道了利 用透明質酸、海藻酸鹽在二價或二價以上高價陽離子(如鈣離子、鋁離子等)存在下形成水 凝膠，部分固化的水凝膠具有可注射性。但是此類水凝膠的缺陷在于起到交聯作用的高價 陽離子會通過離子交換逐漸流失到周圍介質中，使得凝膠溶解，且該過程難以控制。由于機體組織的細胞外基質中支持細胞生長的三維網絡是由膠原蛋白和彈性蛋 白所構成，使得基于蛋白質或多肽的水凝膠成為另一類引人注目的生物材料。商品化的多 肽水凝膠有BD Biosciences公司的PuraMatrix 水凝膠，它是由6個或6個以上氨基酸構成，這些氨基酸的特點是包含了正電荷側基(如精氨酸R)、負電荷側基(如天門冬氨酸 D)以及疏水性側基(如丙氨酸A)，且組成相間排列的氨基酸序列，如(RARADADA)n(相關的 專利有WO 2002062969A2)。PuraMatrix 水凝膠的微觀結構為納米纖維組成的三維網絡， 適宜于培養各種類型的細胞。然而，此類水凝膠的強度較弱，模量G’(IHz時)僅僅只有 50Pa (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005,102，8414-8419)，限制了 其在修復高模量組織(如 軟骨和骨)方面的應用。專利WO 2007043048A2公開了一種由6個以下氨基酸構成的多 肽水凝膠，特點是多肽序列中至少有一個氨基酸帶有芳環側基(如帶苯環的苯丙氨酸F)， 且序列的一端帶有芴甲氧羰基(Fmoc)或芐氧羰基(Cbz)封端基團。這種多肽水凝膠的模 量G’(IHz時)達到1000-10，OOOPa，但是其缺陷在于制備水凝膠時需先將多肽溶解于具 有毒性和腐蝕性的六氟異丙醇等有機溶劑后再稀釋于水中。專利WO 2009117497A1以及 Haines-Butterick 等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007，104，7791-7796)報道了 一類可注 射性的多肽水凝膠，特點是由20個氨基酸構成，其中第10和第11兩個相鄰氨基酸分別為 D型脯氨酸(dP)和L型脯氨酸(LP)，單個多肽分子能夠折疊成折疊構象并進一步組裝 成為三維納米纖維網絡。這種多肽水凝膠在剪切作用下，網絡結構遭到破壞，模量和粘度大 大降低；當去除剪切后，網絡結構能夠自發恢復，因此具有可注射性。不過由于此類多肽的 氨基酸序列較長且需精確控制，大大增加了合成的步驟和成本。 除了上述物理凝膠(指不通過化學共價鍵形成的網絡)外，通過化學交聯的方法 也能夠制備可注射性水凝膠，常見的交聯方法有光交聯、Michael加成反應和形成Schiff 堿的反應等。其中，Michael加成和SchifT堿反應的交聯速度相對較慢(一般需30分鐘 或以上)，從而可能在一定程度上限制其臨床應用(Biomaterials，2004，25，1339-1348 ； Int. J. Pharm.，2006, 322，44-51)。光交聯方法是指在光引發劑存在下，通過可見或紫外 光照射含有不飽和雙鍵的預聚物溶液，使預聚物形成化學交聯的網絡，例如，美國專利 US20050238678A1公開了一種光交聯聚谷氨酸水凝膠，而中國專利CN101502655A則公開了 一種光交聯羧甲基殼聚糖水凝膠的制備方法。雖然光交聯水凝膠的凝膠時間短(因此可通 過注射在被注射部位快速形成凝膠)、機械強度較高(取決于交聯密度)，但是光交聯反應 所必需的光引發劑往往具有細胞毒性，而紫外光的照射也可能導致被照射部位的細胞死亡 (Biomaterials，2005，26，1211-1218 ；Biomaterials，2009，30，344-353)，在很大程度上限 制了光交聯水凝膠作為可注射原位成型水凝膠的應用。
發明內容
本發明的目的在于提出一種三維網絡結構穩定、交聯速度快的可注射的化學交聯 蛋白質/多肽水凝膠及其制備方法。本發明提供的可注射的化學交聯蛋白質/多肽水凝膠，是由帶有可交聯的酚羥基 基團的天然或合成(包括化學合成與生物技術合成)蛋白質/多肽，在辣根過氧化物酶和 過氧化氫存在的條件下所形成的化學交聯網絡。所述的酶可快速催化所述的蛋白質/多肽發生化學交聯形成水凝膠網絡。本發明中，蛋白質/多肽部分或全部為富含酪氨酸(Tyr)或3，4_ 二羥基苯丙氨酸 (DOPA)的天然蛋白質(如動物絲蛋白，角蛋白，酪蛋白，貽貝粘附蛋白Mefp-Ι，貽貝粘附蛋 白Mefp-2，貽貝粘附蛋白Mefp-3，貽貝粘附蛋白Mefp-4，貽貝粘附蛋白Mefp_5等)中的任何一種或任何幾種的組合。本發明中，蛋白質/多肽部分或全部為合成多肽或聚肽(polyp印tide)，其氨基酸序列中至少含有2個具有酚羥基側鏈的氨基酸，如酪氨酸、對羥基苯甘氨酸、2，3-二羥基苯 丙氨酸、2，4- 二羥基苯丙氨酸，2，5- 二羥基苯丙氨酸，2,6- 二羥基苯丙氨酸，3,4- 二羥基苯 丙氨酸，3，5- 二羥基苯丙氨酸等中的任何一種或任何幾種的組合。本發明還提供上述化學交聯蛋白質/多肽水凝膠的制備方法，具體步驟為(1)通過預處理(方法依據蛋白質來源決定)得到天然蛋白質(溶液)；采用化學 或生物(轉基因)技術合成多肽或聚肽。(2)配制蛋白質/多肽與辣根過氧化物酶的混合溶液，其中蛋白質/多肽的濃度為 1 20% (w/v)，辣根過氧化物酶的最終濃度為0. 01 10mg/mL，溶液的溶劑為純水、緩沖 溶液(如磷酸(PBS)、三羥甲基氨基甲烷(tris)、硼酸、檸檬酸等)、人體或動植物體液、組織 培養液以及其它不以有機溶劑為主體的溶劑介質；(3)調節混合溶液的pH值為4 8 ；(4)在該混合溶液中加入過氧化氫，過氧化氫的濃度為0. 001 (ν/ν), 20 40°C下進行交聯。本發明具有以下特點和有益效果(1)本發明提出的蛋白質/多肽水凝膠為化學交聯凝膠，三維網絡結構穩定，不易 受到使用環境中的各種因素(如生理環境中存在的化學物質、機械作用力等)的影響。在 這一點上，化學交聯凝膠要優于物理交聯凝膠(如背景技術中所述的通過自組裝形成的多 肽水凝膠)。(2)本發明提出的化學交聯凝膠是在酶催化下，在環境友好的條件(常溫常壓、水 溶液)下實現，交聯速度快，最快可在30s內完成。通過改變組分(酶、蛋白質/多肽以及 過氧化氫)的濃度，能夠在基本不改變網絡結構的前提下，對交聯速度、交聯所形成的凝膠 的機械強度、凝膠的降解速率等性能進行調節。采用的酶為人體中含有(微量)的辣根過 氧化物酶，該酶主要提取自山葵植物的根部，已實現商品化生產。交聯反應所必需的過氧化 物選用的是在外科手術中常被作為消毒劑使用的低濃度的過氧化氫(雙氧水)。(3)本發明提出的蛋白質/多肽水凝膠，在交聯反應前是流動性好的水溶液，交聯 速度快，通過注射后可在短時間內在原位形成水凝膠，因而能夠作為可注射材料使用。(4)本發明提出的蛋白質/多肽水凝膠含水量高、生物相容性好、安全無毒以及可 生物降解，且降解產物為人體可吸收的氨基酸。另外，凝膠網絡骨架十分接近細胞外基質中 支持細胞生長的蛋白質三維網絡，在藥物緩釋載體、細胞培養支架等諸多生物醫學領域具 有廣泛的應用前景。
具體實施例方式下面通過實例進一步描述本發明，但不限于這些實例。實施例1-3提供絲素蛋白(含Tyr)水凝膠的制備方法實施例1將20g桑蠶生絲放入4L Na2CO3 (0. 5wt% )水溶液中在100°C脫膠40分鐘，取出后 用去離子水沖洗，晾干。將IOg脫膠絲溶液于IOOmL 9. 3mol/L的LiBr水溶液中，在40°C下不斷攪拌至蠶絲溶解。過濾，除去未溶解的蠶絲。得到的絲素蛋白鹽溶液用去離子水透析 除去LiBr鹽。透析好的絲素蛋白溶液離心去除不溶的其它雜質，留下清液，進一步濃縮后 得到濃度為12%的再生絲素蛋白水溶液。將5mg辣根過氧化物酶(HRP，100unit/mg)溶于2mL 0. lmol/L的PBS緩沖溶液(pH =6. 0)中，配成2. 5mg/mL的HRP溶液，在4°C冰箱中保存。將0. 3mLHRP溶液加入2. 5mL再 生絲素蛋白水溶液(12%)中，混合均勻，置于37°C水浴中預熱5分鐘。然后在混合溶液中 加入0. 2mL配制好的0. 75%過氧化氫水溶液，在60s時間內能夠形成淺黃色透明的水凝膠， 凝膠的模量G’(IHz時，使用旋轉流變儀測定)達到3000Pa。實施例2將20g桑蠶生絲放入4L NaHCO3(0. 5wt% )水溶液中在100°C脫膠40分鐘，取出 后用去離子水沖洗，晾干。將IOg脫膠絲溶液于IOOmL 9. 3mol/L的LiBr水溶液中，在40°C 下不斷攪拌至蠶絲溶解。 過濾，除去未溶解的蠶絲。得到的絲素蛋白鹽溶液用去離子水透 析除去LiBr鹽。透析好的絲素蛋白溶液離心去除不溶的其它雜質，留下清液。將清液冷凍 干燥，得到粉末或發泡狀再生絲素蛋白固體。將再生絲素蛋白固體溶于去離子水中，離心去 除不溶物，留下清液，濃度為15-20%，稀釋至所需濃度(本例中為12% )，得到再生絲素蛋 白水溶液。將0. 5mg辣根過氧化物酶(HRP，100unit/mg)溶于2mL 0. lmol/L的PBS緩沖溶液 (pH = 7. 4)中，配成0. 25mg/mL的HRP溶液，在4°C冰箱中保存。室溫下(20°C )，將0. 3mL HRP溶液加入2. 5mL再生絲素蛋白水溶液(12%)中，混合均勻。然后在混合溶液中加入 0. 2mL配制好的0. 05%過氧化氫水溶液，在600s時間內能夠形成淺黃色透明的水凝膠，凝 膠的模量G’ (IHz時，使用旋轉流變儀測定)達到lOOOPa。實施例3將20g桑蠶生絲放入4LNa2C03(0. 5wt% )水溶液中在100°C脫膠60分鐘，取出后 用去離子水沖洗，晾干。將IOg脫膠絲溶液于100mL9. 3mol/L的LiBr水溶液中，在40°C下 不斷攪拌至蠶絲溶解。過濾，除去未溶解的蠶絲。得到的絲素蛋白鹽溶液用去離子水透析 除去LiBr鹽。透析好的絲素蛋白溶液離心去除不溶的其它雜質，留下清液。將清液冷凍干 燥，得到粉末或發泡狀再生絲素蛋白固體。將再生絲素蛋白固體溶于去離子水中，離心去除 不溶物，留下清液，濃度為15-20%，稀釋至所需濃度(本例中為18% )，得到再生絲素蛋白 水溶液。將20mg 辣根過氧化物酶(HRP，100unit/mg)溶于 2mL 0. lmol/L 的 PBS 緩沖液(pH =7. 4)中，配成lOmg/mL的HRP溶液，在4°C冰箱中保存。將0. 3mLHRP溶液加入2. 5mL再 生絲素蛋白水溶液(18%)中，混合均勻，置于37°C水浴中預熱5分鐘。然后在混合溶液中 加入0. 2mL配制好的過氧化氫水溶液，在30s時間內能夠形成淺黃色透明的水凝膠，凝 膠的模量G’(IHz時，使用旋轉流變儀測定)達到5000Pa。實施例4本實施例提供貽貝粘附蛋白Mefp-I (含D0PA)水凝膠的制備方法在12mg/mL 的 Mefp-l(Cell-Tak ，BD Biosciences，5%醋酸溶液)中加入 Tris 調 節PH至8。另將IOmg辣根過氧化物酶(HRP，100unit/mg)溶于2mL 0. lmol/L的PBS緩沖 溶液(pH = 7. 4)中，配成5mg/mL的HRP溶液，在4°C冰箱中保存。將0. 3mL HRP溶液加入2. 5mL Mefp-I水溶液中，混合均勻，置于37°C水浴中預熱5分鐘。然后在混合溶液中加入 0. 2mL配制好的0. 5%過氧化氫水溶液，在300s時間內能夠形成水凝膠，凝膠的模量G’ (IHz 時，使用旋轉流變儀測定)達到800Pa。實施例5-6提供聚(L-賴氨酸m-L_酪氨酸n)水凝膠的制備方法實施例5(1)0-芐氧羰基-L-酪氨酸-N-羧基內酸酐(O-Z-L-TyrNCA)的制備在500ml三口燒瓶中加入12g 0_芐氧羰基_L_酪氨酸，然后加入5. Og三光氣，在 室溫下抽真空2小時后，加入300mL無水四氫呋喃，然后在氬氣氣氛下，40°C攪拌下反應3 小時。反應完畢后(反應體系由混懸液變為澄清溶液)，旋蒸除去溶劑，得到固體初產物，真 空干燥過夜。把初產物溶于無水四氫呋喃中，然后加入正己烷使其重結晶，無水四氫呋喃與 正己烷的比例為3 1，最終的產物為無色針狀晶體，產率約為75%。 (2) N- ε -芐氧羰基_L_賴氨酸N-羧基內酸酐(Ν_ ε -Z-L-LysNCA)的制備在500ml三口燒瓶中加入IOg N-ε -芐氧羰基-L-賴氨酸，然后加入5. Og三光氣， 在室溫下抽真空2小時后，加入300mL無水四氫呋喃，然后在氬氣氣氛下，50°C攪拌下反應 2小時。反應完畢后(反應體系由混懸液變為澄清溶液)，旋蒸除去溶劑，得到固體初產物， 真空干燥過夜。把初產物溶于乙酸乙酯中，然后加入正己烷使其重結晶得到最終產物，乙酸 乙酯與正己烷的比例為1 1，產率約為85%。(3)聚(L-賴氨酸m-L_酪氨酸n)的制備(m = 45，η = 5)把6. 5g N- ε -Z-L-LysNCA 和 0. 8g O-Z-L-TyrNCA 溶于 75mL 四氫呋喃，然后加入 0. lmol/L的叔丁醇鈉4. 8ml，在室溫下攪拌1天，然后在40°C下攪拌2天，再在80°C下攪拌 4小時。反應完畢，加入乙醚沉淀得到白色產物A，真空干燥過夜，產率為80%左右。將5g上步產物A溶于約50ml三氟醋酸中，然后在攪拌下加入20mL 33wt%溴化氫 的醋酸溶液。反應1小時后，加入乙醚沉淀得到聚(L-賴氨酸m-L-酪氨酸n)粗產物。將粗 產物溶于少量水/甲醇(1 4)混合溶劑中，乙醚沉淀，得到聚(L-賴氨酸m-L-酪氨酸n)， 真空干燥過夜，產率約為90 %。(4)聚(L-賴氨酸m-L_酪氨酸n)交聯水凝膠的制備將0.75g聚(L-賴氨酸m-L_酪氨酸n)溶于5mL去離子水中，配成15%溶液。另將IOmg辣根過氧化物酶(HRP，100unit/mg)溶于2mL 0. lmol/L的PBS緩沖溶液(pH = 7. 4) 中，配成5mg/mL的HRP溶液，在4°C冰箱中保存。將0. 3mL HRP溶液加入2. 5mL聚(L-賴氨 酸^!^-酪氨酸n)水溶液(15%)中，混合均勻，置于37°C水浴中預熱5分鐘。然后在混合 溶液中加入0. 2mL配制好的0. 5%過氧化氫水溶液，在60s時間內能夠形成淺黃色透明的水 凝膠，凝膠的模量G’(IHz時，使用旋轉流變儀測定)達到2000Pa。實施例6稱取實施例5中聚(L-賴氨酸m-L_酪氨酸n)0.6g溶于5mL去離子水中，配成12% 溶液。另將IOmg辣根過氧化物酶(HRP，100unit/mg)溶于2mL 0. lmol/L的PBS緩沖溶液 (pH = 7. 4)中，配成5mg/mL的HRP溶液，在4°C冰箱中保存。室溫下(20°C )，將0. 3mL HRP 溶液加入2.5mL聚(L-賴氨酸m-L-酪氨酸n)水溶液(12%)中，混合均勻，然后在混合溶 液中加入0. 2mL配制好的0. 5%過氧化氫水溶液，在100s時間內能夠形成淺黃色透明的水 凝膠，凝膠的模量G’(IHz時，使用旋轉流變儀測定)達到1200Pa。
權利要求
一種可注射的化學交聯蛋白質/多肽水凝膠，其特征在于是由帶有可交聯的酚羥基基團的天然或合成蛋白質/多肽，在辣根過氧化物酶和過氧化氫存在的條件下所形成的化學交聯網絡。
2.根據權利要求1所述的化學交聯蛋白質/多肽水凝膠，其特征在于所述的蛋白質/ 多肽部分或全部為富含酪氨酸或3，4_ 二羥基苯丙氨酸的天然蛋白質中的任何一種，或其 中任何幾種的組合。
3.根據權利要求1所述的化學交聯蛋白質/多肽水凝膠，其特征在于所述的蛋白質/ 多肽部分或全部為合成多肽或聚肽，其氨基酸序列中至少含有2個具有酚羥基側鏈的氨基酸。
4.根據權利要求3所述的化學交聯蛋白質/多肽水凝膠，其特征在于所述的氨基酸為 具有酚羥基側鏈的氨基酸中的任何一種，或其中任何幾種的組合。
5.一種如權利要求1，2，3之一所述的化學交聯蛋白質/多肽水凝膠的制備方法，其特 征在于具體步驟如下(1)通過預處理得到天然蛋白質；采用化學或生物技術合成多肽或聚肽；(2)配制蛋白質/多肽與辣根過氧化物酶的混合溶液，其中蛋白質/多肽的最終濃度為 1 20% (w/v)，辣根過氧化物酶的最終濃度為0. 01 10mg/mL，溶劑為純水、緩沖溶液、人 體或動植物體液、組織培養液、其它不以有機溶劑為主體的溶劑介質；(3)調節混合溶液的pH值為4 8；(4)在該混合溶液中加入過氧化氫，過氧化氫的濃度為0.001 (v/v)，在20 40°C下進行交聯。
全文摘要
本發明屬生物技術、生物醫用材料及組織工程技術領域，具體為一種可注射的化學交聯蛋白質/多肽水凝膠及其制備方法。本發明由帶有可交聯的酚羥基基團的天然或合成蛋白質/多肽、辣根過氧化物酶和過氧化氫組成，在生理條件下快速形成化學交聯水凝膠。該蛋白質/多肽水凝膠生物相容性好、可降解、降解產物為人體可吸收的氨基酸，機械強度易于調控，且骨架十分接近細胞外基質中支持細胞生長的蛋白質三維網絡，可廣泛用于藥物緩釋載體、細胞培養支架等諸多生物和醫學領域。
文檔編號C08L89/00GK101864178SQ20101020229
公開日2010年10月20日 申請日期2010年6月17日 優先權日2010年6月17日
發明者楊宇紅, 龔祖光 申請人:復旦大學