低聚鳳梨參糖胺聚糖及其制備方法

專利名稱：低聚鳳梨參糖胺聚糖及其制備方法
技術領域：
本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及一種低聚鳳梨參糖胺聚糖及其制備方法、含有該低聚鳳梨參糖胺聚糖的藥用組合物及其在血栓性疾病的預防和/或治療中的用途。本發明是基于本申請人2009年11月6日提交的名稱為“低聚巖藻糖化糖胺聚糖及其制備方法”、申請號為200910110114.0的發明專利申請的進一步發明，所述專利申請的全文以參考文獻的形式結合于本發明說明書。

背景技術：
巖藻糖化糖胺聚糖(Fucose-branched Glycosaminoglycan，fucose-containingglycos-aminoglycan或Fucosylated Glycosaminoglycan，FGAG)或稱巖藻糖化硫酸軟骨素(Fucose-branched Chondroitin Sulfate，FCS)是指一類從棘皮動物體壁或內臟中提取獲得的帶有硫酸巖藻糖取代基團的特殊的糖胺聚糖(樊繪曾等，藥學學報，1980，18(3)203；Ricardo P.et al.，J.Biol.Chem.，1988，263(34)18176；Yutaka K.et al.，J.Biol.Chem.，1990，2655081)。
現有資料顯示，棘皮動物來源的FGAG在化學組成方面既存在共性也存在差異。首先，不同來源以及不同方法制備的FGAG存在一些共同特點，即，FGAG組成單糖包括N-乙酰氨基半乳糖基(GalNAc，A，所述N-乙酰氨基半乳糖化學名為N-乙酰基-2去氧-2-氨基半乳糖，下文同)、葡萄糖醛酸基(GlcUA，U)、巖藻糖基(Fuc，F)以及它們的硫酸酯(上文樊繪曾，1980；Ricardo P，1988；和Ken-ichiro Y.et al.，Tetrahedron Letters，1992，33(34)4959)；其中，GlcUA和GalNAc(或其硫酸酯)通過β(1-3)及β(1-4)糖苷鍵交互連接形成類似于硫酸軟骨素具有[GlcUA β(1-3)-GalNAc β(1-4)-]二糖重復結構單元的主鏈，而巖藻糖或其硫酸酯以側鏈形式連接于主鏈。
不同來源以及不同方法制備的FGAG存在著不同程度的化學結構差異，例如 (1)單糖組成比例方面的差異。不同種屬海參、不同組織來源乃至不同制備方法所得FGAG的單糖組成都可能存在顯著差異，幾種來源的FGAG單糖組成參見表1。
表1.幾種海參來源的FGAG單糖組成及硫酸酯基
[a]文獻以mmol/g報告(0.81∶0.69∶1.93∶2.99)；[b]文獻以質量百分比(％)報告(16.2∶20.3∶11.66∶23.52)；[c]文獻報告比例為0.46∶0.54∶1.00∶1.10；[d]文獻報告比例為0.33∶0.30∶0.32∶0.88。
不同種屬、組織來源及不同提取方法所得FGAG組成差異主要表現在Fuc及硫酸酯基的組成比例變化較大。根據資料可以判斷，不僅不同物種來源的FGAG存在不同，提取方法的不同也可能導致產物組成的較大差異。例如，Yutaka K等(1990，2002)與樊繪曾等(1980)、Ken-ichiro Y等(1992)同樣從刺參體壁中提取FGAG，前者所得FGAG中巖藻糖摩爾組成比例較后者高2～3倍；而相同研究小組從同種海參(L.grisea)中提取獲得的FGAG在巖藻糖組成比例方面也存在較大變化(Paulo AS等，1987，1988)。組織來源相同而提取方法/時間不同所致FGAG的巖藻糖組成比例差異，其原因可能是巖藻糖組成比例較高的FGAG產物中存在非GAG類的巖藻聚糖污染，也可能是巖藻糖組成比例較低的FGAG產物制備過程中，其側鏈基團存在破壞和損失，此外還可能與含量檢測方法的準確性有關。
(2)主鏈結構方面的差異。如同硫酸軟骨素A、C、D等存在的硫酸酯基位置和數量方面的差異一樣，不同種屬來源的FGAG的主鏈結構中同樣存在硫酸酯基位置和數量方面的差異，例如，資料顯示，刺參FGAG主鏈中GalNAc的4-位和6-位均存在硫酸酯化(Ken-ichiro Y et al.，Tetrahedron Letters，1992，334959)；玉足海參FGAG主鏈GalNAc僅存在6-位硫酸酯化而無4-位硫酸酯化(樊繪曾等，藥學學報，1983，18(3)203)；而L.grisea來源的FGAG主鏈中，約53％的GalNAc為6-硫酸酯，少量為4，6-二硫酸酯(約12％)、4-硫酸酯(約4％)，并且存在約31％未被硫酸酯化的GalNAc(Lubor Borsig et al.J.Biol.Chem.2007，28214984)。
(3)側鏈巖藻糖基及硫酸化程度差異。根據資料，S.Japonicus(刺參)及L.grisea來源的FGAG都存在三種類型的側鏈巖藻糖基，即2，4-二硫酸酯、3，4-二硫酸酯以及4-硫酸酯化的巖藻糖基；后者另含約25％未被硫酸酯化的巖藻糖，這些巖藻糖成束存在于FGAG的還原端(Ken-ichiro Y.et al.，TetrahedronLetters，1992，334959，Paulo AS.et al.，J.Biol.Chem.，1996，27123973)。
如表1所示，刺參、花刺參所得FGAG的硫酸化程度一般較高，而L.grisea、黑海參、糙海參來源的FGAG的硫酸化程度相對較低。
現有資料顯示，棘皮動物來源的FGAG具有多方面的生物學活性。
各種來源的FGAG多具有一定的抗凝血活性(樊繪曾等，藥學學報，1980，15(5)263；張佩文，中國藥理學與毒理學雜志，1988，2(2)98；Paulo AS.et al.，J.Biol.Chem.1996，27123973)；然而，這些天然FGAG也同時具有誘導血小板聚集活性(Jia-zeng L.et al，Thromb Haemos，1988，54(3)435；單春文，中藥藥理與臨床，1989，5(3)33)。
見于報道的FGAG生物學活性還涉及調血脂(His-Hisen L.et al.，J.Agric.Food Chem.，2002，503602)、抗動脈注樣硬化及抑制血管內皮增生(Tapon-Bretaudiere et al.，Thromb.Haemost，2000，84332；Masahiko I.et al.，Atherosclerosis，1997，12927；歐洲專利申請，EP 081 1635)、免疫調節(孫玲等，生物化學與生物物理學進展，1991，18(5)394；陳祖瓊等，天津醫藥，1987，(5)278)、抗腫瘤(胡人杰等，中國腫瘤臨床，1992，19(1)72；李惟敏等，腫瘤臨床，1985，12(2)118)，以及抗病毒(JA.Beutler et al.，Antivir.Chem.Chemother.，1993，4(3)，167；PCT專利申請PCT/JP90/00159)等。
海參來源的FGAG及其衍生物的抗血栓、抗凝血活性及其作用機制、藥理學作用靶點研究資料顯示，FGAG具有不同于肝素、硫酸皮膚素的抗凝機制，其抗凝血/抗血栓作用靶點可涉及 (1)AT-III即存在依賴AT-III的抗凝血酶活性(Paulo AS etal.，J.Biol.Chem.，1996，271，23973；馬西，中華血液學雜志，1990，11(5)241)；(2)HC-II即存在依賴HC-II的抗凝血酶活性(Hideki Nagase et al.，Blood，1995，85，(6)1527；張廣森，中華血液學雜志，1997，18(3)127)；(3)IIa即抑制凝血酶(IIa)反饋激活因子XIII(Nagase H et al.，Biochem.J.，1996，119(1)63-69)；(4)f.Xase抑制內源性因子X酶(因子VIII-IX復合物)對因子X的激活(Hideki Nagase et al.，Blood，1995，85(6)1527；JP Sheehan et al.，Blood，2006，107(10)3876)；(5)TFPI包括提高TFPI對Xa的抑制速率，降低TFPI-Xa對TF-VIIa的抑制活性，并且刺激TFPI釋放(Hideki Nagase et al.，ThrombHaemost，1997，78864；T.Bretaudiere et al.，Thromb Haemost，2000，84332)；(6)纖溶酶促進纖溶酶原的激活并由此促進血栓溶解(楊曉光等，中國醫學科學院學報，1990，12(3)，187；Yutaka Kariya et al.，Biochem.J.，2002，132335)。
盡管海參FGAG獨特的抗凝血機制及其良好的抗凝活性強度使之具有重要的潛在應用價值，但迄今FGAG難以應用于臨床，究其原因主要在于 (1)海參FGAG兼具抗凝血以及誘導血小板聚集的活性。臨床上，抗凝血的目的在于抗血栓形成，而抗血小板則是臨床常規使用的另一種重要的抗血栓形成的方法。顯然，對于血栓形成而言，FGAG的抗血栓的抗凝活性與其促血栓的血小板激活效應相互對立，使其難以應用于臨床血液學疾病的預防和治療。例如，研究表明，在兔急性彌漫性血管內模型中，刺參FGAG的血小板激活效應完全抵消了其抗凝血療效作用(李安國，湖南中醫學院學報，1991，11(3)37)。
(2)藥效劑量的刺參FGAG的活體動物血管內給藥可致血小板計數減少(李家增等，中國藥理學報，1985，6(2)107)。血小板減少，例如肝素所致免疫性血小板減少癥，既可能引發出血傾向，也可能引發嚴重乃至致命的彌漫型血管內凝血。現有資料顯示，海參FGAG所致血小板減少可能與其誘導血小板聚集，并由此導致血小板在微血管內的“扣押”有關(李家增等，中藥通報，1983，8(5)35)。
(3)一般認為，廣泛的藥理學作用靶點與抗凝藥物的出血傾向副作用密切相關，選擇性作用靶點已成為新型抗凝血藥物研發的重要評價指標(KABauer，Hematology，2006，(1)450)。海參FGAG具有與已知的其它類型抗凝血藥物不同的藥物靶點，但如前文所述，其作用靶點仍然相對廣泛，現有資料已經顯示，抗凝劑量下的FGAG可以產生顯著的出血傾向(Paulo AS et al.，BritishJournal of Haematology，1998，101647)。
天然來源的海參FGAG具有獨特抗凝機制和效價，另一方面則存在限制其應用的缺陷，因此，通過結構修飾以獲得具有相對理想的目標產物已經成為其應用研究的重要內容之一。
目前，FGAG的化學結構修飾方法包括過氧化解聚(歐洲專利公開EP 0408770；Ken-ichiro Y et al.，Tetrahedron Letters，1992，334959)、脫硫酸化或羧基還原(Paulo AS et al.，Thrombosis Research，2001，102167)、部分酸水解(Yutaka Kariya，Biochem.J.，2002，132335；Paulo AS et al.，ThrombosisResearch，2001，102167)等。這些工作已經取得了一些進展。例如，研究發現，刺參FGAG的誘導血小板聚集的活性可隨分子量降低而減弱(樊繪曾等，生物化學雜志，1993，9(2)146)；刺參FGAG的過氧化解聚產物依賴ATIII的抗凝血酶活性也可能有所降低(馬西，中華血液學雜志，1990，11(5)241；PauloAS et al.，J.Biol.Chem.1996，271，23973；Hideki Nagase et al.，Blood，1995，85(6)1527)；對于L.grisea來源的FGAG，分子量的降低對于其HC-II依賴的抗凝血酶活性影響更顯著(RG Pacheco et al.，Blood Coagulation and Fibrinolysis，2000，11563)。
綜合刺參FGAG解聚產物(多被稱為DHG)的研究資料來看，僅僅通過解聚方法以獲得相對理想效價與靶點特征的抗凝活性產物仍然存在困難。例如，資料顯示，刺參FGAG重均分子量低至約9000Da時方可消除其血小板誘導聚集活性(樊繪曾等，生物化學雜志，1993，9(2)146)；另一方面，由于抗凝活性隨分子量降低而減弱(RG Pacheco et al.，Blood Coagulation and Fibrinolysis，2000，11563；樊繪曾等，生物化學雜志，1993，9(2)146)。DHG相關的藥理藥效學研究資料中，早期曾使用約10000Da以下分子量的DHG，但其后十余年的研究中，DHG重均分子量多為12000～15000Da(Hideki Nagase et al.，ThrombHaemost，1997，77(2)399；Kazuhisa M et al.，Kidney International，2003，631548；JP Sheehan et al.，Blood，2006，107(10)3876)。顯然，后者應當為保持必要的抗凝效價所必須，但對于刺參FGAG而言，該分子量范圍對于消除血小板誘導活性以及避免血管內給藥所致血小板減少而言，其安全性顯然存在疑慮，而這種安全性并未能在相關研究資料中得到體現和驗證。
研究已經顯示，水解側鏈巖藻糖以及部分去硫酸化都可以致FGAG抗凝血活性顯著降低乃至消失，羧基還原對抗凝活性影響相對較小，但出血傾向仍然顯著且對血小板活性的影響未知(Paulo AS，J.Biol.Chem.，1996，271，23973；Paulo AS et al.，British J.Haematology，1998，101647；Paulo AS et al.，Thrombosis Research，2001，102167)。
關于海參FGAG化學與生物活性的研究資料主要來自L.grisea以及刺參FGAG，雖有資料介紹鳳梨參糖胺聚糖的提取方法(劉學湘等，南京中醫藥大學學報，2003，19(3)161)，但未見其化學結構分析以及生物學活性方面的研究報道。
綜合現有資料，L.grisea以及刺參FGAG的化學結構方面的差異可表現在硫酸化程度不同，主鏈GalNAc硫酸化類型和程度不同，側鏈巖藻糖類型基本一致，而不同類型側鏈巖藻糖的組成比例不同并致側鏈硫酸化程度不同(Ken-ichiro Y et al.，Tetrahedron Letters，1992，334959；Lubor Borsig et al.J.Biol.Chem.2007，28214984)。根據兩種FGAG相對于肝素和/或低分子肝素的抗凝效價判斷，刺參FGAG的抗凝及抗血栓效價更強(Norihiko S et al.ThrombHaemost，1991，65(4)369；Paulo AS et al.，British J.Haematology，1998，101647)。
然而，上述工作均未能闡明其所得產物的血小板激活效應及其靜脈內給藥對血小板計數的影響，此為限制海參FGAG產物應用價值的最重要的因素；其次，盡管相關資料報告了這些結構修飾產物對某些血液因子(藥理學靶點)的作用效價，但結構修飾與所得產物藥理學作用機制特點的關系并不清晰，因此難以判斷取得良好藥理機制特點的結構修飾程度或范圍。迄今為止，硫酸化位置對于FGAG的活性及作用特征的影響未見報道，盡管改變主鏈和/或側鏈糖基的硫酸化結構類型有可能發現實現更具選擇性藥效學作用特征并由此根據應用價值的新型FGAG，然而，在現有技術條件下，雖然可以對糖胺聚糖的進行非選擇性的硫酸化或去硫酸化處理，但難以進行位置選擇性的硫酸化或脫硫酸化改造。
本發明通過鳳梨參FGAG的化學結構及生物學活性比較研究驚奇發現，FGAG側鏈巖藻糖硫酯化位置或類型對其生物學活性，特別是對血小板誘導聚集活性具有重要影響。由此，不同種屬來源的FGAG可存在顯著的應用價值的差異。此外，本發明人現已發現，不同解聚程度和方法對FGAG通過不同靶點產生的生物學效應強度的影響不同，基于這種差異可以獲得具有特殊靶點選擇性特征進而獲得針對特定疾病治療和/或預防的FGAG衍生物。
本發明首先發現鳳梨參來源的巖藻糖化糖胺聚糖(Fucosylated glycos-aminoglycan from Thelenota ananas，THG)具有特殊的化學結構特征，其側鏈巖藻糖類型不同于已經或部分闡明化學結構的FGAG，例如L.grisea以及刺參FGAG；THG在生物學活性方面同樣具有特殊性，其血小板激活活性遠低于玉足海參及刺參來源的FGAG等。
本發明確證了THG具有抑制內源性因子X酶(f.Xase)以及依賴HC-II的抗凝血酶(f.IIa)活性，首次闡明了THG的解聚程度與所述藥理學作用的活性強度的相關性，在此基礎上，本發明獲得了具有較高的抑制f.Xase/抗IIa活性強度比例(效價比)的THG解聚產物(Depolymerized THG，dTHG)。也就是說，本發明以具有特殊化學及生物活性的THG為起始物，基于解聚與生物學活性之間的相關性規律，制備出一種具有良好抗凝效價并且具有特殊的靶點選擇性特征的dTHG產物，所述dTHG不存在誘導血小板聚集的活性，高劑量及重復給藥情況下不發生血小板數量減少。


發明內容
本發明的一個目的在于提供一種具有特定化學結構和良好抗凝效價的低聚鳳梨參糖胺聚糖，該產品不存在誘導血小板聚集的活性，不會導致血小板數量減少。
本發明的另一個目的是提供制備上述低聚鳳梨參糖胺聚糖的方法。
本發明的再一個目的是提供含有上述低聚鳳梨參糖胺聚糖的藥物組合物及其在制備預防和/或治療血栓性疾病的藥物中的應用。
本發明研究發現，鳳梨參來源的巖藻糖化糖胺聚糖(Glycosaminoglycanfrom Thelenota ananas，THG)除具有一些已知FGAG的共性特點外，如組成單糖包括GalNAc、GlcUA和Fuc等，還具有特殊的化學結構特征，它的側鏈巖藻糖類型、硫酸化程度不同于已經闡明或部分闡明的海參FGAG。例如L.grisea和刺參FGAG均主要包括三種結構類型的側鏈巖藻糖，即巖藻糖-2，4-二硫酸酯基、-3，4-二硫酸酯和-4-硫酸酯基，而THG則主要包括巖藻糖-2，4-二硫酸酯基、-3-硫酸酯和-4-硫酸酯基。與此相一致，本發明確證了THG具有抑制內源性因子X酶(f.Xase)以及依賴HC-II的抗凝血酶(f.IIa)活性，并且發現THG在生物學活性方面也表現出特殊性，例如其血小板激活活性遠低于玉足海參和刺參來源的FGAG。
此外，本發明人通過對THG的化學結構和生物學活性比較研究驚奇發現，FGAG側鏈巖藻糖硫酸酯化位置和類型對其生物學活性尤其是對血小板誘導聚集活性具有重要影響。
基于以上研究，本發明以這種具有特殊化學結構和生物活性的THG為起始物，基于解聚與生物學活性之間的相關性規律，制備出具有良好抗凝效價并且具有特殊的靶點選擇性特征的低聚鳳梨參糖胺聚糖(Depolymerized THG，dTHG)。
根據本發明的一個方面，所述低聚鳳梨參糖胺聚糖(dTHG)是鳳梨參(Thelenota ananas)來源的巖藻糖化糖胺聚糖(THG)的解聚產物，其具有如下式所示的結構
式(I)中-OR為羥基(-OH)、硫酸酯基(-OSO3-)、或為如式(II)所示的硫酸酯化巖藻糖基
式(II)中-OR定義同式(I)。
其中單糖組成包括N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、葡萄糖醛酸(GlcUA)、巖藻糖(Fuc)、或其硫酸酯(以-OSO3-表示)，以摩爾比計，GalNAc∶GlcUA∶Fuc∶-OSO3-的比例約為1∶(1±0.3)∶(1±0.3)∶(3.5±0.5)，dTHG的重均分子量(Mw)為約8000～20000Da。優選的分子量范圍為10000～18000Da，更優選為12000～16000Da。
研究證明，本發明的dTHG具有較高的抗f.Xase/抗f.IIa活性強度比例(效價比)，較高的抗Xase/延長APTT效價比，不存在誘導血小板聚集的活性，并且高劑量及重復給藥情況下不發生血小板數量減少，可以用于預防和/或治療血栓性疾病。
根據本發明的另一方面，提供制備上述低聚鳳梨參糖胺聚糖的方法，主要包括以下步驟 1)提取從鳳梨參體壁提取獲得巖藻糖化糖胺聚糖(THG)； 2)解聚解聚步驟1)所得的THG以獲得低聚巖藻糖化糖胺聚糖(dTHG)； 3)精制收集和純化所需分子量的dTHG，以除去其中的低分子和/或高分子雜質成分。
具體地，步驟1)通常可包括切制/粉碎、酶解、堿解、脫色、分離等步驟。鳳梨參可以是去內臟的鮮品或干品。為達到提高提取得率的目的，所述鳳梨參干品一般需切制成片狀或小塊狀，然后加水浸泡，對于鮮品則可以切制也直接加水粉碎成混懸液，然后對其進行酶解和/或堿處理。
酶解步驟中，一般選擇廣譜蛋白酶，包括動物來源的胃蛋白酶、胰蛋白酶、復合酶或粗酶制劑，植物和/或微生物來源的蛋白酶如木瓜蛋白酶、actinase等。酶解條件如溫度、時間、pH值及酶用量等均根據所用蛋白酶的自身屬性進行選擇確定。
堿解步驟中，可選擇使用氫氧化鉀、氫氧化鈉等強堿，用量一般選擇為使提取液中堿濃度達到約0.5～2N(當量濃度)，反應溫度一般選擇為室溫至70℃，堿處理時間可以為約0.5～3h。
酶解和/或堿處理后的提取液經滅酶和/或中和處理后，通過離心和/或過濾去不溶物，所得上清液可采用或聯合采用低級醇/酮如乙醇、丙酮，或者鉀鹽如醋酸鉀，或者酸性粘多糖沉淀劑如十六烷基吡啶沉淀提取液中的糖胺聚糖，所得沉淀可干燥成粗提物、或不經干燥直接進入下一步處理。所得糖胺聚糖粗提物可選擇進行脫色、分級沉淀、凝膠色譜和/或離子交換色譜純化。本發明優選采用過氧化氫脫色結合乙醇-醋酸鉀分級沉淀法(參見樊繪曾等，藥學學報，1983，18(3)203)獲得相對純凈的鳳梨參巖藻糖化糖胺聚糖，即THG。
本發明中，鳳梨參(Thelenota ananas)來源的巖藻糖化糖胺聚糖(THG)具有一些已知巖藻糖化糖胺聚糖的共性特點，例如，其組成單糖包括乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、葡萄糖醛酸(GlcUA)、巖藻糖(Fuc)等，但其硫酸酯化(以-OSO3-表示)程度與已知的巖藻糖化糖胺聚糖有所不同。以整數(或半數)摩爾比計，THG的組成單糖及硫酸酯基的組成比例GalNAc∶GlcUA∶Fuc∶-OSO3-接近1∶1∶1∶3.5，進一步地，約為1∶(1±0.3)∶(1±0.3)∶(3.5±0.5)。
步驟2)中，THG的解聚方法可選擇過氧化氫解聚法，或者由第IV周期過渡金屬離子催化的過氧化物解聚法。本發明優選使用后者，該方法在本申請人于2009年11月6日提交的名稱為“低聚巖藻糖化糖胺聚糖及其制備方法”、申請號為200910110114.0的發明專利申請中有詳細描述，它是在水相介質中采用含有第四周期過渡金屬離子的催化劑，催化過氧化物解聚反應，獲得低聚鳳梨參巖藻糖化糖胺聚糖。具體地，該方法包括以下步驟 2.1)在第四周期過渡金屬離子的催化劑存在下，在水相介質中，加入過氧化物以解聚海參來源的巖藻糖化糖胺聚糖(THG)； 2.2)中止反應，收集所需分子量范圍的低聚巖藻糖化糖胺聚糖(dTHG)。
其中，解聚反應在水相介質中進行，過氧化物可以在反應體系中產生自由基，通過自由基鏈式反應裂解THG，形成dTHG產物。所述過氧化物包括但不限于過氧乙酸、過氧化氫、3-氯-過苯甲酸、氫過氧化枯烯、過硫酸鈉、過氧化苯甲酰以及它們的鹽或酯，優選為過氧化氫。
所述THG在反應體系中的質量分數約為0.05％-15％，過氧化物在反應體系中的質量分數約為0.5％至約30％。FGAG的解聚反應過程中，過氧化物反應物可以在反應前一次性全部加入到反應體系中，也可以采用持續或斷續性方式將過氧化物反應物逐步加入到反應體系中。本發明優選將過氧化物反應物按照可控速率的方式持續加入到反應體系中。
所述作為催化劑的金屬離子為第四周期過渡金屬離子，包括Cu+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Cr3+、Cr2O72-、Mn2+、Zn2+、Ni2+等，這些金屬離子可以單獨使用，也可以相互組合作為復合催化劑使用。其中，優選的催化劑為Cu+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+，最優選為Cu2+。由于金屬離子并非獨立存在的化學試劑，實際使用的是這些金屬離子的無機或有機鹽。在反應體系中，所述金屬離子的濃度范圍可以為約1nmol/L～0.1mol/L，優選的濃度范圍為10μmol/L～10mmol/L。
所述解聚反應過程的常規工藝參數為溫度范圍為10℃～75℃；反應時間為20分鐘～8小時；反應可以在常壓或加壓條件下進行；可以選擇氮氣、惰性氣體保護下進行，也可以在常壓條件下與大氣環境相通進行。
反應結束時，可選擇地向反應體系中加入螯合劑使之與金屬離子催化劑螯合而抑制催化反應速度，繼而通過冷卻、有機溶劑沉淀等技術手段終止反應。螯合劑是指能與金屬離子形成螯合物的物質，其包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、3-丙二胺四乙酸(PDTA)、三乙酸基氨(NTA)或它們的鹽。本發明方法優選乙二胺四乙酸二鈉或其水合物。反應產物沉淀法是直接或在進一步加入無機鹽(如乙酸鉀)的條件下加入有機溶劑使聚糖類物質從反應體系中析出的方法，所述有機溶劑包括甲醇、乙醇、丙酮等低碳醇/酮，其中優選為乙醇和丙酮。
上述方法可以顯著改善過氧化物解聚巖藻糖化糖胺聚糖的反應條件，即采用相同過氧化物反應物和原型FGAG起始物制備相同或近似相等分子量的dFG時，在溫度等反應條件近似的情況下，相對于直接過氧化物解聚法(即沒有金屬離子催化劑存在下的過氧化物解聚方法)，該方法可以提高反應速度，縮短反應時程；類似地，在控制反應時間的條件下，該方法可以顯著降低反應所需溫度，以至可以在室溫條件下完成所需反應。
在dTHG的重復制備過程中，在保持反應條件相同或近似的條件下，與直接氧化物解聚法相比，該方法所得產物的批次間差異顯著降低，所得低聚產物的分子量與目標分子量的差異小于5％，可以顯著改善dTHG制備的重復性和可控性，并且低聚產物具有更好的質量均一性。這可能與催化劑所致活化能降低進而形成相對穩定的反應速率有關，也可能與反應溫度降低或反應時程縮短等溫和反應條件及其反應條件的可控性和穩定性改善有關。
此外，為了進一步提高和改善解聚反應的可控性，還可選擇地向金屬離子催化的過氧化物解聚反應體系中加入一定濃度的無機和/或有機鹽。所述無機和/或有機鹽包括金屬元素(如堿金屬、堿土金屬元素等)與鹵素、有機酸等形成的鹽，有機酸或無機酸與有機堿形成的鹽，以及它們相互組合的復合鹽，其中優選氯化鈉、氯化鉀、乙酸鈉、三水合乙酸鈉、乙酸鉀。本發明中，用于改善解聚反應速度和反應可控性的無機和/或有機鹽的優選的鹽濃度為約0.1mmol/L至約1.0mol/L。
本發明中，收集的所述dTHG的重均分子量(Mw)約為8000～20000Da，優選的分子量范圍為10000～18000Da，更優選為12000～16000Da。
步驟3)中，收集的dTHG可采用本領域已知的方法純化，以除去低和/或高分子雜質成分。純化方法包括但不限于通過透析法除去低和/或高分子雜質成分、通過離子交換法制備THG鹽，和/或凝膠色譜/陰離子交換色譜層析法純化等步驟。
進一步地，本發明的制備低聚鳳梨參糖胺聚糖的方法可包括步驟 4)干燥步驟3)中獲得的dTHG。干燥方法可選擇減壓真空干燥或冷凍干燥，本發明優選冷凍干燥法干燥。
通過本發明上述方法制備得到的dTHG，其單糖組成及硫酸酯基組成比例可采用本領域內已知的化學顯色法、紅外光譜(IR)法以及核磁共振波譜(NMR)法檢測(張惟杰，糖復合物生化研究技術(第二版)，浙江浙江大學出版社，1999；本申請人的前述發明專利申請CN200910110114.0)。
由于本發明的dTHG存在硫酸酯基及羧基，因此可以與無機離子或有機堿性基團形成藥學上可接受的鹽或酯，其中所述dTHG的藥學上可接受的無機鹽可以是堿金屬和/或堿土金屬鹽，優選為鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。顯然，這些鹽或酯也應包括在本發明范圍之內。
根據本發明的再一方面，提供一種藥用組合物，其包括本發明所述的dTHG或其藥學上可接受的鹽或酯，以及藥學上可接受的賦形劑。所述藥物組合物可制備成口服制劑(包括固體和液體制劑)、注射劑(包括注射液和凍干粉針劑)等各種劑型，然而本發明人已經發現，dTHG口服吸收微弱，而皮下注射等注射途徑給藥則具有良好的生物利用度。因此，本發明的藥物組合物優選制成注射劑，由于dTHG具有良好的水溶性，可以通過本領域內常用的技術方法容易地制備其溶液型制劑和凍干制品。
本發明所述dTHG為強效內源性因子X酶抑制劑，具有良好的抗凝抗血栓活性，因此含有dTHG的上述藥物組合物可以用于預防和/或治療血栓性疾病，例如各種術后抗凝治療、各種動靜脈血栓的預防和治療、血栓相關性的心腦血管疾病的預防和治療等。不同疾病的預防/和或治療的使用方法及劑量應由臨床醫師決定。



圖1圖示THG和dTHG樣品的1H NMR譜圖，其中dTHG-6、dTHG-9譜圖中的水峰被壓制； 圖2圖示dTHG(A)與低聚刺參FGAG(即dSJG，B)的1H-1H COSY譜圖；其中箭頭指示的信號顯示兩種低聚FGAG產物側鏈巖藻糖結構類型的差異A圖為dTHG含有的巖藻糖-3-硫酸酯相關信號，B圖為dSJG含有的巖藻糖-3，4-二硫酸酯相關信號；方框內信號分別為巖藻糖-3-硫酸酯和巖藻糖-3，4-二硫酸酯的相關氫信號；雙圈內信號為巖藻糖-3，4-二硫酸酯的4位氫信號。
圖3圖示THG與刺參FGAG(即SJG)的13C NMR以及DEPT譜圖； 圖4圖示dTHG-6的NMR同核/異核相關譜圖； 圖5圖示不同分子量的dTHG抑制f.Xase活性、依賴HC-II抗IIa活性以及延長APTT時間的效價關系，其中方框限定部分為本發明所述dTHG的分子量范圍； 圖6圖示給藥dTHG與低分子肝素鈉(LMWH)對實驗動物出血時間的影響。

具體實施例方式 通過以下實施例的詳細描述，結合附圖可以進一步理解本發明，所述實施例并不構成對本發明范圍的限制。
實施例1 THG提取、解聚與精制 1.1材料 鳳梨參，又稱梅花參(Thelenota ananas)，市售品，去內臟干燥體壁。
刺參(Stichopus japonicus)，市售品，去內臟干燥體壁。
玉足海參(H.leucospilota)，市售品，去內臟干燥體壁。
木瓜蛋白酶8×105U/g，廣西南寧龐博生物工程有限公司。
陽離子交換樹脂001×7強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，天津南開大學樹脂廠。
KOH、KCOCH3、H2O2、乙醇等試劑均為市售分析純試劑。
1.2提取 取干燥鳳梨參20kg，切片機切制成厚度約1.5mm的薄片，裝入夾層反應罐(300L)中，加入200L水攪拌浸泡。攪拌加入固體氫氧化鈉至濃度為0.5M，60℃堿解反應2h。冷卻，6N鹽酸調pH值為6～7，加入100g木瓜蛋白酶，50℃攪拌反應6小時，升溫至100℃保持10min。冷卻，以6N鹽酸調pH值為2(沉淀蛋白)，2～8℃靜置約4h，離心去沉淀。所得上清液調pH值約為7，加乙醇使其終濃度達70％，靜置、離心，離心沉淀加約30倍量(v/v)水溶解，離心去不溶物，以2M NaOH調pH值約10，加H2O2至終濃度約3％(v/v)，50℃攪拌反應2h(脫色)。反應液加醋酸鉀使其最終濃度為0.5mol/L，并加入乙醇使其終濃度達30％，靜置、離心，離心沉淀加20倍量(v/w)水溶解，離心去不溶物，加醋酸鉀使其終濃度為2.5mol/L，靜置、離心，離心沉淀乙醇洗滌2遍，減壓去殘留乙醇，水溶冷凍干燥，即得鳳梨參糖胺聚糖(THG)約162g。
作為參比，同上述條件對2kg刺參和玉足海參進行提取，分別得到刺參FGAG(SJG)20.2g和玉足海參FGAG(HLG)15.6g。
1.3解聚與精制 取上述方法制備的THG 50g，加入1825ml含有122g三水合乙酸鈉和60g氯化鈉的水中，加入120ml濃度為0.0668mol/L的乙酸銅溶液，攪拌混勻。35℃水浴攪拌條件下，在約2小時的時程內以126ml/h速率滴加10％(v/v)的H2O2。整個過程中控制反應pH值為7.2～7.8。上述條件下連續攪拌反應約5小時，其反應過程中，分別于反應起始后的0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5及5.0小時的時間點分取反應液約180ml。
被分取的每份反應液均在其取出后立即加入0.5g Na2EDTA，用15％乙酸調節pH值為6.5～7.0，然后加入反應液2.5倍體積(約450ml)的乙醇，靜置，離心得沉淀。沉淀以100ml水溶，再次醇沉(250ml 95％乙醇)，離心所得沉淀以50ml乙醇洗滌兩遍，減壓揮干乙醇，以約30倍量(v/w)水溶解、0.45μm膜抽濾，濾液過Na+型陽離子交換樹脂柱

收集流出液，以截留分子量3500Da的透析膜透析6小時，透析截留溶液冷凍干燥得到對應于各解聚時間點的解聚產物dTHG-1～dTHG-10，各時間點對應的產量在約3.0～3.5g范圍內，產物總量為33.2g。
作為參比，分別取10g SJG和10g HLG，同上述解聚條件進行操作，分取解聚反應液的時間點設定為2個，即反應起始后的3h和5h。所得解聚產物記為dSJG-1，dSJG-2和dHLG-1，dHLG-2，得到dSJG總量為7.5g，dHLG總量為8.0g。
1.3dTHG、dSJG和dHLG的理化性質檢測與比較 樣品THG，dTHG-1～dTHG-10 參比樣品SJG，dSJG-1～dSJG-3；HLG，dHLG-1～dHLG-4 分子量檢測HPGPC-LALLS法 旋光度檢測中國藥典(2005版)二部附錄VIE方法。WZZ-1S型自動旋光儀，鈉光源(λ589.3nm)，樣品管1dm。
特性黏度檢測中國藥典(2005版)二部附錄VI G第三法。
單糖組成檢測乙酰氨基半乳糖(GalNAc)Elson-Morgon法(張惟杰，糖復合物生化研究技術(第二版)，浙江浙江大學出版社，1999，19-20)； 葡萄糖醛酸(GlcUA)咔唑法； 巖藻糖(Fuc)根據實施例2所述1H NMR甲基峰積分面積計算GalNAc/Fuc摩爾比； 硫酸根(-OSO3-)電導率法檢測羧酸/硫酸摩爾比(張惟杰，糖復合物生化研究技術(第二版)，浙江浙江大學出版社，1999，409-410)，以此作為GlcUA/-OSO3-組成比。
結果見表2。
表2.各種樣品的化學組成和理化性質

從表2的結果可見，dTHG、dSJG、dHLG及其原型多糖THG、SJG、HLG中GalNAc∶GlcUA∶Fuc的摩爾比均接近1∶1∶1，而硫酸酯基含量則有所不同，其中SJG/dSJG含量較高，HLG/dHLG含量較低；此外，三種來源的FGAG的旋光度范圍和特性黏度也有較大差異。
對于THG/dTHG而言，其單糖組成比例在同批次海參原料制備的產物中變化較小，而不同批次原料制備的THG和/或dTHG產物中，上述單糖比例的變化范圍有所增寬，總體上，其GalNAc∶GlcUA∶Fuc∶-OSO3-摩爾比通常仍處于1∶(1±0.3)∶(1±0.3)∶(3.5±0.5)范圍內。
上述結果還可見，在過渡金屬離子催化的過氧化物解聚法所得產物中，巖藻糖與硫酸根含量比例變化較小，并且經1H-1H COSY檢測分析可知其產物的還原性末端主要為GalNAc，這與本申請人的前述發明專利申請CN200910110114.0中的結果基本一致。
實施例2THG/dTHG波譜分析 檢測樣品THG，dTHG-6，dTHG-9，來源同實施例1。
參比樣品SJG，SJG-1，來源同實施例1。
檢測譜圖1H NMR；1H-1H COSY；1H-1H TOCSY；1H-1H NOESY；13C-NMR；DEPT-135°；1H-13C HSQC；1H-13C HMBC。
檢測條件溶劑，D2O，99.9Atom％D(Norell公司)；內標，trimethylsilyl-propionic acid(TSP-d4)；溫度，45℃。
儀器，AVANCEAV 400超導核磁共振譜儀(瑞士Bruker公司400MHz)。
譜圖見圖1～圖4。
結果分析 (1)THG與dTHG的譜圖比較 圖1顯示THG、dTHG-6、dTHG-9的1H NMR譜圖，其中dTHG-6、dTHG-9譜圖中的水峰被壓制。從圖1可見，THG、dTHG-6和dTHG-9三者信號特征基本一致，僅分子量較低時，信號更為清晰，可見THG解聚前后的NMR信號特征保持穩定，表明除聚合度降低外，THG解聚前后的基本化學結構未發生顯著變化。
(2)THG、SJG譜圖比較 參見圖2～圖4，圖2顯示dTHG(A)與dSJG(B)的1H-1H COSY譜圖；其中箭頭指示的信號顯示兩種低聚FGAG產物側鏈巖藻糖結構類型的差異A圖為dTHG含有的巖藻糖-3-硫酸酯相關信號，B圖為dSJG含有的巖藻糖-3，4-二硫酸酯相關信號；方框內信號分別為巖藻糖-3-硫酸酯和巖藻糖-3，4-二硫酸酯的相關氫信號；雙圈內信號為巖藻糖-3，4-二硫酸酯的4位氫信號。圖3顯示THG與SJG的13C NMR和DEPT譜圖。圖4顯示dTHG-6的NMR同核/異核相關譜圖。
綜合圖譜數據可見，THG和SJG的主鏈結構基本近似，兩者的顯著差別在于如圖2所示，dSJG的3，4-二硫酸巖藻糖的強信號在THG譜圖中很微弱或者不存在；而后者歸屬為3-硫酸巖藻糖的信號在SJG譜圖中未出現，說明兩者在側鏈取代基類型方面存在顯著差異。
參見圖3，其中6-位有和無硫酸酯基取代的GalNAc的碳信號分別出現在約70ppm和約64ppm位置，因GalNAc的6-位碳屬于仲碳，其在DEPT135°譜圖中的信號峰為倒峰。從圖3可知，THG主鏈中仍有少量(低于約10％)6位羥基未被硫酸酯基取代的GalNAc，而SJG主鏈中基本不存在6位無硫酸酯基取代的GalNAc。這進一步證明了THG和SJG的側鏈取代基類型存在差異。
此外，從現有文獻資料可知，本發明的THG與其他已知的海參FGAG的側鏈取代基也存在差異，例如資料(Paulo AS et al.，J.Biol.Chem.1996，27123973；Lubor Borsig et al.，J.Biol.Chem.2007，282，14984)及其所附13C NMR圖譜顯示，L.grisea來源的FGAG中約35％的GalNAc沒有6-位硫酸酯基取代；資料(樊繪曾等，藥學學報，1983，18(3)203)顯示，玉足海參FGAG主鏈GalNAc僅存在6-位硫酸酯化而無4-位硫酸酯化。
綜上所述，本發明的THG存在有異于已知結構的其他種屬來源的FGAG的化學結構，其首先表現在側鏈巖藻糖取代基結構類型的不同，即主要含有巖藻糖-2，4-二硫酸酯基、-3-硫酸酯和-4-硫酸酯基，而不含或少含巖藻糖-3，4-二硫酸酯；其主鏈結構與其他種屬來源的FGAG也有不同程度的差別。
(3)dTHG-6NMR譜圖數據歸屬譜圖歸屬見表3，幾種相關譜圖見圖4。
表3.THG-61H/13C-NMR譜圖數據及歸屬

上表中GalNAc4S6S表示4，6-二硫酸-N-乙酰氨基半乳糖基；GalNAc4S表示4-硫酸-N-乙酰氨基半乳糖基；Fuc-2S4S表示2，4-二硫酸巖藻糖基；Fuc-3S表示3-硫酸巖藻糖基；Fuc-4S表示4-硫酸巖藻糖基；Fuc-0S表示無硫酸酯基的巖藻糖基。括號[]表示其中的數據因信號過度重疊而難以確認。
實施例3 THG/dTHG生物學活性檢測 3.1血小板誘導活性檢測 樣品dTHG-1～dTHG-10，來源同實施例1 參比樣品dSJG-1～dSJG-4，來源同實施例1 方法新西蘭白兔，腹主動脈取血，3.8％枸櫞酸鈉抗凝(1∶9)，200×g離心8min得富血小板血漿(PRP)，1500×g離心10min得貧血小板血漿。PRP血小板計數約4.0×105/mm3。Bron法(Born GVR.Nature，1962，194927)血小板聚集儀檢測樣品對血小板聚集的影響。試驗以生理鹽水作空白對照，樣品終濃度為200μg/ml，重復試驗三次，計算血小板最大聚集率均值。
結果見表4。
表4.不同FGAG誘導血小板聚集活性比較
通過比較上述鳳梨參、刺參、玉足海參來源的FGAG及其不同程度的解聚產物的血小板誘導活性，可以發現，對于原型FGAG而言，THG誘導血小板聚集的活性遠低于SJG和HLG，說明不同種屬來源的FGAG結構差異對其血小板活性具有顯著影響。鑒于THG與SJG、HLG的結構差異主要表現在側鏈硫酸化巖藻糖基的類型的不同，由此推測其血小板活性差異應歸因于巖藻糖側鏈的不同，THG的側鏈巖藻糖基類型/特征有效削弱了其血小板凝聚的活性。從分子量方面看，THG重均分子量低至約20000Da時，dTHG的血小板誘導活性業已消失，而SJG、HLG分子量需要在其分子量低至約9,000～12,000Da時，方可避免高濃度下的血小板激活效應，此與文獻(樊繪曾等，生物化學雜志，1993，9(2)146)結果基本一致，這表明dTHG比原型THG具有更好的應用價值。
3.2抗凝血活性體外檢測 樣品dTHG-1～dTHG-10，來源同實施例1 參比樣品dSJG-1～dSJG-4，來源同實施例1 低分子肝素鈉(LMWH)3500～5500Da，0.4ml×4000AxaIU，Anofi-Aventis(法國)。
試劑凝血酶(IIa)123NIH U/mg，sigma公司(美國)。
凝血酶檢測生色底物(S)25mg/vial，HYPHEN BioMed(法國)。
肝素輔因子II(HC-II)100μg/vial，HYPHEN BioMed(法國)。
因子VIII(f.VIII)200IU/支，綠十字(中國)生物制品有限公司。
f.VIII檢測試劑盒試劑包括ReagentsR1Human Factor X；R2ActiveationReagent，human Factor IXa，containing human thrombin，calcium and syntheticphospholipids；R3SXa-11，Chomogenic substrate，specific for Factor Xa；R4Tris-BSA Buffer；HYPHEN BioMed(法國)。
兔貧血小板血漿，廣州蕊特生物科技有限公司。
APTT測定試劑盒(鞣花酸)，上海太陽生物技術有限公司。
儀器酶標儀，Bio-Rad 680(美國)；BICO-雙信道血凝儀，Minivolt公司(意大利)。
方法 (1)抑制內源性因子X酶(f.Xase，Tenase)活性檢測采用f.VIII檢測試劑盒結合f.VIII試劑建立的檢測方法。系列濃度的THG、dTHG、SJG、LMWH溶液或空白對照溶液(Tris-BSA緩沖液R4)30μl與1.0IU/ml因子VIII(30μl)混合后，順次加入試劑盒試劑R1(30μl)、R2(30μl)，37℃孵育1min后，加R3(30μl)，37℃孵育1min，以20％乙酸(60μl)中止反應并檢測OD405nm。根據空白對照(R4)計算ΔOD，按文獻(Sheehan J.P.& Walke E.K.，Blood，2006，1073876-3882)中提供的公式計算各樣品抑制f.Xase的IC50值。
(2)HC-II依賴的抗凝血酶活性檢測系列濃度的THG、dTHG、SJG、LMWH溶液或空白對照溶液(Tris緩沖液)50μl加入96孔酶標板后，加入50μl1μmol/L的HC-II，混合，37℃孵育2min，然后加入50μl 5U/ml的IIa，37℃孵育2min，加入50μl 2mmol/L的CS-0138，混合，37℃孵育1min，以50％乙酸(100μl)中止反應并檢測OD405nm。根據空白對照(R4)計算ΔOD，按文獻(Sheehan J.P.& Walke E.K.，Blood，2006，1073876-3882)中提供的公式計算各樣品抑制IIa的IC50值。
(3)延長APTT時間的活性檢測系列濃度的THG、dTHG、SJG、LMWH溶液或空白對照溶液(Tris緩沖液)10μl混入180μl兔血漿，然后按試劑盒說明書的方法測各個樣品的APTT時間，根據各樣品檢測結果計算倍增APTT時間(使APTT時間延長一倍)的藥物濃度。
結果見表5和圖5。
表5.THG/dTHG以及參比樣品的抗凝血活性
[1]抗f.Xase-抗IIa效價比抗IIa IC50(μg/ml)/抗f.Xase IC50(μg/ml) [2]抗f.Xase-延長APTT效價比倍增APTT的藥物濃度(μg/ml)/抗f.Xase IC50(μg/ml) 文獻資料(GZ.Feuerstein，et al.，Arterioscler Thromb Vasc Biol.，1999，192554；CJ.Refino，et al.，Arterioscler Thromb Vasc Biol.，2002，22517)顯示，f.IXa抑制劑可以在基本上不影響血液APTT以及出血時間的劑量下顯著抑制血栓形成，并且抗凝藥物的出血傾向與其抗凝血酶活性存在相關性。此外，低分子肝素的臨床實踐已經證實，隨著抗Xa/抗IIa效價比提高，其出血傾向得到顯著降低(G.Andriuoli et al.Heamostasis，1985，15324)。基于以上認識以及dTHG分子量與其作用于不同凝血因子靶點的效價強度的相關性，適當解聚的THG有可能在消除FGAG誘導血小板聚集活性的同時，可以產生盡可能高的抗f.Xase與HC-II依賴的抗IIa活性的效價比，和/或盡可能高的抗f.Xase與延長APTT活性的效價比。
表5的結果顯示，THG和/或dTHG具有延長APTT時間、抑制內源性f.Xase以及依賴HC-II的抗凝血酶活性，解聚THG可以消除其血小板誘導活性，但解聚程度對其抗f.Xase、抗IIa(依賴HC-II)及其延長APTT活性的影響不同。
首先，dTHG的分子量(Mw)低至約20000Da時其血小板誘導活性完全消失，而Mw低至約6000Da時仍存在抗凝活性(延長APTT時間)。顯然，該分子量范圍內的dTHG較可能較原型THG具有更好的應用價值。
其次，THG與dTHG均具有強效抑制內源性f.Xase的活性。在本發明實施例3.2所述系統條件下，對于重均分子量約8000～70000Da的dTHG(或THG)，其抑制f.Xase的IC50值一般低于約0.1μmol/L(低于約1μg/ml)，且總體上呈現活性隨分子量升高而增強的趨勢，但在不同分子量范圍內，這種趨勢具有較大差異。當分子量低于約12000Da時，dTHG抑制f.Xase的活性可隨分子量降低而顯著減弱；而當分子量不低于約12000Da時，其IC50值均處于約0.2μg/ml～0.3μg/ml的范圍內，以摩爾濃度計，其IC50值可隨分子量升高而略呈降低趨勢；但以質量濃度計，其IC50值基本不隨分子量變化而變化，或者更準確地說，是隨分子量升高反而略有升高。總體上，對于dTHG(或THG)f.Xase而言，當分子量不低于約10000Da時，其抑制內源性因子X酶的活性可在一定程度上保持相對恒定。
表5的結果還顯示，THG/dTHG具有HC-II抗凝血酶活性以及其延長APTT時間的活性。對于重均分子量為約8000～70000Da的dTHG(或THG)，其依賴HC-II抗凝血酶活性以及其延長APTT的活性均隨分子量升高而增強，這表現在其依賴HC-II抗凝血酶活性的IC50值以及其倍增APTT時間的藥物濃度均隨分子量的對數值升高而呈線性降低。
綜合本發明上述發現可以判斷，當dTHG的重均分子量達到約10000Da，特別是約12000Da以上時，分子量大小對dTHG延長APTT和以及依賴HCII的抗凝血酶活性的影響遠大于對抑制內源性f.Xase活性的影響。為方便敘述，表5定義了“抗f.Xase-抗IIa效價比”和“抗f.Xase-延長APTT效價比”以體現不同分子量THG/dTHG抗凝血活性特點。總體上，對于重均分子量不低于10000Da的dTHG而言，分子量越低，其抑制f.Xase活性與其依賴HC-II抗凝血酶活性或延長APTT時間活性的效價比越高。當分子量更低時(低于約10000Da)，該效價比則可呈現降低趨勢。
表5的結果還表明，LMWH具有相對較弱的抗f.Xase活性，而對于dSJG而言，血小板誘導活性限制了活性較強和/或“效價比”較高的產物的應用。本發明以(1)消除血小板誘導活性、(2)獲得盡可能高的抗Xase/抗IIa效價比、和/或(3)獲得盡可能高的抗Xase/延長APTT效價比為依據，綜合衡量dTHG分子量與其抑制f.Xase活性、依賴HC-II的抗凝血酶活性、延長APTT時間活性以及血小板影響活性的關系，本發明選擇的dTHG重均分子量(Mw)范圍可以為約8000～20000Da，優選的分子量范圍為約10000～18000Da，更優選的分子量范圍為約12000～16000Da。
3.3dTHG抗在體靜脈血栓形成 樣品dTHG-6，來源見實施例1；低分子肝素鈉(LMWH)3500～5500Da，0.4ml×4000AxaIU，Anofi-Aventis 方法 (1)兔靜脈血栓形成雄性新西蘭白兔，戊巴比妥(30mg/kg iv)麻醉，分離左右雙側頸靜脈，分別于2cm區段放置兩個結扎縫線，靜脈注射重組人組織因子1ng/kg，5min后結扎靜脈近心端和遠心端，15min后縱向切開血管取出血栓，濾紙洗干殘血，稱量血栓濕重。受試藥物(dTHG-6、LMWH)及對照溶劑(生理鹽水，NS)均于靜脈結扎前2小時皮下注射給藥。
(2)出血時間檢測SD大鼠，戊巴比妥(30mg/kg ip)麻醉，靜脈注射dTHG-6或LMWH 15sec后斷尾(距尾端5mm)，每隔15sec以濾紙小心吸取斷尾處出血印跡。連續1min不出現出血印跡時即判斷為已經止血。
結果 (1)兔靜脈血栓形成在結扎和高粘血狀態下的靜脈血栓模型中，皮下注射dTHG-64.5、9、18mg/kg可以顯著抑制血栓形成，抑制率范圍為約35％至約70％，其抑制活性呈現明顯的量效關系(表6)。本試驗中，LMWH 720IU/kg對靜脈血栓形成的抑制率約56％。
表6.THG對頸靜脈血栓形成的影響
與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01 (2)出血時間檢測皮下注射dTHG-6或LMWH對大鼠出血時間的影響檢測結果見圖6。試驗結果表明，相對于LMWH，在近似的抗凝抗血栓藥效劑量下，dTHG-6對出血時間的影響更低。
權利要求
1.一種低聚鳳梨參糖胺聚糖及其藥學上可接受的鹽，其特征在于，所述低聚鳳梨參糖胺聚糖是來源于鳳梨參(Thelenota ananas)的巖藻糖化糖胺聚糖的解聚產物，其重均分子量為8000～20000Da，其單糖組成包括N-乙酰氨基半乳糖、葡萄糖醛酸、巖藻糖以及它們的硫酸酯，以摩爾比計，N-乙酰氨基半乳糖∶葡萄糖醛酸∶巖藻糖∶以-OSO3-表示的硫酸酯基的比例為1∶(1±0.3)∶(1±0.3)∶(3.5±0.5)。
2.如權利要求1所述的低聚鳳梨參糖胺聚糖及其藥學上可接受的鹽，其特征在于，所述單糖組成中，其巖藻糖硫酸酯基包括3-硫酸-巖藻糖基。
3.如權利要求1所述的低聚鳳梨參糖胺聚糖及其藥學上可接受的鹽，其特征在于，所述低聚鳳梨參糖胺聚糖的重均分子量為10000～18000Da。
4.一種制備權利要求1所述低聚鳳梨參糖胺聚糖及其藥學上可接受的鹽的方法，其中所述低聚鳳梨參糖胺聚糖的制備包括步驟
1)從鳳梨參體壁提取獲得巖藻糖化糖胺聚糖；
2)利用過氧化物解聚步驟1)所得的巖藻糖化糖胺聚糖，以獲得低聚巖藻糖化糖胺聚糖；
3)收集和純化所需分子量范圍的低聚巖藻糖化糖胺聚糖。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，在催化劑存在下，于水相介質中催化過氧化物解聚鳳梨參巖藻糖化糖胺聚糖獲得低聚巖藻糖化糖胺聚糖，所述催化劑為含有選自元素周期表第四周期過渡金屬離子的催化劑。
6.如權利要求5所述的方法，其中所述含選自元素周期表第四周期過渡金屬離子的催化劑為Cu+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Cr3+、Cr2O72-、Mn2+、Zn2+、Ni2+形成的無機鹽或有機鹽，或其組合。
7.一種藥物組合物，含有權利要求1至3任一項所述的低聚鳳梨參糖胺聚糖或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的賦形劑。
8.如權利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥學上可接受的鹽為鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。
9.如權利要求7或8所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物制備成注射用凍干粉針劑。
10.如權利要求7或8所述的藥物組合物在用于制備預防和/或治療抗血栓藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種低聚鳳梨參糖胺聚糖(dTHG)，其重均分子量為約8000～20000Da，單糖組成為乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、葡萄糖醛酸(GlcUA)、巖藻糖(Fuc)、或其硫酸酯(-OSO3-表示)，GalNAc∶GlcUA∶Fuc∶-OSO3-的摩爾比例約為1∶(1±0.3)∶(1±0.3)∶(3.5±0.5)。所述dTHG為強效內源性因子X酶抑制劑，具有良好的抗凝抗血栓活性，可用于預防和/或治療血栓性疾病。本發明還提供制備所述dTGH的方法，包括步驟1)從鳳梨參體壁提取獲得巖藻糖化糖胺聚糖(THG)；2)采用過氧化物法或第四周期過渡金屬離子催化劑催化下的過氧化物法解聚THG以獲得dTHG；3)除去dTHG中的低分子和/或高分子雜質成分。
文檔編號C08B37/00GK101724086SQ20091010986
公開日2010年6月9日 申請日期2009年11月25日 優先權日2009年11月25日
發明者趙金華, 康暉, 吳明一, 曾偉珍, 李姿, 高媛, 崔靖, 王志國, 馮漢林, 于琳 申請人:深圳海王藥業有限公司