專利名稱：：一種超聲波提取抗輻射氧化蕨麻多糖的方法
技術領域：
：本發明涉及天然多糖的制備方法，具體地說是一種超聲波提取具有抗輻射氧化作用的蕨麻多糖的方法。
背景技術：
：電離輻射對生物體的損傷既有能量傳遞的直接作用，也有通過水的輻射反應，大量產生自由基的間接作用。DNA分子中堿基、核糖和磷酸鍵都可能遭受自由基的攻擊，造成堿基與核糖氧化、鏈斷裂、與蛋白質交聯等多種類型的損傷。自由基引發的脂類過氧化作用可造成生物膜中飽和與不飽和脂肪酸的比例失調，改變膜結構的剛柔特性，增加膜的通透性，甚至發生崩解。MDA是脂質過氧化的分解產物，其含量可反映脂質過氧化的程度以及機體受自由基攻擊的程度。SOD和CAT是催化02'和分解H202的抗氧化酶，它們都反映機體的抗氧化能力。自由基作用于脂質過氧化反應，氧化終產物丙二醛等會引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯聚合，該現象是衰老的一個基本因素。為了減緩氧化、衰老的過程，修復治療受傷的機體，人們通常食用一些含有天然存在的抗氧化劑的食物，如含維生素A、維生素C、維生素E、硒、鋅的水果、綠葉蔬菜、漿果等。與此同時，人們也在有目的地尋找毒性低且活性高的抗氧化物質。專利CN1143084A公開了一種抗氧化劑接枝的多糖或抗氧化劑交聯的多糖在治療關節炎、作為藥物介質方面的作用，降低術后粘連的發生率、促進慢性創傷和潰瘍的愈合。專利CN101353382A公開了一種具有抗氧化活性蟲草多糖的提取方法，報道了一種用蟲草廢液提取抗氧化活性多糖的方法，精多糖的提取率約為7.8%。專利CN1144835A公開了一種從迷迭植物中提取抗氧化劑的方法，該方法是在提取抗氧化劑之前，先用水蒸汽或超臨界提取迷迭植物中的精油，再提取其中的抗氧化劑。專利CN101233950A公開了一種從低值海水魚及下腳料蛋白中提取抗氧化劑的技術，得到的抗氧化劑其抗氧化活性達到維生素E的57.194.4。/。；專利CN101099768A公開了一種從香椿老葉中提取抗氧化活性物質的方法。蕨麻(薔薇科委陵菜屬鵝絨委陵菜的塊根)具有治療脾虛腹瀉、病后貧血、營養不良、健脾益胃、生津止渴、益氣補血等效果。專利CN02138522.X公開了一種含有蕨麻提取物的保健食品及其制備，采用水和/或乙醇提取蕨麻，制得蕨麻提取物，加入或不加食品添加劑制成保健食品，具有調解人體免疫功能、抗疲勞的功效。專利CN101001842A公開了蕨麻在制備抗缺氧藥物中的應用，可顯著提高窒息性缺氧和急性減壓缺氧小鼠的存活率和存活時間。專利ZL200610090097.5公開了一種抗輻射蕨麻多糖的制備方法，得到了能增強動物抗輻射能力的多糖，純化后多糖得率為6.32%;專利CN101358222A公開了一種以蕨麻為原料微波輔助提取抗輻射多糖的方法，純化后多糖的得率為12.18%，用于治療X射線引起的輻射損傷。超聲波的優點是并不能使樣品內的分子產生極化，而是在溶劑和樣品之間產生聲波空化作用，導致溶液內氣泡的形成、增長和爆破壓縮，從而使固體樣品分散，增大樣品與萃取溶劑之間的接觸面積，提高目標物從固相轉移到液相的傳質速率。專利ZL200610166326.7授權了一種米糠多糖的超聲波提取方法，超聲波功率200400W，并未考慮到提取條件對樣品純度的影響，純化后多糖的得率較低，僅為2.87%，很難應用于實際生產。上述技術中，常規提取多糖方法存在耗時長、溶劑消耗量大、提取效率低及運行成本高等問題；而微波提取會對多糖分子結構產生影響，可能導致大分子鏈的降解。抗輻射氧化作用不同于單純的抗輻射作用，需以機體各器官的抗氧化楊酶、抗氧化系統綜合評價。而多糖結構的變化會對其生物活性產生巨大的影響，因此，在提取過程中如何能避免上述技術問題、克服現有技術缺陷，得到目標生物活性物質是亟待解決的問題
發明內容本發明的目的在于提供一種超聲波提取抗輻射氧化蕨麻多糖的方法，它首次使用超聲波法提取蕨麻多糖，提取效率高、運行成本低，且能最大限度地減小對多糖分子結構及其生物活性產生影響。本發明的另一目的在于提供一種蕨麻多糖在制備具有修復X-射線引發的自由基氧化損傷功能的天然制品或保健食品中的應用。本發明提供的超聲波提取抗輻射氧化蕨麻多糖的方法，可以通過以下技術方案來實現，其步驟為1)稱取一定量蕨麻干粉，置于超聲波提取設備中，加入2050倍(m/v)蒸餾水，攪拌、混勻；在超聲波功率為100180W、溫度為4(TC7(TC下提取30l20分鐘，在0.060.08MPa壓力條件下過濾，濾液在壓力為0.060.08MPa、溫度為55。C65。C的條件下減壓濃縮至原體積的1/91/3，在濃縮液中加入乙醇，所述的乙醇含量占加入乙醇后溶液總體積的7080%，室溫下靜置2436小時后在40005000轉/分鐘的轉速下離心，收集下層沉淀物，并在-60-5(TC、113Pa的條件下冷凍干燥2430小時，得物質A;2)稱取一定量物質A，用69倍重量的蒸餾水溶解，后加入IO^g/ml木瓜蛋白酶液，酶液與A液的體積比為1:100，在溫度405(TC下酶解1012小時，再用正丁醇和氯仿體積比為l:24的混合液，萃取35次，收集上層水溶液，在溫度405(TC、壓力0.060.08MPa條件下，減壓濃縮至原水溶液體積的1/101/12，放入截留分子量60008000Da的透析袋中，流水透析2024小時，再用蒸餾水透析1836小時，將透析袋內液體在溫度4050°C、壓力0.060.08MPa條件下減壓濃縮至原水溶液體積的1/101/12，加入乙醇，所述的乙醇含量占加入乙醇后溶液總體積的7080%，靜置1014小時，在40005000轉/分鐘的轉速下離心，收集沉淀物在溫度-60-5(TC、壓力113Pa條件下冷凍干燥3036小時，得純化的蕨麻多糖。純化后的蕨麻多糖經紅外掃描，紅外光譜顯示如圖5:在2829.67cm"處有一特征峰，是分子中C-H鍵的變角振動引起的；在3423.56cm"處有一特征峰，是O-H的伸縮振動引起的；802.3cm"附近吸收峰表明了a-D-吡喃半乳糖的存在；862.67cm"處的吸收峰說明含有(3-D-吡喃甘露糖，這些均為多糖的吸收峰。本發明提供的上述超聲波提取抗輻射氧化蕨麻多糖的方法，與熱水浸提和微波萃取工藝相比，超聲波提取具有如下突出特點無需高溫，萃取效率高，純度高，對活性物質破壞小，具有廣譜性，能耗較小，工藝成本低，綜合經濟效益顯著(見下表)。本發明是以蕨麻為原料，經過超聲波提取、純化制備的一種可以修復由輻射引起的氧化損傷的天然產品，此天然產品無毒副作用，且抗輻射氧化效果好。對X射線輻射引起的自由基所造成的體內氧化損傷有較好的療效。經3.5GyX射線照射小鼠的抗氧化能力實驗表明7天服用該制劑使輻射損傷動物的SOD活性升高66.7%;T-AOC活力54.6%,CAT活力上升105.7%，MDA含量下降63.20/0。超聲波取法與傳統提取法、微波法比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本發明蕨麻多糖抗輻射氧化效果動物試驗實驗用小鼠60只，隨機分成5組，每組12只，分別如下正常對照組、輻射對照組、多糖高/中/低三個劑量組(240mg/(kgb.w.);120mg/(kgb.w.);60mg/(kgb.w.))，正常對照組灌胃生理鹽水。輻射前給藥15天，輻射后12h內給藥，以后每天給藥一次，7天后測小鼠的體內抗氧化指標。照射條件為X射線，小鼠單次全身照射劑量3.5Gy，劑量率1Gy/min，源皮距lm。除正常對照組不進行照射外，其他組均進行照射。由實驗結果圖l可知，輻射對照組與正常對照組相比，肝臟CAT活力明顯降低正常對照組的CAT的活性明顯高于輻射對照組(pO.Ol)。照射后7d，各喂藥組間CAT活性與輻射對照組相比均有所增高；其中低劑量組CAT活性恢復達到顯著水平(p<0.05)。由實驗結果圖2可知，X射線照射過的小鼠的MDA含量明顯高于正常對照組。照射后7d，各喂藥組間MDA含量與輻射對照組相比均有所下降，其中低劑量組的MDA含量下降的最為明顯。由實驗結果圖3可知，正常對照組的SOD的活性明顯高于輻射對照組。照射后7d，各喂藥組間SOD活性與輻射對照組相比均有所增高。由實驗結果圖4可知，輻射對照組與正常對照組相比，肝臟T-AOC活力明顯降低，達到極顯著水平(pO.Ol)。照射后7d，各喂藥組間T-AOC活性與模型對照組相比均有所增高。通過上述動物實驗結果表明本發明制備的蕨麻多糖可以應用于制備具有修復X-射線引發的良由基氧化損傷功能的天然制品或保健食品中。圖1是蕨麻多糖制劑對輻射小鼠肝臟CAT活力的影響圖2是蕨麻多糖制劑對輻射小鼠肝臟MDA含量的影響圖3是蕨麻多糖制劑對輻射小鼠肝臟SOD活力的影響圖4是蕨麻多糖制劑對輻射小鼠肝臟T-AOC活力的影響圖5是對蕨麻多糖制劑的紅外掃描圖具體實施方式下面結合實施例及比較例對本發明作進一步說明-實施例l:1)稱取一定量蕨麻干粉，置于超聲波提取設備中，加入20倍(m/v)蒸餾水，攪拌、混勻；在超聲波功率為IOOW、溫度為5(TC條件下提取60分鐘，在壓力0.07MPa的條件下過濾，濾液在壓力0.08MPa、溫度為6(TC條件下減壓濃縮至原體積的1/3，在濃縮液中加入乙醇(乙醇含量占加入乙醇后溶液總體積的75%)，室溫下靜置30小時后，在4000轉/分鐘的轉速下離心，收集下層沉淀物在-55'C，在壓力1Pa的條件下冷凍干燥28小時，得物質A;2)稱取一定量物質A，用6倍重量的蒸餾水溶解，后加入10pg/ml木瓜蛋白酶液，酶液與A液的比例為1:100(v/v)，在45。C下酶解11小時，再用正丁醇和氯仿混合液(1:3，v/v)萃取4次，收集上層水溶液，在溫度45X:、壓力0.07MPa條件下減壓濃縮至原水溶液體積的1/11，放入截留分子量60008000Da的透析袋中，流水透析22小時，再用蒸餾水透析24小時。將透析袋內液體在溫度45'C、壓力0.07MPa條件下減壓濃縮至原水溶液體積的1/11，加入乙醇(乙醇含量占加入乙醇后溶液總體積的75%)，靜置12小時，在4500轉/分鐘的轉速下離心，收集沉淀物在溫度-55'C、壓力1Pa條件下冷凍干燥33小時，得純化的蕨麻多糖。純化多糖的得率為9.8625%，經苯酚-硫酸法檢測其總糖含量為93.5%。實施例2:1)稱取一定量蕨麻干粉，置于超聲波提取設備中，加入35倍(m/v)蒸餾水，攪拌、混勻；在超聲波功率為180W、溫度為7(TC條件下提取30分鐘，在壓力0.06MPa的條件下過濾，濾液在壓力0.07MPa、溫度為55t:條件下減壓濃縮至原體積的1/9，在濃縮液中加入乙醇(乙醇含量占加入乙醇后溶液總體積的80%)，室溫下靜置36小時后，在5000轉/分鐘的轉速下離心，收集下層沉淀物在-6(TC，13Pa的條件下冷凍干燥30小時，得物質A;2)稱取一定量物質A，用9倍重量的蒸餾水溶解，后加入10ng/ml木瓜蛋白酶液，酶液與A液的比例為1:100(v/v)，在4(TC下酶解12小時，再用正丁醇和氯仿混合液(1:2，v/v)萃取5次，收集上層水溶液，在溫度40。C、壓力0.08MPa下減壓濃縮至原水溶液體積的1/12，放入截留分子量60008000Da的透析袋中，流水透析24小時，再用蒸餾水透析18小時。將透析袋內液體在溫度50°C、壓力0.06MPa條件下減壓濃縮至原水溶液體積的1/12，加入乙醇(乙醇含量占加入乙醇后溶液總體積的80。％)，靜置IO小時，在4000轉/分鐘的轉速下離心，收集沉淀物在溫度-5(TC、壓力13Pa條件下冷凍干燥30小時，得純化的蕨麻多糖。純化多糖的得率為10.5965%，經苯酚-硫酸法檢測其總糖含量為90.3%。實施例3:1)稱取一定量蕨麻干粉，置于超聲波提取設備中，加入50倍(m/v)蒸餾水，攪拌、混勻；在超聲波功率為150W、溫度為4(TC條件下提取120分鐘，在壓力0.08MPa的條件下過濾，濾液在壓力0.06MPa、溫度為65"C條件下減壓濃縮至原體積的1/6，在濃縮液中加入乙醇(乙醇含量占加入乙醇后溶液總體積的70%)，室溫下靜置24小時后在4000轉/分鐘的轉速下離心，收集下層沉淀物在5(TC，在壓力8Pa的條件下冷凍干燥24小時，得物質A;2)稱取一定量物質A，用8倍重量的蒸餾水溶解，后加入10pg/ml木瓜蛋白酶液，酶液與A液的比例為1:100(v/v)，在5(TC下酶解10小時，再用正丁醇和氯仿混合液(1:4，v/v)萃取3次，收集上層水溶液，在溫度5(TC、壓力0.06MPa條件下減壓濃縮至原水溶液體積的1/10，放入截留分子量60008000Da的透析袋中，流水透析20小時，再用蒸餾水透析36小時。將透析袋內液體在溫度40'C、壓力0.08MPa條件下減壓濃縮至原水溶液體積的1/10，加入乙醇(乙醇含量占加入乙醇后溶液總體積的80%),靜置14小時，在5000轉/分鐘的轉速下離心，收集沉淀物在溫度-6(TC、壓力10Pa條件下冷凍干燥36小時，得純化的蕨麻多糖。純化多糖的得率為11.787%，經苯酚-硫酸法檢測其總糖含量為92.2%。比較例l:以實施例1的方法和熱水浸提來進行實驗。兩實驗的差別在于熱水浸提采用7(TC加熱提取180min、蕨麻干粉中加入45倍蒸餾水來代替實施例步驟1中的超聲波提取。1)稱取一定量蕨麻干粉，置于2000ml燒杯中，加入45倍(m/v)蒸餾水，攪拌、混勻；在溫度為7(TC下提取180分鐘，在壓力0.07MPa的條件下過濾，濾液在壓力0.08MPa、溫度6(TC條件下減壓濃縮至原體積的1/3，在濃縮液中加入乙醇(乙醇含量占加入乙醇后溶液總體積的75%)，室溫下靜置30小時后在4000轉/分鐘的轉速下離心，收集下層沉淀物在溫度-55-C、壓力lPa的條件下冷凍干燥28小時，得物質A;2)稱取一定量物質A，用6倍重量的蒸餾水溶解，后加入10pg/ml木瓜蛋白酶液，酶液與A液的比例為i:100(v/v)，在45。C下酶解U小時，再用正丁醇和氯仿混合液(1:3，v/v)萃取4次，收集上層水溶液，在溫度45'C、壓力0.07MPa條件下減壓濃縮至原水溶液體積的1/11，放入截留分子量60008000Da的透析袋中，流水透析22小時，再用蒸餾水透析24小時。將透析袋內液體在溫度45r、壓力0.07MPa條件下減壓濃縮至原水溶液體積的1/11，加入乙醇(乙醇含量占加入乙醇后溶液總體積的75%)，靜置12小時，在4500轉/分鐘的轉速下離心，收集沉淀物在溫度-55'C、壓力1Pa的條件下冷凍干燥33小時，得純化的蕨麻多糖。純化多糖的得率為5.73%，經苯酚-硫酸法檢測其總糖含量為85.6°/。。比較例2:以實施例2的方法和微波輔助提取來進行實驗。兩實驗的差別在于微波輔助提取采用頻率915MHz，功率300W，溫度55'C加熱提取45min以及蕨麻干粉中加入40倍蒸餾水來代替實施例步驟1中的超聲波提取。1)稱取一定量蕨麻干粉，置于微波提取設備中，加入40倍(m/v)蒸餾水，攪拌、混勻；在頻率915MHz、功率300W、溫度為55'C條件下提取45分鐘，在壓力0.06MPa的條件下過濾，濾液在壓力0.07MPa、溫度為55'C條件下減壓濃縮至原體積的1/9，在濃縮液中加入乙醇(乙醇含量占加入乙醇后溶液總體積的80%)，室溫下靜置36小時后在5000轉/分鐘的轉速下離心，收集下層沉淀物在溫度-6(TC、壓力13Pa的條件下冷凍干燥30小時，得物質A;2)稱取一定量物質A，用9倍重量的蒸餾水溶解，后加入10pg/ml木瓜蛋白酶液，酶液與A液的比例為1:100(v/v)，在40。C下酶解12小時，再用正丁醇和氯仿混合液(1:2，v/v)萃取5次，收集上層水溶液，在溫度40。C、壓力0.08MPa條件下減壓濃縮至原水溶液體積的1/12，放入截留分子量60008000Da的透析袋中，流水透析24小時，再用蒸餾水透析18小時。將透析袋內液體在溫度5(TC、壓力0.06MPa條件下減壓濃縮至原水溶液體積的1/12，加入乙醇(乙醇含量占加入乙醇后溶液總體積的80%)，靜置IO小時，在4000轉/分鐘的轉速下離心，收集沉淀物在溫度-5(TC、壓力13Pa的條件下冷凍干燥30小時，得純化的蕨麻多糖。純化多糖的得率為12.18%,經苯酚-硫酸法檢測其總糖含量為80.6%。權利要求1、一種超聲波提取抗輻射氧化蕨麻多糖的方法，其特征是該方法的步驟為1)稱取一定量蕨麻干粉，置于超聲波提取設備中，加入20～50倍(m/v)蒸餾水，攪拌、混勻；在超聲波功率為100～180W、溫度為40℃～70℃下提取30～120分鐘，在0.06～0.08MPa壓力條件下過濾，濾液在壓力0.06～0.08MPa、溫度為55℃～65℃下減壓濃縮至原體積的1/9～1/3，在濃縮液中加入乙醇，所述的乙醇含量占加入乙醇后溶液總體積的70～80％，室溫下靜置24～36小時后在4000～5000轉/分鐘的轉速下離心，收集下層沉淀物，并在-60～-50℃、1～13Pa的條件下冷凍干燥24～30小時，得物質A；2)稱取一定量物質A，用6～9倍重量的蒸餾水溶解，后加入10μg/ml木瓜蛋白酶液，酶液與A液的體積比為1∶100，在溫度40～50℃下酶解10～12小時，再用正丁醇和氯仿體積比為1∶2～4的混合液，萃取3～5次，收集上層水溶液，在溫度40～50℃、壓力0.06～0.08MPa條件下，減壓濃縮至原水溶液體積的1/10～1/12，放入截留分子量6000～8000Da的透析袋中，流水透析20～24小時，再用蒸餾水透析18～36小時，將透析袋內液體在溫度40～50℃、壓力0.06～0.08MPa條件下減壓濃縮至原水溶液體積的1/10～1/12，加入乙醇，所述的乙醇含量占加入乙醇后溶液總體積的70～80％，靜置10～14小時，在4000～5000轉/分鐘的轉速下離心，收集沉淀物在溫度-60～-50℃、壓力1～13Pa條件下冷凍干燥30～36小時，得純化的蕨麻多糖。2、一種蕨麻多糖在制備具有修復X-射線引發的自由基氧化損傷功能的天然制品或保健食品中的應用。全文摘要本發明提供了一種超聲波提取抗輻射氧化蕨麻多糖的方法，它以蕨麻為原料，經超聲波提取30～120分鐘，在0.06～0.08MPa壓力條件下過濾，濾液在壓力0.06～0.08MPa、溫度55℃～65℃下減壓濃縮，乙醇沉淀、離心，收集下層沉淀物，冷凍干燥，再經木瓜蛋白酶酶解，正丁醇和氯仿混合液萃取，減壓濃縮，透析后，得到天然蕨麻多糖，其無毒副作用，對X射線輻射引起的自由基所造成的體內氧化損傷有較好的修復作用。經3.5GyX射線照射小鼠的抗氧化能力實驗表明7天服用該制劑使輻射損傷動物的SOD活性升高66.7％；T-AOC活力上升54.6％，CAT活力上升105.7％，MDA含量下降63.2％。文檔編號C08B37/00GK101619108SQ200910117419公開日2010年1月6日申請日期2009年8月8日優先權日2009年8月8日發明者吳依茜,健姚,繼張,楊云云,梁俊玉,王俊龍,王小芳,趙保堂,趙美榮,郭紅云,馬君義申請人:西北師范大學